2. 新疆农业大学, 乌鲁木齐 830052
2. Xinjiang Agricultural University, Wulumuqi 830052, China
甲烷的温室效应是二氧化碳(CO2)的20～30倍，对全球气候变暖的影响占到了15%～20%[ 1,2 ]。反刍动物排出的甲烷是瘤胃发酵能量损失的途径之一，也是导致环境温室效应的重要因素。在全球家畜的甲烷排放量中，反刍动物占97%[ 3 ]。赵一广等[ 4 ]研究表明，在肉羊生产中，通常有8%左右的总能转变为甲烷能。因此，降低反刍动物甲烷排放量，对减缓气候变暖和高效利用饲粮具有重要意义。桑叶黄酮(mulberry leaf flavonoids，MLF)或桑叶提取物具有抗氧化、抑制脂质氧化及抑制真菌的功效。MLF是一种黄酮类化合物，分子中有1个酮式羰基，第1位上的氧原子为碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多为黄色，故又称黄碱素或黄酮。郭建军等[ 5 ]研究表明，用桑叶饲喂育肥牛，能促进牛对饲粮的消化吸收，提高饲料报酬，增加生长速度，在精料中添加10%的桑叶粉，能显著提高育肥牛生长速度，提高养殖效益。动物体内外试验均证明，黄酮类物质具有提高动物的免疫机能，促进动物的繁殖、生长等功能[ 6 ]。就MLF影响动物气体代谢的研究尚未见报道。白藜芦醇(resveratrol，Res)主要存在于葡萄、虎杖、花生等植物中，是一种具有重要生理活性的非黄酮类多酚化合物，其化学结构中含有多个苯环和羟基，Res具有抗血栓、降血脂、抗氧化、抗自由基、抗炎等多种生物功效。关于其对动物气体代谢的影响未见报道，目前就Res具有减少甲烷的报道只限于体外试验。Becker等[ 7 ]应用体外法研究儿茶素、Res对瘤胃发酵的影响，结果表明，儿茶素和Res均可减少甲烷的产生。虽然天然植物提取物在抑制甲烷方面取得了一些研究进展，但从研究方法上大都是通过体外培养法，没有对瘤胃甲烷排放量进行实测，由于体外培养法与瘤胃内环境存在一定差别，并不能真实反映其实际值，因此本试验采用饲喂天然植物提取物，通过Sable开路式循环测热系统对肉羊瘤胃甲烷排放量进行测定。MLF和Res都属于天然植物提取物，具有抗氧化性、抗菌、抗病毒、抑制血小板凝集和缓解心脑血管疾病等功能，是否具有减少甲烷排放量的功能尚未见报道，本试验旨在探究这2种天然植物提取物在减少甲烷排放量中的作用，并确定最佳添加水平，为实际应用提供依据。
1 材料与方法试验于2013年3月1日至2013年4月15日在中国农业科学院中试基地开展。
1.1 试验材料与仪器天然植物提取物：MLF(纯度5%，桑叶中提取)、Res(纯度98%，虎杖中提取)购于西安飞达生物技术有限公司。气体代谢仪器：美国Sable开路式循环测热系统，购于美国Sable公司。
1.2 试验动物与饲粮试验选取15只体重为(60.00±1.73) kg、年龄相近、体况良好的杜泊绵羊( )×小尾寒羊(♀)杂交F1代肉用成年母羊，试验前打好耳号，免疫注射三联四防疫苗并驱虫，每只羊单独圈养于羊栏(3.2 m×0.8 m)中。基础饲粮为全混合颗粒料(饲料颗粒直径8 mm，长10 mm)，预混料由北京精准动物营养研究中心提供。基础饲粮组成及营养水平见表1。
1.3 试验设计与饲养管理试验采用单因素试验设计，包括对照期以及试验期Ⅰ和Ⅱ。对照期：15只羊均饲喂基础饲粮(0添加水平，对照组，n=15)；试验期Ⅰ：将15只羊分为5组(n=3)，MLF添加水平分别为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 g/d；试验期Ⅱ：将15只羊分为5组(n=3)，Res添加水平分别为0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 g/d。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
根据NRC(2007)《绵羊饲养标准》中的维持需要，试验羊采用限饲的方法(1 500 g/d)，每天08:00饲喂，将天然植物提取物充分搅拌于颗粒料中饲喂对应的羊只(提取物只在早晨饲喂)，每只羊每天中午补饲羊草200 g，自由饮水。
每期试验16 d，其中预试期7 d，正试期9 d。正试期采用Sable开路式循环呼吸测热系统对15只羊进行气体代谢试验，每2 d测定3只羊的甲烷排放量(包括呼吸道和消化道以及体表排出的甲烷)。羊只进入和离开呼吸测热系统时均称重，平均体重作为气体代谢体重。
1.4 气体代谢试验试验采用美国Sable开路式循环测热系统，该系统连接3个气体代谢室，可以同时测定3只羊的气体交换量。将羊只饲养于代谢室内，每个代谢室内配有料槽和水槽，保证自由采食和饮水。呼吸测热系统可以同时测定羊只的甲烷排放量、氧气(O2)消耗量、CO2排放量。
羊只进入气体代谢室先适应24 h，随后测定24 h的甲烷排放量、O2消耗量、CO2排放量。其中，O2浓度通过燃料电池型O2测定仪FC-10(Sable，美国)测定；甲烷和CO2浓度则分别由红外型测定仪MA-10和CA-10(Sable，美国)测定。系统首先测定环境空气中的某气体浓度，然后依次测定3个气体代谢室中的该气体浓度，最后再次测定空气中的该气体浓度。以2次环境空气中的甲烷浓度的平均值为基底值，气体代谢室内甲烷浓度与该基底值之差值即为羊只该气体的排放量或消耗量。每次环境空气测定时间为2 min，环境向气体代谢室的置换测定时间为1 min，然后进行单个气体代谢室的测定时间为24 min(每个气体代谢室测定时间为8 min)，最后气体代谢室向环境置换测定时间1 min，再测定环境空气2 min，因此30 min完成全部3个气体代谢室的气体交换量的测定。以此循环往复连续测定24 h，将所有循环计算结果累加即得羊只每天气体排放量或消耗量。计算过程由Sable开路式循环测热系统的测定程序及对应的宏文件于计算机统计分析生成。
1.5 数据处理与分析试验数据用Excel进行初步整理，再用SAS 9.1统计软件中的GLM进行单因素方差分析，若差异显著则用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05作为差异显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 MLF添加水平对气体代谢及甲烷排放的影响由表2可知，体重在60 kg左右(或代谢体重在21 kg左右)的肉羊，O2消耗量在487.10~543.46 L/d，CO2排放量在493.33~541.75 L/d，呼吸熵在0.99~1.03，甲烷排放量在51.27~61.44 L/d。与对照组相比添加0.25~4.00 g/d的MLF对代谢体重基础的O2消耗量和CO2排放量以及呼吸熵的影响均不显著(P>0.05)。添加MLF具有减少甲烷排放量的趋势，0.50 g/d的添加水平可以使甲烷排放量减少9.88 L/d，2.00 g/d的添加水平可以使每千克干物质采食量的甲烷排放量减少2.77 L/kg DMI，0.50 g/d的添加水平显著降低了代谢体重基础的甲烷排放量(P＜0.05)。
结果表明，MLF可一定程度上减少甲烷和CO2排放量。代谢体重基础上每千克干物质采食量的甲烷排放量在2.00 g/d的添加水平抑制甲烷排放效果最佳。
2.2 Res添加水平对气体代谢及甲烷排放的影响由表3可知，体重在60 kg左右(或代谢体重在21 kg左右)的肉羊，O2消耗量、CO2排放量以及呼吸熵处于一个正常的范围，肉羊的甲烷排放量在55.04~61.54 L/d。添加0.125~2.000 g/d的Res对肉羊代谢体重基础的O2消耗量、CO2排放量以及呼吸熵均产生了显著的影响(P＜0.05)，添加水平为1.000 g/d时，代谢体重基础的O2消耗量、CO2排放量显著低于对照组(P＜0.05)。添加Res可以减少甲烷排放量，0.250 g/d的添加水平可以使甲烷排放量减少6.11 L/d，且每千克干物质采食量的甲烷排放量、代谢体重基础的甲烷排放量、代谢体重基础上每千克干物质采食量的甲烷排放量均显著低于对照组(P＜0.05)。
结果表明，添加Res能够显著减少甲烷和CO2排放量。代谢体重基础上每千克干物质采食量的甲烷排放量在0.250 g/d的添加水平抑制甲烷排放效果最佳。
3 讨 论在瘤胃中，产甲烷菌合成甲烷的过程主要包括3种途径：1)CO2-氢气(H2)还原途径，CO2在一系列酶和辅酶的催化作用下，与甲基呋喃化合，经过一系列反应，被H2还原生成甲烷，在甲烷杆菌体内主要是通过这种方式产生甲烷；2)以甲酸、乙酸和丁酸等挥发性脂肪酸为底物的合成途径；3)以甲醇、乙醇等甲基化合物为底物的合成途径。当前的研究重点是通过对瘤胃产甲烷菌生成甲烷的过程进行调控，通常对甲烷产生的调控机理主要有以下3种模式:第1种是生物学调控，即直接抑制产甲烷菌的生长，减少产甲烷菌的数量，从而减少甲烷的产生；第2种是通过减少生成甲烷的底物——H2的生成量或通过替代性H2受体争夺H2而减少甲烷排放量；第3种是通过特异性抑制产甲烷菌合成甲烷途径中的某些酶活性而抑制甲烷的生成。
| 表2 MLF添加水平对气体代谢及甲烷排放的影响 Table 2 Effects of MLF supplemental level on gas metabolism and CH4 emission |
研究表明，天然植物提取物降低甲烷生成机制主要包括影响纤维降解[ 8 ]、促进丙酸生成[ 9 ]、抑制纤毛虫增殖[ 10 ]。MLF具有抑制甲烷作用的研究未见报道，但作为天然植物提取物与其他天然植物提取物有着共同的特点，本试验得出MLF有降低瘤胃甲烷排放量的趋势，可能存在以下原因：1)黄酮类物质具有增加食糜的通过率和过瘤胃的营养物质含量，从而减少甲烷的产生功效。2)影响了瘤胃发酵类型，使乙酸型发酵转变为丙酸型发酵。在瘤胃发酵过程中，生成乙酸的同时会产生大量的H2和CO2，产甲烷菌利用此时的H2与CO2生成甲烷，当发酵类型转变为丙酸发酵时，H2的利用率增强，竞争了产甲烷菌的甲烷生成底物，从而减少甲烷排放量。Patra等[ 11 ]在体外产气试验中发现，添加提取物大蒜素后总挥发性脂肪酸和丙酸浓度显著升高，乙酸浓度显著降低，乙酸与丙酸比值降低，甲烷排放量减少。3)直接作用于瘤胃微生物，抑制了某些菌的活性或者抑制了甲烷生成过程中的某些辅酶的活性。Fukui等[ 12 ]研究表明，黄酮类化合物对金黄葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等均有抑制作用。高昕等[ 13 ]研究表明，苦参异戊二烯黄烷酮衍生物对革兰氏阳性菌具有显著的抗菌作用。部分研究表明，天然植物提取物也能够直接抑制瘤胃产甲烷菌，但其效果并不明确[ 14 ]。在CO2还原生成甲烷的过程中，Dimarco等[ 15 ]证明有甲基呋喃(MFR)、四氢甲基蝶呤(H4MPT)、辅酶F420、辅酶M(HS-CoM)、辅酶F430、辅因子B(HS-HTP)等参与反应。MLF可能抑制了产甲烷菌或者辅酶的活性，阻断了甲烷生成过程中的电子传递，导致甲烷排放量减少。
本试验结果还可以看出，试验羊只的CO2与甲烷排放量具有相同趋势，这表明，MLF对整个气 体代谢都产生一定的影响，减少了碳的排放。作为天然植物提取物对气体代谢有影响，也将影响物质代谢，但这还有待于进一步研究。
| 表3 Res添加水平对气体代谢及甲烷的影响 Table 3 Effects of Res supplemental level on gas metabolism and CH4 emission |
Becker等[ 7 ]研究植物天然抗氧化剂Res和邻二酮对甲烷排放量的影响时发现，体外试验得到的结果为添加Res可以减少甲烷排放量。Evans等[ 16 ]和García-González等[ 17 ]的试验均表明，在反刍动物饲粮中添加天然植物提取物有降低甲烷排放量的趋势。本试验中Res的添加显著减少了甲烷的排放量，同时影响了碳的排放，可能是由于它提高食糜的流通速率，改变瘤胃发酵类型，使乙酸型发酵转变为丙酸型发酵。Res属于多酚类物质，酚类物质中的羟基能与酶的活性中心形成氢键，因此具有较高的抗菌作用[ 18,19,20 ]，尽管其单个组分的化学结构不同，其准确的抗菌作用机制也略有不同[ 21 ]。Stiles等[ 22 ]研究表明，香芹酚和百里香酚化学结构相似，但羟基在苯环上的位置不同，膜穿孔和膜黏合被认为是首要作用模式，导致细菌细胞膜渗透性提高及胞内生命物质外泄，从而损害细菌酶系统，导致微生物死亡，从这个角度分析，Res可能减少了瘤胃产甲烷菌或抑制了其活性，导致甲烷排放量减少，也可能减少了瘤胃中与产甲烷菌兼性共生的纤毛虫，从而减少甲烷。Res具有多种生物功效，是一种益生物质，有利于动物机体的健康，可以促进生长发育，本试验发现它对甲烷排放量的显著减少作用，使得其功能进一步得到发掘，但就其机理需要进一步的研究。
3.3 天然植物提取物减少甲烷排放的作用天然植物提取物作为反刍动物瘤胃甲烷抑制剂已成为国内外研究热点，Busquet等[ 23 ]在体外产气试验中，分别添加300 mg/L大蒜素、二烯丙基二硫化物(DAD)、烯丙硫醇(ALM)，甲烷排放量分别降低了73.6%、68.5%、19.5%。Patra等[ 11 ]体外法研究表明，丁香、大蒜、茴香的甲醇提取物以及丁香、大蒜的乙醇提取物可以抑制甲烷的产生。Hart等[ 24 ]报道体外试验中添加20 μg/mL大蒜油，显著抑制了甲烷生成。Animut等[ 25 ]发现，往西班牙羯羊饲粮中添加富含单宁的胡枝子，可以直接影响产甲烷菌活性，从而降低甲烷排放量。王新峰[ 26 ]研究发现，绞股蓝皂苷对山羊瘤胃产甲烷菌有抑制作用。王小晶等[ 27 ]在研究青蒿提取物和大黄对瘤胃发酵和甲烷排放量的影响时发现，添加5 g/kg青蒿提取物和70 g/kg大黄可以替代15 mg/kg莫能菌素用以控制瘤胃发酵过程中甲烷排放量，并改善瘤胃发酵。
近年来研究表明，某些天然植物提取物或次生代谢产物，如酚类物质和黄芪的可溶物，可以抑制瘤胃产琥珀酸丝状杆菌增殖[ 28 ]。产琥珀酸丝状杆菌是反刍动物瘤胃中的主要纤维素降解菌，它的发酵产物是乙酸和琥珀酸，而产甲烷菌可以利用乙酸合成甲烷。本试验采用的2种提取物就结果进行分析，MLF具有黄酮的结构特点，而Res则属于非黄酮结构，它们分别含有羰基和羟基等活性官能团，这些官能团具有影响瘤胃产琥珀酸丝状杆菌的作用，可以推导出具有降低甲烷排放量的作用原理。关于天然植物提取物抑制甲烷排放量的报道，主要集中于它们的结构和功能。体外试验的结果表明，甲烷排放量可以减少20%~50%，本试验用肉羊做试验的结果表明，添加MLF和Res使代谢体重基础上每千克干物质采食量的甲烷排放量的甲烷排放量分别减少了6.38%、10.11%。但其体内外的区别需要开展进一步的研究。
本试验的2种天然植物提取物一方面具有正面生物学功能，有利于动物的健康；另一方面，也证明对碳排放有降低的作用，这对天然植物提取物的利用提供了理论依据。
4 结 论① 天然植物提取物MLF和Res可以在一定程度上影响肉羊的气体代谢并降低甲烷排放量。
② 本试验条件下，MLF和Res抑制甲烷排放效果最佳的添加水平分别为2.00、0.250 g/d。
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