植物多糖具有免疫调节、抗氧化、降低血糖和血脂等多种生物学功能，作为一种绿色环保的新型饲料添加剂正逐渐受到人们重视^{[ 1 ]}。水溶性苜蓿多糖(water soluble alfalfa polysaccharides,WSAP)是从苜蓿中提取的植物多糖之一，主要含葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一种未知单糖，是苜蓿的重要营养成分^{[ 2,3 ]}。已经证实提取的苜蓿多糖同香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖等一样，是一种无毒、具有生物活性的水溶性多糖^{[ 4 ]}。动物饲粮中添加一定剂量的WSAP能提高机体免疫力和抗感染力、抗辐射力，有明显的促生长作用，还具有降低血糖和血脂等作用^{[ 5,6,7 ]}。之前的大多数研究主要集中在WSAP提高机体免疫力及抗感染力方面，而对其促生长的分子机制还没有进行深入研究。动物生长受生长轴的调控。生长激素(GH)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是生长轴中重要的2种激素，GH/IGF-1轴也是生长轴的重要组成部分，与动物体的蛋白质、糖、脂类代谢紧密相关，其主要功能是调控畜禽生长，反映动物营养与生长状况^{[ 8 ]}。现代营养学研究表明，环境因素会对基因的表达产生影响，进而影响机体的生长发育^{[ 9 ]}。WSAP对鸡的促生长作用目前还未见相关报道。本研究通过在饲粮中添加不同水平的WSAP，研究其对肉仔鸡生长性能、胴体品质及GH和IGF-1基因表达的影响，为WSAP的开发应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

WSAP由南昌市农产品加工与质量控制重点实验室提供，采用黄明圈等^{[ 10 ]}的方法提取，具体操作如下：称取干燥的苜蓿，加入10倍重量的水，沸水浸提5 h 2次，合并2次滤液，减压浓缩，醇沉，Sevage法去蛋白质，醇沉，真空干燥，得苜蓿多糖 粉末，并用大孔树脂纯化2次，备用。用蒽酮硫酸 法检测其多糖含量为87.5％。 1.2 试验动物、饲粮及试验设计

选取360只1日龄艾维茵肉仔鸡，随机分为4组，每组6个重复，每个重复15只鸡，各组间体重无显著差异(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮基础上分别添加0.5％、1.0％、1.5％ WSAP的试验饲粮。基础饲粮配方根据NRC(1994)肉鸡饲养标准设计(表1)。自由采食和饮水，自然光照，湿度65%左右，通风良好，保持清洁卫生，常规消毒。试验期42 d。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) % 项目 Items 1～21日龄 1 to 21 days of age 22～42日龄 22 to 42 days of age 原料 Ingredients 玉米 Corn 56.50 59.50 豆粕 Soybean meal 36.20 32.50 玉米油 Corn oil 3.00 3.50 石粉 Limestone 1.10 1.30 磷酸氢钙 CaHPO4 1.80 1.80 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.10 0.10 食盐 NaCl 0.30 0.30 预混料 Premix1) 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.54 12.85 粗蛋白质 CP 20.90 19.76 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.53 0.46 赖氨酸 Lys 1.21 1.08 钙 Ca 1.06 1.00 有效磷 AP 0.51 0.45 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 5 500 IU，VD3 1 650 IU，VE 35 IU，VK3 2.5 mg，VB1 2.0 mg，VB2 7.5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 18.6 mg，烟酸 nicotinic acid 45 mg，生物素 biotin 0.25 mg，VB12 100 μg，Fe 160 mg，Zn 120 mg，Mn 120 mg，Cu 25 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。 2)粗蛋白质、钙为实测值，其余为计算值。CP and Ca were measured values,while the others were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

于试验第1、21、42天，07:00空腹称重。称重前1天19:00断料，不断水。试验期间准确记录各重复耗料量。以各重复为单位，记录体重、平均日增重、平均日采食量和料重比。 1.3.2 胴体品质

于试验结束时，从每个重复中选择接近平均体重的2只鸡，称重后颈静脉放血处死，进行胴体品质测定。测量屠体重、胸肌重、腿肌重、腹脂重及全净膛重，测定方法参照文献^{[ 11 ]}进行，并计算屠宰率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。

屠宰后立即取肝脏、腹脂、肾脏组织，立即放入液氮速冻后转到-80 ℃冰箱保存，用于组织总RNA的提取。将100 mg左右的组织样用液氮研磨成粉末，使用1 mL Trizol试剂从组织中提取总RNA，总RNA的质量采用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop公司)测定，并通过电泳检测提取的总RNA的完整性。在37 ℃下用脱氧核 糖核酸酶(DNase，Ambion公司)处理20 min总RNA以消除基因组DNA。取200 ng总RNA，用莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(Invitrogen公司)在PE9600 PCR仪(PERKIN ELMER公司)上进行逆转录，并采用GH、IGF-1特异性引物(表2)进行扩增，得到预期的特定mRNA长度的DNA片段。每组所有样品都进行检测，每样品重复3次。用Kodak 1D图像分析软件进行灰度分析。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作内标。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 基因引物序列及RT-PCR条件 Table 2 Primer sequences for genes and conditions for RT-PCR 基因 Genes GenBank登录号 GenBank accession No. 引物序列 Primer sequences (5′—3′) 扩增产物大小 Amplified product size/bp 退火温度 Annealing temperature/℃ 循环次数 No. of cycles 生长激素 GH AY46184 FP: TGCAATACCTAAGCAAGGTGTTCA RP: CAGGGCTTGGATCCCTTCTT 101 62 32 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 M32791 FP: GCTTTTGTGATTTCTTGAAGGTGAA RP: CATACCCTGTAGGCTTACTGAAGTA 195 60 34 甘油醛-3-磷酸 脱氢酶 GAPDH K01458 FP: CTTTCCGTGTGCCAACCC RP: CATCAGCAGCAGCCTTCACTAC 600 60 34

表2 基因引物序列及RT-PCR条件 Table 2 Primer sequences for genes and conditions for RT-PCR

结果采用SPSS 13.0统计软件中的one-way ANOVA过程对数据进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较。 2 结果与分析 2.1 WSAP对肉仔鸡生长性能的影响

由表3可见，与对照组相比，饲粮中添加WSAP对第21天的平均体重和1~21 d平均日增重无显著影响(P>0.05)，但提高了第42天的平均体重和全期(1~42 d)平均日增重，且1.0%和1.5% WSAP组达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平；而0.5% WSAP组在各期的平均体重与平均日增重与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。与对照组相比，添加WSAP对前期(1~21 d)的平均日采食量无显著影响(P>0.05)，但提高了后期(22~42 d)和全期的平均日采食量，1.0%和1.5% WSAP组在后期和全期平均日采食量均达到显著水平(P<0.05)，0.5% WSAP组差异不显著(P>0.05)。同时，添加WSAP还提高了各期的饲料报酬，1.0%和1.5% WSAP组在后期和全期的料重比分别比对照组降低了14.58%、11.98%和12.50%、10.33%(P<0.05)。不同WSAP添加水平试验组间的生长性能差异均不显著(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 WSAP对肉仔鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of WSAP on growth performance of broilers 项目 Items 对照组 Control group WSAP添加水平WSAP supplemental level/% 0.5 1.0 1.5 平均体重 ABW/g 第1天 Day 1 46.78±1.48 47.02±1.86 46.69±1.64 46.53±1.79 第21天 Day 21 628.17±10.37 654.15±10.38 664.39±9.65 652.86±11.24 第42天 Day 42 1 804.25±34.46b 1 935.60±21.35ab 2 201.38±30.17a 2 122.03±24.86a 平均日增重 ADG/g 1~21 d 27.69±1.58 28.91±1.33 29.41±1.26 28.87±1.24 22~42 d 56.00±1.55Bb 61.03±1.58ABab 73.19±2.01Aa 69.96±1.86Aa 1~42 d 41.84±1.35Bb 44.97±1.06ABa 51.30±1.39Aa 49.41±1.64Aa 平均日采食量 ADFI/g 1~21 d 45.02±0.26 44.56±0.15 43.45±0.28 43.19±0.19 22~42 d 107.62±0.52b 115.17±0.88ab 120.32±0.75a 118.53±0.74a 1~42 d 77.08±0.04b 80.73±0.05ab 82.82±0.05a 81.78±0.05a 料重比 F/G 1~21 d 1.62±0.03 1.54±0.05 1.48±0.04 1.49±0.05 22~42 d 1.92±0.02a 1.88±0.04ab 1.64±0.03b 1.69±0.03b 1~42 d 1.84±0.02a 1.80±0.02ab 1.61±0.02b 1.65±0.02b 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row,values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 WSAP对肉仔鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of WSAP on growth performance of broilers

由表4可见，与对照组相比，添加WSAP对屠宰率和腿肌率无显著影响(P>0.05)，但随着WSAP添加水平的增加，胸肌率提高，腹脂率下降，且1.0%和1.5% WSAP组与对照组相比差异达到显著水平(P<0.05)。各试验组间的胴体品质差异均不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 WSAP对肉仔鸡胴体品质的影响 Table 4 Effects of WSAP on carcass quality of broilers % 项目 Items 对照组 Control group WSAP添加水平WSAP supplemental level/% 0.5 1.0 1.5 屠宰率 Dressed percentage 91.48±0.36 92.13±0.51 92.56±0.78 93.02±0.62 胸肌率 Percentage of breast muscle 15.07±0.67b 15.78±0.49ab 16.69±0.73a 17.02±0.54a 腿肌率 Percentage of thigh muscle 22.97±0.35 22.48±0.54 23.60±0.63 24.01±0.57 腹脂率 Percentage of abdominal fat 2.35±0.76a 2.03±0.64ab 1.82±0.55b 1.67±0.39b

表4 WSAP对肉仔鸡胴体品质的影响 Table 4 Effects of WSAP on carcass quality of broilers %

由表5可见，与对照组相比，添加WSAP显著或极显著地提高GH和IGF-1基因在肝脏、脂肪组织和肾脏中的表达(P<0.05或P<0.01)。其中，在肝脏和脂肪组织中的GH及IGF-1基因表达量都随WSAP添加水平的增加而提高，而肾脏中的GH和IGF-1基因表达量则随着WSAP添加水平的增加而呈现先增加后减少的趋势，但各试验组间差异不显著(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 WSAP对肉仔鸡GH和IGF-1基因表达的影响 Table 5 Effects of WSAP on GH and IGF-1 gene expressions of broilers 项目 Items 组织 Tissue 对照组 Control group WSAP添加水平 WSAP supplemental level/% 0.5 1.0 1.5 生长激素 GH 肝脏 Liver 0.68±0.03Bb 0.81±0.03Aa 0.98±0.02Aa 1.03±0.04Aa 脂肪 Adipose 0.46±0.02b 0.63±0.03ab 0.72±0.04a 0.78±0.02a 肾脏 Kidney 0.36±0.04b 0.46±0.02ab 0.54±0.03a 0.52±0.03a 胰岛素样生长 因子-1 IGF-1 肝脏 Liver 0.71±0.03b 0.81±0.03a 0.95±0.02a 1.00±0.04a 脂肪 Adipose 0.48±0.02b 0.55±0.03ab 0.71±0.04a 0.79±0.02a 肾脏 Kidney 0.37±0.04b 0.41±0.02ab 0.56±0.03a 0.53±0.03a

表5 WSAP对肉仔鸡GH和IGF-1基因表达的影响 Table 5 Effects of WSAP on GH and IGF-1 gene expressions of broilers

研究表明，苜蓿多糖可以提高粗蛋白质代谢率，加快蛋白质合成^{[ 12 ]}，促进肠道有益微生物乳酸菌和双歧杆菌的增殖^{[ 13 ]}；并能通过提高免疫力、抗感染力^{[ 5, 6, 13 ]}和抗氧化水平^{[ 4 ]}，减少动物机体的应激反应来起到促生长的作用。陈红莉^{[ 12 ]}在饲粮中添加0.5%、1.0%和2.0% WSAP饲喂1日龄的艾维茵肉仔鸡，发现1.0%的添加水平效果较好。张慧辉^{[ 13 ]}也发现饲粮中添加1% WSAP可促进艾维茵肉仔鸡生产性能提高，而添加水平提高到8%后，会极大地抑制鸡只的生长。刘晴雪等^{[ 14 ]}用WSAP饲喂爱拔益加(AA)肉仔鸡公雏，发现饲喂效果随添加水平的增加呈现先升高后下降的趋势，以200和500 mg/kg的添加水平最佳。本试验中，添加1.0%和1.5%的WSAP均显著增加肉仔鸡的平均体重、平均日增重，降低料重比，其中1.0% WSAP组的效果要优于1.5% WSAP组。这可能是因为WSAP中的半乳糖醛酸等物质作为一种非淀粉多糖，具有抗营养作用，过高的添加水平会对肉仔鸡的生长性能产生负面影响。徐春燕^{[ 4 ]}的试验中，苜蓿多糖(500 mg/kg)对肉仔鸡生长性能的促进作用主要表现在生长前期，而黄芪多糖的促生长作用主要表现在生长后期。陈红莉^{[ 12 ]}和刘大林等^{[ 15 ]}的试验发现，低剂量苜蓿多糖(0.5%)对肉鸡生长前期(1~3周龄)的促生长效果好；而 较高剂量苜蓿多糖(1.0%)则在生长后期(3~6周龄)的促生长效果最佳。本试验中添加1.0%和1.5% WSAP对肉仔鸡生长后期的增重效果更显著，可能是添加水平较高的原因。另外，陈红莉^{[ 12 ]}认为，由于多糖的甜味，苜蓿多糖能提高肉鸡的采食量，且鸡只的平均日采食量随苜蓿多糖添加水平的增加而增加。而徐春燕^{[ 4 ]}发现，当WSAP的添加水平达到500 mg/kg时显著降低肉仔鸡1~21 d的平均日采食量，对肉仔鸡22~42 d、1~42 d的平均日采食量均无显著影响。本试验中，添加WSAP降低了肉仔鸡前期的平均日采食量，但提高了后期和全期的平均日采食量。这和陈红莉^{[ 12 ]}和徐春燕^{[ 4 ]}的结果均只有部分相同，可能是影响采食量的因素众多，苜蓿黄酮对采食量的调节受其他因素影响而导致试验结果不一。

WSAP对肉仔鸡胴体品质影响的研究不多。刘大林等^{[ 15 ]}观察到，苜蓿多糖对肉鸡的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率等的影响均不显著。本研究结果表明，添加WSAP对肉仔鸡屠宰率和腿肌率也没有显著影响，但添加1.0%和1.5% WSAP能够显著提高肉仔鸡的胸肌率，降低腹脂率，改善胴体品质。这可能和WSAP能够提高蛋白质的代谢率、降低脂肪代谢率^{[ 12 ]}有关。

GH和IGF-1基因是畜禽生产中的2个重要候选基因。对鸡的生长发育、骨骼细胞的增殖和分化、脂肪含量、饲料转化率及产蛋量和抗病性等都有重要的调节作用，能够加快肌肉、骨骼生长，促进生长发育，降低饲料转化率。Reiprich等^{[ 16 ]}发现GH mRNA的表达量和血液中GH的浓度有较强相关性，并直接影响动物的增重速度，即GH mRNA和血液GH浓度越高，增重速度越快。研究表明，营养水平会影响鸡GH和IGF-1基因表达^{[ 17 ]}。徐向阳等^{[ 18 ]}报道，在生长猪饲粮中添加5%、10%、15%、20%苜蓿草粉，能够显著或极显著地提高生长猪血液中GH和IGF-1的浓度，且激素水平随着苜蓿草粉添加水平的增加而上升。本试验中，GH和IGF-1基因在不同的组织中的表达量是不一致的，肝脏中的GH和IGF-1基因表达量最高，然后是脂肪组织和肾脏。添加WSAP提高了肝脏、脂肪组织和肾脏中GH和IGF-1基因的表达。但在肝脏和脂肪组织中的GH基因及肝脏中的IGF-1基因表达量随WSAP添加水平的增加而提高，而肾脏中的GH基因和脂肪组织及肾脏中的IGF-1基因表达量则随着WSAP添加水平的增加而呈现先增加后减少的趋势，以1.0%的添加水平效果最好，其原因尚不清楚。已有的研究表明，GH可以影响肉鸡肝脏中脂质的合成和脂肪的净沉积量^{[ 19 ]}。Ashwell等^{[ 20 ]}发现，GH能直接影响瘦素基因在脂肪组织和肝脏的表达，从而导致脂肪沉积减少。本研究也发现，组织中GH基因表达量越高的鸡，腹脂沉积也越少。 4 结 论

① 本试验结果表明，1.0%和1.5% WSAP可以提高GH和IGF-1基因在肉仔鸡肝脏、脂肪组织和肾脏中的表达，促进机体生长代谢活动，增加生长后期(21~42 d)的平均日采食量，促进生长后期平均体重、平均日增重和饲料报酬的提高。

② 1.0%和1.5% WSAP提高了42日龄肉仔鸡的胸肌率，降低其腹脂率。

③ 综合考虑，肉仔鸡饲粮中WSAP添加水平为1.0%时效果较好。