硒(Se)是动物体必需的微量元素，在维护动物健康方面发挥着重要作用，但过量的硒会对机体产生毒害作用，因此硒在动物饲料中最适添加量的研究得到了广泛开展^{[ 1,2,3 ]}。鱼类饲料中硒的营养学研究表明，饲料中过高或过低的硒含量均会影响鱼类健康^{[ 4,5 ]}。硒对动物健康的调节可能是通过硒蛋白进行的，在哺乳动物中发现了大量不同类型的硒蛋白，如谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、硒蛋白P等^{[ 6 ]}。GPx是生物机体内重要的抗氧化酶之一,它的活性中心含有1个硒代半胱氨酸(Sec),可以清除机体内的活性氧类(reactive oxygen species,ROS),阻断其对机体的进一步损伤,与体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)一起构成了机体的抗氧化防御体系^{[ 7 ]}。

在自然界中，硒以无机硒和有机硒2种形式存在，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒则主要为硒蛋白和硒多糖。对于哺乳动物的研究发现，有机硒较无机硒毒性小，吸收率高^{[ 8 ]}，在鱼类营养学研究中也有类似报道^{[ 9,10 ]}。富硒酵母菌中有机硒含量较高，是一种比较理想的硒添加剂^{[ 11 ]}。若将富硒酵母菌与乳酸菌等其他益生菌并用，则有可能具有有机硒和益生菌的双重作用，这在哺乳动物硒的营养学研究中已有相关的报道^{[ 12,13 ]}。

罗非鱼(Oreochromis niloticus)是联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖鱼类之一，我国养殖罗非鱼产量居世界首位，而有关罗非鱼饲料中富硒益生菌的适宜添加量以及其作用效果的研究尚未见报道。本试验拟通过在饲料中添加不同水平的富硒益生菌，研究其对罗非鱼幼鱼生长以及抗氧化水平的影响，并采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测其对肝脏谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)mRNA相对表达量的影响，以探讨罗非鱼幼鱼饲料中富硒益生菌的最适添加量，为富硒益生菌在罗非鱼幼鱼饲料中的应用提供依据。

富硒益生菌由富硒酵母菌[由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和亚硒酸钠生物转化而成，硒含量为85 mg/kg，活菌数为10⁹ CFU/g]、酵母菌(具体添加物为Saccharomyces cerevisiae，活菌数为10⁹ CFU/g)、乳酸菌[具体添加物为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，活菌数为10⁶ CFU/g]组成，由本实验室研制生产。Trizol购自Invitrogen公司，Prime Script^TM 1st Stand cDNA Synthesis Kit、rTaq酶、TdT酶、pMD18-T载体、SYBR Green Premix购自TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen公司，TOP10工程菌为本实验室保存，GPx、SOD、CAT活性检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

罗非鱼幼鱼基础饲料参考《罗非鱼配合饲料》(SC/T 1025—2004)及饲料厂的经验配方设计，可以满足罗非鱼幼鱼生长发育的需要。基础饲料以鱼粉、菜籽粕、豆粕为蛋白质源，膨化大豆中的豆油为脂肪源，并添加多维和矿物元素配制而成。所有饲料原料粉碎后过40目筛，混匀后加水经挤条机挤压成直径为3.0 mm的颗粒饲料，自然晾干后，4 ℃密封保存。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 鱼粉 Fish meal 4.950 菜籽粕 Rapeseed meal 36.000 豆粕 Soybean meal 30.000 面粉 Flour 16.372 米糠 Rice bran 8.000 谷朊粉 Wheat gluten 0.149 膨化大豆 Expanded soybean 1.782 鱼溶浆蛋白粉 Fish soluble protein powder 0.099 α-淀粉 α-starch 2.376 氯化胆碱 Choline chloride 0.050 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 0.079 预混料 Premix1) 0.139 L-抗坏血酸-2-磷酸酯 L-ascorbyl-2-monophosphate 0.004 合计 Total 100.000 营养水平 Nutrient levels2) 粗蛋白质 CP 33.320 硒 Se/(mg/kg) 0.257 1)每千克预混料中含有Contained the following per kg of premix：VA 22 100 IU，VD3 4 400 IU，VE 162.13 mg，VK3 12.65 mg，VB1 48.05 mg，VB6 40.30 mg，VB12 0.20 mg，VB2 58.21 mg，VC 138.61 mg，生物素 biotin 0.41 mg，肌醇 inositol 472.79 mg，叶酸 folic acid 15.50 mg，烟酰胺 nicotinamide 142.50 mg，D-泛酸钙 D-calcium pantothenate 89.91 mg，Cu (as copper sulfate) 11.77 mg，Mn (as manganese sulfate) 48.64 mg，Zn (as zinc sulfate) 68.65 mg，I (as potassium iodide) 2.35 mg，Co (as cobaltous sulfate) 1.96 mg，K (as potassium chloride) 666.87 mg，Mg (as magnesium sulfate) 841.03 mg，Fe (as ferrous sulfate) 164.75 mg，P 1.95 mg，Ca 1.26 mg。 2)粗蛋白质为计算值，硒为测定值。CP was a calculated value,while Se was a measured value.

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

以基础饲料作为对照组饲料，在基础饲料中添加由富硒酵母菌、酵母菌和乳酸菌以不同比例组成的富硒益生菌，配制4种试验饲料。4种试验饲料中富硒酵母菌添加量折算为硒添加量分别为0(A组)、0.4(B组)、0.6(C组)、0.8 mg/kg(D组)，乳酸菌的添加量均为3.04×10⁵ CFU/g，并通过添加酵母菌使4种试验饲料中添加的总活菌数相同，具体试验设计见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验设计 Table 2 Experimental design 组别 Groups 添加量 Supplemental level/(CFU/g) 乳酸菌 Lactic acid bacteria 酵母菌 Yeast 富硒酵母菌 Selenium-enriched yeast A 3.04×105 3.81×107 B 3.04×105 1.90×107 1.91×107 C 3.04×105 0.95×107 2.86×107 D 3.04×105 3.81×107

表2 试验设计 Table 2 Experimental design

试验用鱼为新吉富罗非鱼，鱼体的平均体重为(12.40±0.13) g，购于广东省罗非鱼良种场，待暂养7 d稳定后开始试验，试验时间为70 d。将试验鱼随机分为5组，即1个对照组，4个试验组(A组、B组、C组和D组)。每组3个重复，每个重复40尾，以重复为单位饲养于1.0 m×0.6 m×0.8 m的网箱中，网箱以组为单位置于2 m×2 m×1 m的室外水泥池内，总水体量为3.5 m³。每日上午和下午各投喂1次，饱饲量投喂。试验期内隔日每池换水1/10，用电加热棒加温，保持水温在25 ℃左右，24 h气泵充气。

分别于试验的第30、40、50、60、70天，从每个网箱随机取4尾鱼，每组共12尾鱼，按常规操作采集鱼的血清和肝脏。血清在-30 ℃下保存，肝脏组织在液氮中保存。分别于试验的第1、50、60、70天对各网箱的40、32、28、24尾试验鱼称重。所有样品或数据均以每个网箱为单位混样检测或计算均值，按每组3个重复进行统计。

测定不同阶段试验鱼的特定生长率，其计算公式如下：

将在-30 ℃下冻存的血清样品4 ℃解冻，使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，按说明书测定血清GPx、SOD和CAT活性。

将在液氮中保存的肝脏组织取出后加液氮研磨，采用Trizol提取肝脏总RNA，按照Prime Script^TM 1st Stand cDNA Synthesis Kit推荐方法，以罗非鱼肝脏总RNA为模板，合成cDNA第1链，使用博日Line-Gene K荧光定量PCR仪，按照本课题组已建立的GPx1 RT-qPCR方法^{[ 14,15 ]}检测各组罗非鱼肝脏GPx1 mRNA的相对表达量。GPx1上游引物为5′-AGAAGTTCCTGGTTGGTCCT-3′，下游引物为5′-GATCTGAAAGCATGGCATATT-3′，反应程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，55.5 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40个循环，扩增长度为209 bp，扩增效率为104%，可信度R²=0.99；以β-肌动蛋白(β-actin)为参考基因设计引物，其上游引物为5′-CAGTGCCCATCTACGAG-3′，下游引物为5′-TGTGGTGGTGAAGGAGT-3′，反应程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，57.8 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40个循环，扩增长度为126 bp，扩增效率为109%,可信度R²=0.99。使用2^-△△Ct法计算GPx1 mRNA的相对表达量。

试验结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，以分析组间差异显著性，以P<0.05为差异显著。

由表3可知，在试验的第1～50天阶段，各组罗非鱼的特定生长率无显著差异(P>0.05)；在试验的第50～60天阶段，各添加硒组(B组、C组、D组)罗非鱼的特定生长率均高于未添加硒和益生菌的对照组以及仅添加益生菌的A组，其中D组显著高于对照组、A组、C组(P<0.05)；在试验的第60～70天阶段，罗非鱼的特定生长率表现为A组、B组、C组均显著高于对照组和D组(P<0.05)，其中以C组的值最高。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 罗非鱼的特定生长率 Table 3 Specific growth rate of tilapia %/d 组别 Groups 试验时间 Experimental time 第1~50天 Days 1 to 50 第50~60天 Days 50 to 60 第60~70天 Days 60 to 70 对照 Control 0.051±0.003 0.94±0.04a 0.79±0.09a A 0.050±0.002 0.84±0.16a 1.35±0.21bc B 0.049±0.001 1.03±0.10ab 1.11±0.19b C 0.051±0.002 0.96±0.13a 1.47±0.03c D 0.049±0.002 1.22±0.10b 0.68±0.07a 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Values in the same column with different small letter superscripts are significantly different (P<0.05). The same as below.

表3 罗非鱼的特定生长率 Table 3 Specific growth rate of tilapia %/d

由表4可知，在试验第30天，对照组、C组、D组显著高于A组、B组(P<0.05)。相较于试验第30天，对照组、A组、B组、C组在试验第40天均上升，而D组则几乎没有变化；在试验第40天，D组显著低于其他各组(P<0.05)。相较于试验第40天，各组在试验第50天均下降，其中A组降幅最大；在试验第50天，对照组、B组、C组显著高于A组、D组(P<0.05)。相较于试验第50天，A组、B组、D组在试验第60天上升，对照组和C组下降；在试验第60天，对照组显著低于其他各组(P<0.05)。相较于试验第60天，对照组在试验第70天上升，其余各组均下降，且C组、D组降幅较大；在试验第70天，C组、D组显著低于其他各组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 罗非鱼血清GPx活性检测结果 Table 4 Measured results of GPx activity in serum of tilapia U/mL 组别 Groups 试验时间 Experimental time 第30天 Day 30 第40天 Day 40 第50天 Day 50 第60天 Day 60 第70天 Day 70 对照 Control 542.37±70.15b 698.31±33.08b 613.56±7.77b 376.27±46.60a 513.56±86.89b A 442.37±26.91a 669.49±11.74b 450.85±19.25a 667.80±56.24bc 498.31±23.30b B 454.24±41.41a 661.02±31.75b 596.61±46.14b 716.95±17.61cd 516.95±25.08b C 566.10±33.86b 677.97±25.59b 633.90±5.87b 601.70±61.51b 396.61±33.34a D 547.46±23.49b 547.46±7.77a 498.31±43.44a 761.02±36.78d 362.71±12.80a

表4 罗非鱼血清GPx活性检测结果 Table 4 Measured results of GPx activity in serum of tilapia U/mL

由表5可知，在试验第30天，以C组最高、A组最低，各组间均差异显著(P<0.05)。相较于试验第30天，各组在试验第40天均有所降低，且以C组降幅最大；在试验第40天，对照组、B组显著高于A组(P<0.05)。相较于试验第40天，对照组、A组在试验第50天均上升，B组、C组、D组均下降；在试验第50天，对照组显著高于其他各组(P<0.05)。相较于试验第50天，各组在试验第60天均下降，且以对照组降幅最大；在试验第60天，对照组显著低于A组、B组、C组(P<0.05)。相较于试验第60天，对照组、A组、D组在试验第70天升高，B组、C组下降；在试验第70天，A组显著高于B组、C组、D组(P<0.05)，C组显著低于其他各组(P<0.05)。

由表6可知，在试验第30天，C组显著高于对照组(P<0.05)。相较于试验第30天，对照组在试验第40天稍有上升，D组略有下降，其他组几乎无变化；在试验第40天，各组间均无差异显著(P>0.05)。相较于试验第40天，对照组、B组在试验第50天均下降，A组、C组、D组均升高；在试验第50天，对照组显著低于其他各组(P<0.05)，C组显著高于其他各组(P<0.05)。相较于试验第50天，对照组、D组在试验第60天升高，A组、B组、C组降低；在试验第60天，C组显著高于B组(P<0.05)。相较于试验第60天，除D组在试验第70天有所上升外，其他各组均下降；在试验第70天，D组显著高于A组、B组、C组(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 罗非鱼血清CAT活性检测结果 Table 5 Measured results of CAT activity in serum of tilapia U/mL 组别 Groups 试验时间 Experimental time 第30天 Day 30 第40天 Day 40 第50天 Day 50 第60天 Day 60 第70天 Day 70 对照 Control 4.16±0.09d 2.70±0.54b 3.15±0.14c 1.11±0.40a 2.20±0.76bc A 2.59±0.28a 1.75±0.15a 2.00±0.16ab 1.93±0.23c 2.45±0.21c B 3.07±0.25b 2.54±0.49b 2.44±0.32b 1.70±0.36bc 1.61±0.27b C 5.86±0.42e 2.36±0.50ab 1.96±0.25ab 1.69±0.15bc 0.59±0.09a D 3.61±0.16c 2.02±0.18ab 1.57±0.37a 1.34±0.18ab 1.60±0.11b

表5 罗非鱼血清CAT活性检测结果 Table 5 Measured results of CAT activity in serum of tilapia U/mL

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 罗非鱼血清SOD活性检测结果 Table 6 Measured results of SOD activity in serum of tilapia U/mL 组别 Groups 试验时间 Experimental time 第30天 Day 30 第40天 Day 40 第50天 Day 50 第60天 Day 60 第70天 Day 70 对照 Control 37.63±1.79a 40.43±1.63 36.19±0.53a 39.42±2.38ab 38.66±2.31bc A 39.31±0.98ab 38.51±1.92 39.59±1.03b 39.11±1.00ab 31.75±1.40a B 39.55±1.12ab 39.99±1.68 38.51±0.56b 36.71±0.31a 34.06±1.19a C 40.39±0.52b 40.03±1.82 43.48±0.52c 42.07±2.92b 37.73±0.69b D 39.26±0.26ab 37.62±0.62 38.80±0.43b 39.73±0.93ab 41.28±2.84c

表6 罗非鱼血清SOD活性检测结果 Table 6 Measured results of SOD activity in serum of tilapia U/mL

由表7可知，罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量先随饲养天数的延长呈现出上升态势，至试验第50天达到最高值后开始呈下降的趋势。在试验第40天，A组罗非鱼的肝脏GPx1 mRNA相对表达量显著高于B组和D组(P<0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。在试验第50天，各组罗 非鱼的肝脏GPx1 mRNA相对表达量均达到最高，其中C组显著高于其他各组(P<0.05)，A组显著高于对照组、B组和D组(P<0.05)，而对照组、B组和D组间差异不显著(P>0.05)。在其他时间点，罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量各组间均无显著差异(P>0.05)。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量 Table 7 Relative expression level of GPx1 mRNA in liver of tilapia 组别 Groups 试验时间 Experimental time 第30天 Day 30 第40天 Day 40 第50天 Day 50 第60天 Day 60 第70天 Day 70 对照 Control 1.41±1.11 3.04±1.42ab 6.97±3.00a 1.76±0.32 2.10±0.54 A 0.91±0.34 3.81±1.45b 18.52±3.07b 2.24±0.88 1.70±1.85 B 0.48±0.14 1.55±0.32a 7.67±6.76a 1.16±0.36 1.11±0.99 C 0.47±0.11 3.67±1.07ab 41.65±7.03c 2.19±1.11 1.45±0.19 D 0.99±0.74 2.00±0.96a 3.40±0.97a 2.37±1.68 1.44±0.23

表7 罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量 Table 7 Relative expression level of GPx1 mRNA in liver of tilapia

适量添加硒对鱼类生长、抗氧化以及免疫功能都有促进作用^{[ 10 ]}。华雪铭等^{[ 16 ]}在异育银鲫饲料中添加不同水平的硒酵母后发现其可不同程度地促进异育银鲫的生长，且能显著增强其抗感染能力。秦顺义等^{[ 12 ]}发现，富硒益生菌能够显著增强小鼠机体的免疫功能和抗氧化能力。Hilton等^{[ 1 ]}认为，如果给虹鳟长期喂食硒含量超过3 mg/kg的饲料，会对其产生毒害作用。Hicks等^{[ 17 ]}报道，饲料中添加过量硒会导致虹鳟体重减轻，死亡率增加。本研究表明，饲养期的前50天(第1～50天阶段)各组罗非鱼幼鱼的特定生长率均无显著差异，说明含硒0.257 mg/kg的基础饲料可以满足此阶段罗非鱼幼鱼生长发育的需要。在第50～60天阶段，各添加硒组罗非鱼的特定生长率均高于未添加硒和益生菌的对照组以及仅添加益生菌的A组，且硒添加量为0.8 mg/kg的D组显著高于其他各组。在第60～70天阶段，仅添加益生菌的A组以及硒添加量为0.4 mg/kg的B组和硒添加量为0.6 mg/kg的C组显著高于对照组和D组，其中C组生长最快。这可能是因为罗非鱼幼鱼在饲养期的50 d后处于生长发育快速期，此时含硒0.257 mg/kg的基础饲料不能满足其生长需要，需额外适量添加；而仅添加益生菌有显著的促长效果是由于长期饲喂使得益生菌能够定植于肠道而发挥促进营养吸收的作用。D组在第50～60天阶段表现出良好的生长态势，这可能是因为生长发育旺盛时，机体对硒的需求量增大，减少了硒在肝脏中的积累，从而缓解了硒对肝脏的毒性压力；在第60～70天阶段，D组的生长速度降低，可能是硒的长期摄入超过了机体的需求而堆积于体内产生毒性，从而对生长产生了抑制作用。从整个试验期看，添加0.6 mg/kg富硒益生菌(以硒计)的促生长效果最佳。

好氧生物的生物代谢过程需要氧的参与，这会导致细胞内环境中超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等ROS的累积，如果累积量超过一定的量，则会对细胞产生毒害作用。由SOD、GPx和CAT组成的抗氧化系统来完成快速清除过多ROS是机体存活的关键，SOD催化超氧阴离子(O^-₂)为过氧化氢和二价氧，CAT和GPx将过氧化氢还原为水^{[ 18 ]}。硒能提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性，加强自由基的清除和脂质过氧化物的分解，保护细胞膜结构的完整性^{[ 19 ]}。高宏伟等^{[ 20 ]}报道，獭兔饲喂加硒饲粮后血清GPx活性得到了明显提高，当外加硒达到最适量后，血清GPx活性不再随硒添加量的增加而增加。本文以仅添加益生菌的A组为参照，分别与对照组和各添加硒组比较后发现：A组血清GPx活性在第30天、第50天均低于其他各组，但对照组与及硒添加量为0.6 mg/kg的C组之间差异不显著，说明添加适量的硒可以在一定范围内抵消益生菌引起的血清GPx活性的下降；而当A组在第40天和第60天促进血清GPx活性提高时，添加适量的硒还可以起到协同效果。在第30天，各添加硒组血清CAT活性均较A组高，但随着饲养时间的延长，各添加硒组在第40～70天阶段血清CAT活性降低，说明硒的积累可能影响到血清CAT活性。血清SOD活性在第30天表现为各添加硒组与A组间差异不显著，而硒添加量为0.6 mg/kg的C组在第50天、第70天均较A组显著升高，且在第30天、第50天还显著高于对照组，表明添加适量的硒可以提高血清SOD活性。益生菌在免疫调节中扮演着双重角色，即在增强消化道免疫功能的同时促进口服耐受^{[ 21 ]}。在基础饲料中添加益生菌30 d内血清GPx和CAT活性下降和40 d内血清SOD活性无显著变化，表明益生菌对处于生长早期的罗非鱼的抗氧化水平存在抑制作用，可能是由于外源益生菌口服耐受引起的，而在此期间补充适量的硒能提高鱼体的抗氧化水平。持续饲喂含硒较高的益生菌时，罗非鱼幼鱼血清的GPx活性出现下降，表明硒在体内过量积累会起到抑制抗氧化酶活性的作用。

GPx在人和哺乳动物中主要有4种类型，分别为GPx1、谷胱甘肽过氧化物酶2(GPx2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(GPx3)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)，其生物功能主要是抗氧化。GPx1主要分布在肝脏，其表达与代谢有关；GPx3在鼠血浆中被发现，是血浆中的过氧化物酶，其发挥功能的位点在肾脏^{[ 22 ]}。目前鱼类主要存在GPx1和GPx4^{[ 14 ]}，罗非鱼上仅见关于GPx1的报道^{[ 15 ]}，NCBI预测罗非鱼存在GPx3^{[ 23 ]}。哺乳动物GPx1、硒蛋白W、硒蛋白H和硒蛋白M基因表达量受硒摄入量的显著影响，这使它们成为反映硒营养状态的候选生物标志物^{[ 24 ]}。硒对GPx活性的调控是通过对GPx mRNA的调控来实现的。大鼠饮食中缺硒会造成肝脏组织中GPx mRNA的丰度明显降低^{[ 25 ]}。在动物组织中，GPx1的主要作用是作为“生物硒”缓冲剂^{[ 26 ]}。本试验中，罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量除了试验第40天、第50天外，在整个试验期间，各组均未表现出显著差异。从试验第50天罗非鱼肝脏GPx1 mRNA相对表达量可以看出，仅添加益生菌的A组和硒添加量为0.6 mg/kg的C组显著高于其他各组，说明补充益生菌和含硒适量的富硒益生菌均有助于肝脏GPx1 mRNA丰度的增加；而硒添加量为0.8 mg/kg的D组比其他组均低，说明过量的硒会抑制肝脏GPx1 mRNA的表达，其原因可能是鱼体摄入和累积过量的硒对肝脏GPx1 mRNA的表达有负反馈调节作用。采用RT-qPCR方法从基因水平检测GPx1 mRNA相对表达量，克服了化学方法检测其活性易受操作及试剂影响而造成误差的不足。本试验中肝脏GPx1 mRNA相对表达量增加与血清中GPx活性关联度不高，是否还与GPx的多态性有关，尚待更深入研究。

① 罗非鱼生长发育早期表现出饲料中硒含量越高生长越快的趋势，但在生长发育后期，应适当减少饲料中硒的添加量，以免因硒长期过量摄入产生毒性而抑制生长。本试验得出，在硒含量为0.257 mg/kg的基础饲料中添加0.6 mg/kg的富硒益生菌(以硒计)时罗非鱼幼鱼(体重12～55 g/尾)的生长性能最佳。

② 在罗非鱼幼鱼期(体重12～55 g/尾)，饲料中添加适量的富硒益生菌表现出对血清抗氧化酶的激活作用，但长期过量添加则可导致抗氧化酶活性下降。

③ 在饲料中添加适量富硒益生菌对罗非鱼幼鱼的肝脏GPx1 mRNA转录有促进作用，并可能存在反馈抑制。