2. 浙江衢州出入境检验检疫局, 衢州 324002
2. Zhejiang Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Quzhou 324002, China
随着饲料工业迅猛发展,水产饲料中最为重要的蛋白质原料鱼粉的需求量持续增加。但由于全球渔业捕捞量持续减少及环境污染等影响,导致鱼粉产量逐年下降,价格飙升,极大地增加了饲料成本,限制了水产养殖业的健康稳定发展[ 1 ]。因此,开发和寻找价格低廉的新型蛋白质原料替代鱼粉成为水产营养饲料学研究的热点。
棉籽粕是一种重要的植物蛋白质原料,其蛋白质含量高且氨基酸组成较为均衡,被认为是潜在能替代鱼粉的原料。但棉籽粕中含有游离棉酚等有毒物质,过量添加可导致水产动物消化率降低,影响动物生长发育和健康状况[ 2,3,4 ]。近年来的研究表明,采用微生物发酵处理棉籽粕,不仅可有效降低其游离棉酚含量,又可以增加原料中低分子质量肽含量和有益微生物数量,从而大大提高了棉籽粕的营养品质[ 5,6 ]。但目前采用发酵棉籽粕替代鱼粉在水产动物养殖中的研究尚未见报道。
黑鲷(black sea bream,Acanthopagrus schlegelii),隶属于鲈形目鲷科鲷属,是在我国东南沿海地区及日本、东南亚等地区广泛分布的重要经济鱼类。其生长速度快、肉质鲜嫩、对环境的适应性强,因而较为适宜人工大规模养殖,具有广阔的市场开发前景[ 7,8 ]。近年来,已有学者开展了植物蛋白质原料(豌豆蛋白质、豆粕等)替代鱼粉在黑鲷鱼应用方面的研究[ 9,10 ]。本试验旨在以黑鲷为研究对象,探索发酵棉籽粕替代饲料中鱼粉对其生长性能、形体指标、体成分和血浆生化指标的影响,以期为发酵棉籽粕在黑鲷饲料配方中的应用提供理论支持。 1 材料与方法 1.1 发酵棉籽粕
试验用棉籽粕购自新疆泰坤集团,其水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙、总磷、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸含量分别为10.30%、46.40%、1.20%、6.10%、0.25%、1.11%、0.57%、2.17%和4.93%;游离棉酚含量为836 mg/kg。参照本实验室已报道文献[ 6 ]方法制备发酵棉籽粕。发酵棉籽粕样品经过烘干、粉碎后,过80目筛,于-20 ℃冰箱保存备用。发酵棉籽粕风干样品经分析测定,其水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙、总磷含量分别为11.5%、50.5%、1.0%、6.9%、0.26%和1.32%;蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸和总必需氨基酸含量分别为0.61%、2.42%、4.72%和21.3%;游离棉酚含量为210 mg/kg。 1.2 试验饲料
以秘鲁红鱼粉为主要蛋白质原料,鱼油和豆油为脂肪源,玉米淀粉为糖源配制基础饲料,基础饲料中鱼粉含量为60%;以0、8%、16%和24%的发酵棉籽粕替代鱼粉,配制4种等氮等能试验饲料,分别饲喂4组试验鱼[命名为FCM0(对照)、FCM8、FCM16和FCM24组],其饲料组成及营养水平见表1。饲料原料过80目粉碎后,按配比精确称重、采用逐级扩大法将各原料混合均匀,用双螺杆挤压机制成直径为1.5 mm的颗粒饲料,于通风处阴干后置-20 ℃冰箱保存备用。
![]() | 表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) % |
饲养试验在舟山西闪岛养殖基地进行。黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所提供。黑鲷幼鱼在室内水泥池中投喂基础饲料驯化7 d后,挑选体格健壮、大小均匀、平均体重(9.20±0.22) g的黑鲷幼鱼400尾,随机分为4组,每组5个重复,每个重复20尾,分配于20个室内塑料水族桶中(实际水容量300 L),记为FCM0、FCM8、FCM16和FCM24组,分别投喂对应的试验饲料。试验正试期为60 d。每天投喂饲料2次(07:00和16:00),以饲料在30~60 min内基本摄食完为宜,并于投喂2 h后,清理粪便1次。每天记录投喂量、鱼死亡情况。全天24 h曝气,自然光照,水温25~30 ℃,pH 7.5~7.9,氨氮含量低于0.05 mg/L,亚硝酸盐含量低于0.06 mg/L,溶氧高于5.0 mg/L。 1.4 样品采集与指标测定
试验开始前,挑选体重与试验用鱼接近的黑鲷幼鱼20尾,置于-20 ℃冰箱保存。试验结束,禁食24 h后,分别统计每个养殖桶内黑鲷的数量;每桶随机挑取5尾鱼,-20 ℃冰箱保存,用于测定体成分(粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分)含量;另取5尾鱼分别测量体重、体长和全长,然后解剖,称量肝脏重;剩余黑鲷采用尾静脉采血后,置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)钾盐抗凝剂的1.5 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min制备血浆样品,于-80 ℃冰箱保存用于血浆生化指标分析。
鱼体和饲料常规成分分析均采用国标方法。水分采用105 ℃烘箱干燥恒重法(GB/T 6435—1986)、粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)、粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6432—1994)、粗灰分含量采用马弗炉550 ℃灼烧法(GB/T 6438—1992)、游离棉酚含量测定采用苯胺比色法(GB 13086—91)。
血浆中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和溶菌酶(lysozyme,LYZ)活性均采用南京建成试剂盒测定,测定方法参照说明书。各种酶活力单位定义如下:ALT和AST活力单位定义为:1 mL血浆在37 ℃条件下与底物作用60 min,生成1 μmol丙酮酸为1个活力单位;SOD活力单位定义为:1 mL血浆在37 ℃条件下,SOD抑制率达到50%时所对应的酶量为1个活力单位;ALP活力单位定义为:100 mL血浆在37 ℃与底物反应15 min产生1 mg酚为1个金氏单位;LYZ活力单位定义为37 ℃、530 nm下,1 min使吸光度值降低0.001为1个活力单位。
1.5 指标计算
试验黑鲷鱼指标计算方法为: 增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(末体重-初始体重)/初始体重; 特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×(ln末体重-ln初始体重)/饲养天数; 饲料系数(feed conversion ratio,FC)=投喂饲料量/(末体重-初始体重); 采食量[feed intake,FI,g/(d·尾)]=投喂饲料量/饲养天数/鱼尾数; 存活率(survival rate,SR,%)=100×末尾数/初始尾数; 蛋白质效率(protein efficiency ratio,PER,%)=100×(末体重-初始体重)/蛋白质摄入量; 蛋白质沉积效率(protein deposition rate,PDR,%)=100×(末体重×末鱼体蛋白质含量-初始体重×初始鱼体蛋白质含量)/蛋白质摄入量; 肥满度(condition factor,CF,g/cm3)=100×体重/体长3; 肝体比(hepatosomatic index,HSI,%)=100×肝脏重/体重。 1.6 数据统计与分析
试验结果以“平均值±标准差”(n=3)表示,采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Tukey氏法多重比较检验。P<0.05表示差异显著。 2 结果与分析 2.1 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼生长性能的影响
由表2可知,采用发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼SR无显著影响(P>0.05),各试验组黑鲷的SR均高于90%,表明试验饲料能满足黑鲷幼鱼的存活要求。与对照组和FCM8组相比,FCM24组试验鱼的WGR和SGR显著降低(P<0.05)。FCM8、FCM16组与对照组相比,各生长性能指标(WGR、SGR、FI、FC、PER和PDR)均未见显著差异(P>0.05)。
![]() | 表2 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of fish meal replacement by fermented cottonseed meal on growth performance of juvenile black sea bream |
由表3可知,与对照组相比,试验组采用发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷的HSI和CF均无显著影响(P>0.05)。同时,FCM8组试验鱼的HSI显著高于FCM24组(P<0.05)。
![]() | 表3 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼形体指标的影响 Table 3 Effects of fish meal replacement by fermented cottonseed meal on physique indices of juvenile black sea bream |
2.3 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼体成分的影响
由表4可知,与对照组相比,FCM24组黑鲷幼鱼鱼体粗灰分含量显著升高(P<0.05),其余试验组(FCM8、FCM16组)黑鲷幼鱼鱼体粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量均无显著变化(P>0.05)。
![]() | 表4 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼体成分的影响(干物质基础) Table 4 Effects of fish meal replacement by fermented cottonseed meal on body composition of juvenile black sea bream (DM basis)% |
由表5可知,与对照组相比,FCM24组黑鲷幼鱼血浆中ALP的活性显著降低(P<0.05),其他试验组(FCM8、FCM16组)血浆生化指标无显著变化(P>0.05)。
![]() | 表5 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼血浆生化指标的影响 Table 5 Effects of fish meal replacement by fermented cottonseed meal on plasma biochemical indices of juvenile black sea bream |
3 讨 论 3.1 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼生长性能的影响
本试验结果表明,8%和16%的发酵棉籽粕替代黑鲷饲料中鱼粉对黑鲷幼鱼的生长性能未产生不利影响,而24%的发酵棉籽粕替代黑鲷饲料中鱼粉则显著降低了黑鲷幼鱼的WGR和SGR等生长性能指标。这与采用棉籽粕替代鱼粉在罗非鱼[ 11 ]和虹鳟鱼[ 12 ]上的研究结果相似,表明发酵棉籽粕在黑鲷幼鱼上的耐受量可达到16%。许多研究表明,发酵豆粕、豌豆蛋白质等植物蛋白质原料均能够在黑鲷幼鱼饲料中部分替代鱼粉蛋白质而不影响鱼体的生长性能,但由于替代蛋白质原料、试验鱼体品质和饲养环境的差异,各替代蛋白质原料替代鱼粉的比例也各不相同[ 9, 10, 13 ]。然而,由于黑鲷是一种典型的肉食性鱼类,对蛋白质和氨基酸的要求较高,虽然可通过营养素平衡,在一定范围内能较好地利用替代性蛋白质源而不影响其生长性能,但适口性[ 14 ]、限制性氨基酸含量以及消化率[ 15 ]等原因,仍可导致替代鱼粉后对黑鲷幼鱼的生长性能带来负面影响。这可能解释了发酵棉籽粕在添加量为24%时导致黑鲷幼鱼生长性能下降。但考虑到添加24%的发酵棉籽粕较对照组相比,并未显著降低黑鲷幼鱼的FI,表明适口性可能不是导致其影响黑鲷幼鱼生长性能的主要原因。由于目前关于发酵棉籽粕替代鱼粉的研究报道较少,因此其对黑鲷幼鱼生长性能影响的机理有待进一步研究。 3.2 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼形体指标的影响
本试验结果表明,采用发酵棉籽粕部分替代鱼粉对黑鲷幼鱼的形体指标(HSI和CF)未产生显著影响。这与陆阳等[ 16 ]采用膨化豆粕替代虹鳟鱼饲料中鱼粉的结果相似,表明发酵棉籽粕替代饲料中的鱼粉并未对黑鲷幼鱼的肝脏发育产生影响,且其生理状态和营养状况良好,保持了正常的生长效果。 3.3 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼体成分的影响
本研究结果表明,8%和16%的发酵棉籽粕对黑鲷幼鱼体成分无显著影响。与此结果一致,Yue等[ 11 ]采用不同比例的棉籽粕饲喂罗非鱼后发现,体成分含量均无显著变化。但本研究还发现当发酵棉籽粕的添加比例提高至24%时,显著提高了黑鲷幼鱼鱼体粗灰分含量;且棉籽粕添加比例升高时,黑鲷幼鱼的粗灰分含量逐步升高。同样,Takii等[ 17 ]报道红鲷鱼饲喂高比例菜籽粕后,鱼体粗灰分含量显著提高。段培昌等[ 18 ]报道星斑川鲽鱼全鱼粗灰分含量随着鱼粉替代量的增加而增大,并推测鱼体粗灰分含量的提高可能是由于鱼生长性能的下降所引起。黄权等[ 19 ]对黄颡鱼和周晖等[ 20 ]对军曹鱼的研究也同样表明,当鱼体处在营养不良状态下时,鱼体粗灰分含量将显著提高。考虑到随着棉籽粕添加量的提高,特别是当添加量至24%时,鱼体的增重和生长均受到显著影响,因而本试验中黑鲷幼鱼生长性能的降低可能导致了鱼体粗灰分含量的提高。另外,饲料中矿物质组成的差异也会影响其在鱼体内的沉积。本结果显示棉籽粕与鱼粉相比,其钙、磷等矿物质较易在鱼体内沉积。但由于试验饲料中添加了磷酸二氢钙,而无机矿物质的吸收率高于饲料中矿物质的吸收率,因而也可能造成了黑鲷幼鱼鱼体粗灰分含量随着棉籽粕添加比例的提高而上升。这与段培昌等[ 18 ]对星斑川鲽鱼的研究结果一致。有关棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼矿物质利用率的影响还有待进一步研究。 3.4 发酵棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼血浆生化指标的影响
鱼类血液生化指标能够反映鱼类机体的健康和生理状况。其中,SOD是鱼体内重要的抗氧化酶类,可有效清除体内自由基,减少氧化应激的产生。其含量高低可反映鱼体的抗应激能力。LYZ是一类具有抗菌活性的水解酶,是鱼体内重要的非特异性免疫机制的参与者,其活性高低可反映机体免疫状态[ 21 ]。彭翔等[ 22 ]采用发酵豆粕替代黑鲷幼鱼饲料中的鱼粉后发现,血浆中SOD活性无显著变化,但LYZ活性显著提高。同样,Yildirim等[ 23 ]在鲶鱼饲料中添加游离棉酚后发现,鲶鱼血浆中的LYZ活性显著提高。但本试验并未在饲喂发酵棉籽粕的黑鲷幼鱼血浆中检测到SOD和LYZ活性的显著变化,这与Cai等[ 3 ]采用棉籽粕饲喂鲫鱼的结果一致,可能与替代蛋白质原料的品质和养殖鱼种类有关。
AST和ALT是广泛存在于鱼体肝脏中的氨基转移酶,当肝脏组织受损时,肝脏细胞内的AST和ALT可释放进入血液,使得血浆中这2类酶的活性升高,因而AST和ALT可直接反映鱼体肝脏的受损程度。已有研究表明,棉籽粕中的棉酚可诱导鱼体肝脏细胞形态转变,进而对其细胞结构进行破坏[ 24 ]。本试验中,添加最高至24%的发酵棉籽粕对黑鲷幼鱼血浆中AST和ALT活性均无显著影响,表明发酵棉籽粕未对黑鲷肝脏产生损伤。这可能与发酵后棉籽粕中的游离棉酚含量显著降低有关。
ALP是水产动物在代谢过程中重要的调控酶,也是鱼体内巨噬细胞溶酶体的标志酶,直接关系到溶酶体的活性,因此可作为鱼体非特异性免疫的指标。本试验结果表明,随着棉籽粕添加比例的升高,黑鲷幼鱼血浆ALP活性逐渐降低,在饲喂24%发酵棉籽粕后,ALP活性显著降低,表明在一定范围内,发酵棉籽粕替代饲料中的鱼粉蛋白质对黑鲷幼鱼的免疫能力无影响,但替代比例过大,会降低黑鲷幼鱼的非特异性免疫力。由于棉籽粕经过发酵后仍然还有游离棉酚等抗营养因子,因而其高比例添加可能降低鱼类对饲料的消化、吸收,导致鱼体营养不良并最终影响鱼体的免疫力机能[ 25 ]。这与向枭等[ 26 ]采用豆粕蛋白质替代鱼粉对齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)的研究结果相一致。此外,血液中的ALP主要来自骨骼,经肝胆系统进行代谢。研究表明血浆中ALP活性也可间接反映鱼体钙、磷沉积情况[ 27 ]。郑涛等[ 28 ]报道以植物蛋白质完全替代鱼粉后,血液中钙、磷含量的提高会降低ALP活性,提高骨骼灰分的含量。因而本结果可能提示随着棉籽粕添加量提高,鱼体内钙、磷的沉积有所提高。下一步有必要针对棉籽粕替代鱼粉对黑鲷幼鱼矿物质消化和沉积率的影响开展研究。 4 结 论
在本试验条件下,发酵棉籽粕可在黑鲷幼鱼饲料中最高添加至16%用于替代鱼粉,而对黑鲷的生长性能、体成分和血浆生化指标无显著影响。
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