2. 宁波鑫亿鲜活水产有限公司, 宁波 315211
2. Ningbo Xinyi Live Aquatic Products Co., Ltd., Ningbo 315211, China
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)广泛分布于我国沿海，具有肉质好、生长快、产量高、环境适应能力强等优点，颇受广大消费者和养殖户的青睐，是我国重要的海产经济蟹类，在海洋捕捞和海水养殖业中占有极其重要的地位。据农业部渔业局统计，2009年全国三疣梭子蟹的养殖面积为3.18万hm2，产量达到9.58万t，年增幅达14.3%。长期以来，三疣梭子蟹养殖过程中多采用低值小杂鱼和贝类直接投喂，这些生物饵料不仅营养不平衡，而且还会破坏海洋渔业资源、污染水域环境、诱发梭子蟹养殖病害。因此，研制营养全面、优质高效的人工全价配合饲料已成为该产业迅速发展的迫切需要。目前有关蟹类的少量研究主要集中在蛋白质、脂肪、粗纤维营养等[ 1,2,3 ]方面，且这些研究通常采用群体养殖方式，导致个体间差异较大、残杀现象严重、成活率和增重率低等[ 4 ]，使得试验结论的准确性难以保证。近年来的研究发现，将蟹个体分开单独饲养，不仅可以防止蟹在蜕壳期间因相互残杀而获得饲料外的营养源，而且可以降低群体养殖试验中易出现的相互残杀及个体大小分化严重等现象[ 5,6 ]，从而可以对饲料营养素进行更准确地评价。
研究认为，海水养殖动物的必需脂肪酸(EFA)主要包括C22∶6n-3(DHA)、C20∶5n-3(EPA)和C20∶4n-6(ARA)3种高不饱和脂肪酸(HUFA)。对海水鱼鱼卵的脂肪酸组成分析发现，DHA和EPA在总脂肪酸中所占比重非常高，并且这种高水平一直持续于胚胎发育的全过程中，说明这2种脂肪酸在胚胎发育的过程中发挥着重要的作用。Tandler等[ 7 ]发现，在饥饿条件下大部分脂肪酸被消耗掉，而DHA、EPA、ARA(特别是DHA)却被大量保存下来，说明这3种脂肪酸对海水鱼类的生长发育发挥着不可替代的作用。由于海水动物自身不能合成DHA、EPA或合成速度不能满足其需要[ 8 ]，因此饵料来源的DHA、EPA对海水动物有着重要的意义。DHA和EPA作为脂类重要的组成成分可以为机体提供能量，特别是在消化系统发育不完善的早期阶段，脂肪酸作为能量提供者的作用更加显著[ 9 ]。DHA和EPA还是细胞膜磷脂的重要组成成分，在维持细胞膜通透性、细胞识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面发挥着重要作用。此外，DHA和EPA对海水动物的免疫调节有着重要作用[ 10,11 ]。目前，研究人员已在海水鱼类、甲壳类中开展了DHA和EPA生理功能和需求量的研究[ 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ]，但尚未有关于三疣梭子蟹饲料n-3 HUFA营养需求的报道。
综上所述，本试验拟以三疣梭子蟹幼蟹为研究对象，采用单体养殖的方式，探讨饲料中n-3 HUFA含量对其生长性能及脂肪酸组成的影响，为三疣梭子蟹高效配合饲料的研发提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料
DHA微藻油(DHA含量为40.00%，EPA含量为2.44%)，由江苏天凯生物科技有限公司提供；EPA精制油(EPA含量为45%，DHA含量为25%)，由河北海源康健生物科技有限公司提供。 1.2 试验饲料
以秘鲁红鱼粉、豆粕、小麦蛋白粉和磷虾粉为主要蛋白质源，以鱼油、大豆油为主要脂肪源配制基础饲料。分别在基础饲料中添加0、0.65%、1.30%、1.95%、2.60%和3.25%(干物质基础)的DHA+EPA并相应降低豆油的添加量，配制成n-3 HUFA含量分别为0.74%、1.14%、1.55%、1.94%、2.35%和2.76%(干物质基础)的6种等氮等能试验饲料(表1)，并使各试验饲料的DHA/EPA均为1.1。所有饲料原料过80目筛，混匀后添加油脂和水(原料混合物干重的40%)，以双螺杆挤条机挤压并经饲料颗粒机制成2种规格的颗粒饲料(直径3 mm，长度5 mm；直径5 mm，长度7 mm)，饲料90 ℃熟化30 min，阴凉处风干，用封口袋包装后于-20 ℃下保存待用。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) % |
养殖试验在宁波市象山县东陈乡鑫亿梭子蟹水产公司进行，试验用三疣梭子蟹幼蟹购自宁波兢业育苗厂，幼蟹置于室外水泥池中暂养。本试验采用单体筐养的方式，塑料筐规格为80 cm×40 cm×40 cm，养殖筐中间设置一隔板，隔板两边各放一装有沙子的沙盒，作为幼蟹的栖息场所，沙盒规格为25 cm×15 cm×10 cm。试验挑选360只初始体重在2.20 g左右的幼蟹，随机分配于180只塑料筐中(2只/筐)，塑料筐随机分组，每种试验饲料投喂60只幼蟹，每20只幼蟹作为1个重复。正式试验开始前，统一用基础饲料(含0.74%的n-3 HUFA)驯化1周，正式试验开始后每种试验饲料每天投喂2次(07:00和17:00)，投喂量控制在幼蟹体重的6%～8%。每天早晨捞取残饵和蜕壳，记录死亡数、投饵量和蜕壳次数。所有试验用塑料筐置于1个水泥池(70 m×80 m×0.6 m)中，池底铺设充氧管不间断充氧，试验期间水温26～30 ℃、溶解氧浓度6.5～7.0 mg/L、氨氮浓度≤0.5 mg/L、pH 7.8～8.2、盐度26‰～28‰，2～3 d换水1次，每次换水量约为30%。试验期为8周。 1.4 取样与分析
试验结束时，清点每组存活的幼蟹数量。停食24 h后取样，每组幼蟹分别称重，计算增重率和特定生长率，然后每组随机取4只幼蟹解剖取其肌肉和肝胰腺，肝胰腺称重后立即放入离心管中，-20 ℃冰柜中保存，用于脂肪酸组成分析。每组另随机取4只幼蟹进行常规营养成分分析。
用于常规营养成分分析的饲料和幼蟹样品置于105 ℃烘箱中至恒重，测定方法参照AOAC(1995)。水分含量由烘干前后样品的质量计算而得；粗蛋白质含量采用凯氏定氮仪(FOSS,Tecator,Hoganas,Sweden)测定样品的总氮量，通过总氮量乘以6.25而得；粗脂肪含量采用索氏抽提仪(Soxtec System HT6,Tecator,Sweden)测定；粗灰分含量采用灼烧法测定，样品置于马福炉中550 ℃下灼烧8 h至恒重。所有指标均重复测定2次，若同一样品测定结果相对偏差大于2%，则增加重复数，采用相对偏差2%以内的2个测定值的平均值作为测定结果。
用作脂肪酸组成分析的饲料和幼蟹样品均在避光的条件下-57 ℃冷冻干燥至恒重，取0.1 g左右冷冻干燥好的样品，用Bligh-Dyer法[ 24 ]提取总脂，向总脂中加入2 mL 5%～6%氢氧化钾-甲醇(4∶1，体积比)溶液，充氮气1 min，60 ℃水浴2 h，冷却，移入离心管，加饱和氯化钠溶液1 mL，混匀，用1∶1(体积比)的盐酸调至pH<1，用氯仿-正己烷(1∶4,体积比)溶液2 mL提取3次，提取液合并后用2 mL重蒸水洗1次，低温真空干燥得脂肪酸。向脂肪酸样品中加0.5 mL 14％三氟化硼甲醇液，充氮气1 min，60 ℃水浴1 h，冷却，加1 mL饱和氯化钠溶液，用2 mL正己烷提取2次，再用3 mL氯仿-正己烷(1∶4,体积比)溶液提取1次，合并提取液，加入3 g无水硫酸钠吸水，取上层液蒸干，0.5 mL分析纯正己烷定容，上机分析。
气相色谱(GC)条件：进样口温度250 ℃，载气为纯度99.99%的高纯氦气，柱流速0.81 mL/min，柱前压73.0 kPa，柱起始温度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持37 min。分流进样1 μL，分流比50∶1。质谱(MS)条件：离子源选用电子轰击(electron impact,EI)源，电子能量为70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，选取全程离子碎片扫描(SCAN)模式，质量扫描范围为40～600，溶剂延迟3.5 min。用化学电离(chemical ionization,CI)源分析时，反应气为甲烷。
脂肪酸的定性与定量：根据气质联用总离子流(GC-CIMS-TIC)图谱中各组分的质谱，可以初步确定出各组分的分子质量；再根据各组分的离子碎片质量图谱，通过查询美国国家标准与技术研究院(NIST)数据库并参考脂肪酸标准图谱定性出所有脂肪酸。用面积归一法[ 25 ]求得各脂肪酸的相对百分含量。 1.5 计算公式 增重率(%)=100×[终末体重(g)-初始体重(g)]/初始体重(g)； 特定生长率(%/d)=100×[ln终末体重(g)-ln初始体重(g)]/试验天数(d)； 肝胰腺指数(%)=100×肝胰腺重(g)/体重(g)； 饲料效率=体增重(g,湿重)/饲料摄入量(g,干重)； 蜕壳率(%)=100×2×蜕壳次数/(初始蟹个数+终末蟹个数)。 1.6 数据统计与分析
采用SPSS 17.0软件对所有数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组间差异显著(P<0.05)，则进行Tukey多重比较。结果均用“平均值±标准误”表示。 2 结果与分析 2.1 生长性能
经过8周的生长试验，各组幼蟹均没有发生死亡现象。结果(表2)显示，增重率和特定生长率均在2.35%组获得最高值，并显著高于0.74%、1.14%和1.55%组(P<0.05)，但与1.94%和2.76%组没有显著差异(P>0.05)；2.35%组饲料效率最高，显著高于其他各组(P<0.05)；2.35%组蜕壳率最高，显著高于0.74%、1.14%和1.94%组(P<0.05)，但与1.55%和2.76%组没有显著差异(P>0.05)。饲料中n-3 HUFA含量对肝胰腺指数没有显著影响(P>0.05)。以特定生长率为评价指标，得折线回归方程y=0.074x+5.284(R2=0.995,x<2.357)和y=-0.122x+5.746(R2=1.000,x>2.357)，由此估测出三疣梭子蟹幼蟹饲料中n-3 HUFA的适宜含量为2.357%(干物质基础，图1)。
| 表2 饲料中n-3 HUFA含量对三疣梭子蟹幼蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary n-3 HUFA content on growth performance of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) (n=3) |
 | 图1 饲料中n-3 HUFA含量与三疣梭子蟹幼蟹 特定生长率的关系 Fig.1 Relationship between dietary n-3 HUFA content and SGR of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) |
幼蟹常规营养成分分析结果(表3)显示，水分、粗灰分和粗蛋白质含量各组之间没有显著差 异(P>0.05)；粗脂肪含量随着饲料中n-3 HUFA 含量的增加基本呈先升高后降低的趋势，以1.55%组含量最高，显著高于0.74%、1.14%、1.94%和2.76%组(P<0.05)，与2.35%组没有显著差异(P>0.05)。
| 表3 饲料中n-3 HUFA含量对三疣梭子蟹幼蟹常规营养成分的影响 Table 3 Effects of dietary n-3 HUFA content on common nutrient components of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) (n=3) % |
脂肪酸组成检测结果(表4、表5)显示，幼蟹肌肉及肝胰腺中的脂肪酸组成受到饲料中n-3 HUFA含量的影响。
| 表4 饲料中n-3 HUFA含量对三疣梭子蟹幼蟹肌肉脂肪酸组成的影响 Table 4 Effects of dietary n-3 HUFA content on muscle fatty acid composition of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) (n=3)% |
| 表5 饲料中n-3 HUFA含量对三疣梭子蟹幼蟹肝胰腺脂肪酸组成的影响
Table 5 Effects of dietary n-3 HUFA content on hepatopancreas fatty acid composition of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) (n=3) %
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幼蟹肌肉中DHA和EPA含量均在2.76%组达到最高值，显著高于其他各组(P<0.05)，二者在0.74%组的含量均最低，显著低于其他各组(P<0.05)；肌肉中多不饱和脂肪酸(PUFA)和n-3 HUFA含量均在2.76%组达到最高值，显著高于其他各组(P<0.05)，二者在0.74%组的含量均最低，显著低于其他各组(P<0.05)。此外，肌肉中n-3 HUFA含量与饲料中n-3 HUFA含量存在极显著的正相关关系(y=9.178x-7.736,R2=0.822,P<0.01,图2)。
 | 图2 饲料中n-3 HUFA含量与三疣梭子蟹幼蟹 肌肉中n-3 HUFA含量的关系 Fig.2 Relationship between dietary n-3 HUFA content and muscle n-3 HUFA content of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) |
幼蟹肝胰腺中DHA和EPA含量均在2.76%组达到最高值，显著高于其他各组(P<0.05)；肝胰腺中n-3 HUFA含量在2.76%组达到最高值，显著高于其他各组(P<0.05)。此外，肝胰腺中n-3 HUFA含量与饲料中n-3 HUFA含量存在极显著的正相关关系(y=2.354x-0.853,R2=0.847,P<0.01,图3)。幼蟹肝胰腺中DHA、EPA和n-3 HUFA含量在0.74%、1.14%和1.55%组之间没有显著差异(P>0.05)。
 | 图3 饲料中n-3 HUFA含量与三疣梭子蟹幼蟹 肝胰腺中n-3 HUFA含量的关系 Fig.3 Relationship between dietary n-3 HUFA content and hepatopancreas n-3 HUFA content of juvenile swimming crab (Portunus trituberculatus) |
比较肌肉和肝胰腺中脂肪酸组成可以看出，除0.74%组外，肝胰腺中的C16∶0、C18∶0、C18∶1n-9、C18∶2n-6、饱和脂肪酸(SFA)含量高于肌肉中相应脂肪酸的含量，而肌肉中的EPA、DHA、n-3 HUFA含量则高于肝胰腺中相应脂肪酸的含量。 3 讨 论
目前，大量的研究已证实饲料中的脂肪酸，特别是EPA和DHA等长链PUFA是蟹类的必需脂肪酸，对蟹类的蜕壳、生长和生殖均具有重要作用[ 26 ]。但在对海洋蟹类的研究中发现，亚油酸(LA，即C18∶2n-6)、亚麻酸(LNA，即C18∶3n-3)并不是它们的必需脂肪酸，海水蟹类缺乏将C18不饱和脂肪酸转化成HUFA(如EPA、DHA)的能力[ 23,27 ]。Takeuchi等[ 23 ]分别以淡水小球藻、玉米油及EPA和DHA油强化的轮虫投喂三疣梭子蟹仔蟹，研究发现淡水小球藻和玉米油强化组仔蟹的存活率和生长速度均较低，而EPA、DHA油强化组仔蟹的存活率及生长速度均显著高于前2个组，因此认为EPA、DHA是三疣梭子蟹仔蟹的必需脂肪酸，并得出饲料中n-3 HUFA的适宜含量为0.9%~1.7%(干物质基础)。Suprayudi等[ 27 ]分别以油酸(OA，即C18∶1n-9)、LA、LNA以及EPA和DHA强化的轮虫投喂溞状幼体Ⅰ期(Z1)和溞状幼体Ⅱ期(Z2)的青蟹仔蟹，研究发现OA、LA和LNA强化后仔蟹体脂肪酸中EPA含量由1.2%下降到0.4%~0.8%、DHA含量由0.5%下降到0.1%~0.2%，且出现存活率降低、蜕壳周期延长、生长缓慢等现象，说明OA、LA和LNA并非青蟹仔蟹的必需脂肪酸，推测青蟹缺乏将C18脂肪酸转化成HUFA的能力，或者此能力较低。本试验中，将饲料中n-3 HUFA含量由0.74%增加到2.35%后提高了三疣梭子蟹幼蟹的生长速度和饲料效率，但进一步提高n-3 HUFA含量到2.76%则生长速度和饲料效率反而有所下降，这与之前在中华绒螯蟹[ 28,29 ]、锯缘青蟹[ 2, 27, 30 ]上的研究结果相一致。另外，Suprayudi等[ 27 ]研究发现，饲喂未营养强化卤虫幼体的青蟹发育到Ⅰ期时表现出蜕壳周期延长和甲壳宽狭窄的现象，认为饵料中的DHA对于幼蟹的蜕壳发挥着重要的作用。甲壳动物蜕壳是由蜕皮固醇调节的，蜕皮固醇是由Y器官分泌的，分泌后释放到血淋巴中，直接调节蜕皮(壳)活动[ 31 ]。[3H]-蜕皮酮在胚胎和幼体体内能够代谢转化为3种不同的复合物，其中一种是C22共轭脂肪酸，因此推测C22脂肪酸(如DHA)可能通过调控蜕皮固醇代谢而调节青蟹幼体的蜕壳。本试验也发现，饲料中n-3 HUFA含量为2.35%时提高了三疣梭子蟹幼蟹的蜕壳率，进一步提高饲料中n-3 HUFA含量至2.76%后三疣梭子蟹幼蟹的蜕壳率反而有所降低，这一趋势与特定生长率相似。 本试验以特定生长率为评价指标，通过折线回归方程y=0.074x+5.284(R2=0.995,x<2.357)和y=-0.122x+5.746(R2=1.000,x>2.357)，估测出三疣梭子蟹幼蟹饲料中n-3 HUFA的最适含量为2.357%(干物质基础)。本研究结果高于在河蟹幼蟹[ 28 ]、河蟹仔蟹[ 29 ]、青蟹幼蟹[ 32 ]、青蟹仔蟹[ 27 ]及三疣梭子蟹仔蟹[ 23 ]中的研究结果，这可能与以下因素有关：1)试验动物品种不同；2)试验方法不同，本试验采用在配合饲料中添加n-3 HUFA，而目前对蟹类的研究大都采用强化生物饵料的方式；3)生长阶段不同，本试验采用体重为2.09~2.27 g的幼蟹，Takeuchi等[ 23 ]采用的是三疣梭子蟹仔蟹；4)养殖方式不同，本试验采用单体筐养方式，而目前对蟹类的研究大都采用群体养殖方式。
在常规营养成分方面，随饲料中n-3 HUFA含量的提高，幼蟹水分和粗灰分含量总体呈现下降趋势，粗蛋白质含量则呈现先升高后降低的趋势，但各组之间并没有显著性差异。Houlihan等[ 33 ]认为，鱼类的生长主要体现在鱼体蛋白质沉积的增加，本研究结果也发现三疣梭子蟹幼蟹粗蛋白质含量与特定生长率的变化趋势相似。薛敏等[ 34 ]在牙鲆的研究中发现，饲料中EPA和DHA的存在使得肌肉脂肪总量有所增加，肌肉粗脂肪含量起初随着EPA、DHA含量增加而增加，但更高含量的EPA、DHA并没有进一步增加牙鲆肌肉的粗脂肪含量。本试验结果与之类似，三疣梭子蟹幼蟹粗脂肪含量随着饲料中n-3 HUFA含量的提高基本呈先升高后降低的趋势，以1.55%组含量最高，显著高于0.74%、1.14%、1.94%和2.76%组，与2.35%组没有显著差异。这说明饲料中的n-3 HUFA含量可以影响三疣梭子蟹幼蟹机体的脂肪代谢，具体的影响机制有待进一步研究。
大量研究表明，饲料脂肪酸组成直接影响到养殖对象的脂肪酸组成[ 35,36,37,38,39 ]。相似地，本试验中三疣梭子蟹幼蟹肌肉及肝胰腺中的脂肪酸组成也受到饲料中脂肪酸组成的影响。三疣梭子蟹幼蟹肌肉及肝胰腺中n-3 HUFA含量与饲料中n-3 HUFA含量之间均存在极显著的正相关关系。Sargent等[ 9 ]认为，鱼类所有组织中的脂肪酸的一个重要的功能就是通过β氧化为机体提供三磷酸腺苷(ATP)，只是不同的脂肪酸的利用顺序有所差异。大菱鲆(Scophthalmus maximus)和金头鲷(Sparus aurata)等在胚胎发育阶段和仔鱼吸收卵黄内源营养的发育阶段，脂肪酸按照以下顺序被先后利用：n-9系列、n-6系列、n-3系列。在这一过程中，SFA和单不饱和脂肪酸(MUFA)作为内源营养阶段的重要能源被首先利用，而必需脂肪酸中的DHA、EPA、ARA则选择性地被优先保存下来[ 40 ]。本试验结果进一步说明肝胰腺是甲壳动物脂肪酸代谢的主要器官，比较肌肉和肝胰腺脂肪酸组成可以发现，C16∶0、C18∶0、C18∶1n-9、C18∶2n-6、SFA等供能脂肪酸主要集中在肝胰腺中，而DHA、EPA等必需脂肪酸则被优先保存于肌肉中。此外，三疣梭子蟹幼蟹肝胰腺中DHA、EPA、n-3 HUFA含量并非完全随着饲料中n-3 HUFA含量的增加而增加，0.74%、1.14%和1.55%组幼蟹肝胰腺中DHA、EPA、n-3 HUFA含量并没有显著差异，说明饲料中n-3 HUFA含量在一定范围内(0.74%~1.55%)时三疣梭子蟹幼蟹肝胰腺可能存在调控脂肪酸组成的机制，但当饲料中n-3 HUFA含量超过这一范围时，此调控能力可能不能满足较高含量n-3 HUFA的代谢需求，此机制有待继续研究。 4 结 论
饲料中适宜的n-3 HUFA含量可以改善三疣梭子蟹幼蟹的生长表现和饲料效率。以特定生长率为评价指标，通过折线回归分析估测出三疣梭子蟹幼蟹饲料中n-3 HUFA的最适含量为2.357%(干物质基础)。
致谢: 感谢王燕飞、鲍雪宁、黄继、周东、张超等同学在整个试验过程中给予的帮助，也感谢宁波市象山县东陈乡鑫亿梭子蟹水产公司给予我们学习和实践的机会。
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