动物营养学报  2014, Vol. 26 Issue (5): 1362-1369   PDF (1068KB)    
引用本文
周梁, 张海军, 王晶, 郑旭阳, 齐广海, 武书庚. 蛋白酶对8~21日龄肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响[J]. 动物营养学报, 2014, 26(5): 1362-1369.  
ZHOU Liang, ZHANG Haijun, WANG Jing, ZHENG Xuyang, QI Guanghai, WU Shugeng. Effects of Protease on Growth Performance, Amino Acid Apparent Digestibility and Intestinal Morphology of Broilers Aged from 8 to 21 Days[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014, 26(5): 1362-1369.  
蛋白酶对8~21日龄肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响
周梁1, 张海军1, 王晶1, 郑旭阳2, 齐广海1 , 武书庚1     
1. 中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点开放试验室, 北京 100081;
2. 帝斯曼（中国）有限公司, 北京 100027
收稿日期：2013-11-15
基金项目：家禽产业技术体系北京市创新团队项目；国家科技支撑计划课题（2011BAD26B04）
作者简介：周 梁（1987—），男，山东淄博人，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail：dominator87@163.com
通讯作者：武书庚，副研究员，硕士生导师，E-mail：wushugeng@mail.caas.net.cn；齐广海，研究员，博士生导师，E-mail：guanghai_qi@163.com
摘要：本试验旨在研究蛋白酶对8~21日龄肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响。选择7日龄体重相近、健康的爱拔益加（AA）肉仔鸡560只（公母各占1/2），随机分为5个组，每组8个重复，每个重复14只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕-肉骨粉型基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.01%、0.02%、0.04%和0.08%蛋白酶的试验饲粮，试验期14 d。结果表明：1）各蛋白酶组肉仔鸡平均日采食量显著高于对照组（P<0.05），0.02%蛋白酶组肉仔鸡平均日增重显著高于对照组（P<0.05)。2）蛋白酶可二次性提高肉仔鸡粗蛋白质和氨基酸（亮氨酸和异亮氨酸除外）的表观消化率（P<0.05)，0.02%蛋白酶组肉仔鸡粗蛋白质表观消化率显著高于对照组（P<0.05)，0.01%和0.02%蛋白酶组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和丙氨酸的表观消化率均显著高于对照组（P<0.05)。3）随蛋白酶添加水平增加，十二指肠隐窝深度呈显著线性升高（P<0.05)，绒毛高度/隐窝深度呈显著线性降低（P<0.05)；空肠绒毛高度呈显著二次曲线升高（P<0.05)，隐窝深度呈显著线性升高（P<0.05)。由此可见，玉米-豆粕-肉骨粉型饲粮添加0.01%和0.02%蛋白酶能够促进肉仔鸡生长前期的小肠发育，提高粗蛋白质及大部分氨基酸表观消化率，从而改善生长性能。
关键词： 蛋白酶     肉仔鸡     生长性能     氨基酸表观消化率     肠道组织形态    
Effects of Protease on Growth Performance, Amino Acid Apparent Digestibility and Intestinal Morphology of Broilers Aged from 8 to 21 Days
ZHOU Liang1, ZHANG Haijun1, WANG Jing1, ZHENG Xuyang2, QI Guanghai1 , WU Shugeng1     
1. Key Laboratory of Biotechnology of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. DSM (China) Co., Ltd., Beijing 100027, China
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of protease on growth performance, amino acid apparent digestibility and intestinal morphology of broilers aged from 8 to 21 days. A total of 560 seven-day-old healthy Arbor Acres broilers with a similar body weight were randomly allocated to 5 groups with 8 replicates per group and 14 chickens per replicate. Broilers in the control group were fed a basal diet, and broilers in the experimental groups were fed the basal diet supplemented with 0.01%, 0.02%, 0.04% and 0.08% protease, respectively. The experiment lasted for 14 days. The results showed as follows: 1) the average daily feed intake of broilers in protease groups was significantly higher than that in control group (P<0.05), and the average daily gain of broilers in 0.02% protease group was significantly higher than that in control group (P<0.05). 2) The apparent digestibility of crude protein and amino acids (except leucine and isoleucine) showed a quadratic curve of rising (P<0.05), the crude protein apparent digestibility of broilers in 0.02% protease group was significantly higher than that in control group (P<0.05), and the apparent digestibility of asparagic acid, threonine, serine and alanine in 0.01% and 0.02% protease groups was significantly higher than that in control group (P<0.05). 3) With the increase of protease supplemental level, the crypt depth of duodenum showed a linear curve of rising (P<0.05), and the ratio of villus height to crypt depth (V/C) showed a linear curve of falling (P<0.05); the villus height of jejunum showed a quadratic curve of rising (P<0.05), and the crypt depth showed a linear curve of rising (P<0.05). It is concluded that adding 0.01% to 0.02% protease to the corn-soybean meal-meat and bone meal diet can promote the development of small intestine of broilers in the early stage, improve the apparent digestibility of crude protein and most of amino acids, and then improve the growth performance.
Key words: protease     broilers     growth performance     amino acid apparent digestibility     intestinal morphology    

我国2012年进口大豆5 838万t，蛋白质原料对外依存度大于80%，使得近年来我国饲料成本居高不下，养殖效益难以保障，动物对饲料营养物质的利用率不足40%。鉴于此，利用蛋白酶提高蛋白质的利用率日益得到重视。研究表明，在当前的原料价格水平下，应用蛋白酶可降低饲料成本，提高畜禽养殖收益[1]。另外，蛋白质利用率的提高还能减少氮的排放，减轻环境污染。市场上常见的蛋白酶制剂主要有复合型和单组分型。复合型蛋白酶制剂以蛋白酶为主要成分，可提高营养物质消化率和肉仔鸡生长性能[2,3,4]，但较难定义蛋白酶的具体作用。所以，研究单组分型蛋白酶对动物生长性能的影响并评价蛋白酶的作用，得到了学者的认可。近年来，学者对新型丝氨酸蛋白酶[1]的研究较多，该蛋白酶源自诺卡式菌，由地衣芽孢杆菌发酵生产而来，能有效提高动物饲粮中特定氨基酸的消化率，缓解低蛋白质(低氨基酸)饲粮对动物生长速度的影响[2,5]，提高动物对营养物质尤其是蛋白质的消化率[6]。但目前针对此蛋白酶的研究均以低蛋白质饲粮为基础，就其对饲喂正常营养水平饲粮动物的作用效果及其适宜添加水平的研究较少。本试验在实际生产条件下，研究正常营养水平饲粮中不同添加水平的蛋白酶对肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响，为蛋白酶在肉仔鸡生产中的合理应用提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

蛋白酶(Ronozyme ProAct CT)，活性75 000 U/kg prot。蛋白酶活性单位定义：pH 9.0、37 ℃条件下，每分钟从1 μmol底物中释放出1 μmol对硝基苯胺所需要酶量定义为一个酶活性单位[4]。事先备好的酶首先混入预混合饲料中，而后与试验饲粮混合。

1.2 试验设计与基础饲粮

试验选择1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡850只(公母各占1/2)，于环境可控、持续光照的鸡舍内饲养至7日龄，逐只称重，选择体重相近、健康的560只(公母各占1/2)肉仔鸡随机分为5组，每组8个重复，每个重复14只鸡，各组初始体重经检验差异不显著(P＞0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.01%、0.02%、0.04%和0.08%蛋白酶的试验饲粮，试验期14 d。

参照NRC(1994)、《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)及《中国饲料成分及营养价值表》(2011)，结合《AA肉仔鸡饲养管理手册》配制玉米-豆粕-肉骨粉型基础饲粮(表1)，蒸汽制粒。为方便测定营养物质表观消化率，提高饲粮中盐酸不溶性灰分(AIA)标记物含量，饲粮中添加1.25%的硅藻土(SiO2＞90%)。在配制添加蛋白酶试验饲粮时，以蛋白酶替代等量的硅藻土。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %
1.3 饲养管理

试验鸡采用4层笼养，自然光照加人工补光，光照强度30 lx。第1周鸡舍温度33~35 ℃，而后每周降低2~3 ℃。饲养管理依据《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行，常规免疫，自由饮水和采食。

1.4 检测指标及方法

生长性能：每日观察鸡群的生长、发病及死亡状况，记录死淘数。在20日龄的22：00禁食，期间自由饮水，次日08:00，以重复为单位称重、结料。计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

粗蛋白质及氨基酸表观消化率：于21日龄随机从每个重复中选取肉仔鸡公、母各1只，颈脱节致死，取回肠(卵黄囊遗迹到回盲结合部的后段2 cm)内容物，冷冻，冻干，研磨，过0.5 mm筛，4 ℃保存。

测定饲粮和回肠食糜中的粗蛋白质、AIA和氨基酸含量。粗蛋白质含量使用KDY-9830型自动凯氏定氮仪测定；AIA含量根据GB/T 23742—2009/ISO5985:2002的方法测定；氨基酸含量(17种)由中国农业科学院畜牧兽医研究所中心分析室测定。

粗蛋白质表观消化率(%)=[1-(饲粮中指示剂含量/食糜中指示剂含量)×(食糜中粗蛋白质含量/饲粮中粗蛋白质含量)]×100；

氨基酸表观消化率(%)=[1-(饲粮中指示剂含量/食糜中指示剂含量)×(食糜中氨基酸含量/饲粮中氨基酸含量)]×100。

肠道组织形态：各段小肠称重，分别将十二指肠、空肠和回肠的近端肠段剪下长3 cm的组织样，用冰冷的生理盐水缓缓冲洗干净，浸入4%福尔马林溶液，4 ℃保存，以备制作石蜡切片。电镜观测小肠绒毛高度、隐窝深度。

1.5 统计分析

试验数据采用SPSS 16.0软件的one-way ANOVA程序统计分析，Duncan氏法进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。数据以“平均值±标准差”表示。

2 结 果 2.1 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，随蛋白酶添加水平增加，肉仔鸡的ADG呈先升高后降低的二次曲线关系(P＜0.05)，0.02%蛋白酶组最高，较对照组提高了6.7%(P＜0.05)；饲粮添加蛋白酶提高了肉仔鸡的ADFI，各蛋白酶组肉仔鸡ADFI均显著高于对照组(P＜0.05)；各组之间F/G差异不显著(P＞0.05)。

表2 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of protease on growth performance of broilers
2.2 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸表观消化率的影响

由表3可知，蛋白酶可二次性提高肉仔鸡对粗蛋白质的表观消化率(P=0.005)，0.02%蛋白酶组较对照组提高了8.7%(P＜0.05)；蛋白酶可二次性提高氨基酸(亮氨酸和异亮氨酸除外)的表观消化率(P＜0.05)。

表3 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质和氨基酸表观消化率的影响 Table 3 Effects of protease on apparent digestibiliy of crude protein and amino acids of broilers

0.01%和0.02%蛋白酶组甘氨酸的表观消化率较对照组显著提高了8.8%及10.6%(P＜0.05)。所有蛋白酶组的蛋氨酸表观消化率及除0.08%蛋白酶组外其他各蛋白酶组的酪氨酸表观消化率均显著高于对照组(P＜0.05)。0.01%和0.02%蛋白酶组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸的表观消化率均显著高于对照组(P＜0.05)。所有蛋白酶组肉仔鸡粗蛋白质和天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的表观消化率均呈显著先升高后降低的二次曲线关系(P＜0.05)，其中除酪氨酸、蛋氨酸表观消化率以0.01%蛋白酶组最高外，其余均以0.02%蛋白酶组最高。 2.3 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

由表5可知，各组之间十二指肠绒毛高度差异不显著(P＞0.05)；随蛋白酶添加水平增加，十二指肠隐窝深度呈显著线性升高(P<0.05)，以0.08%蛋白酶组最深，显著深于除0.04%蛋白酶组外的其他各组(P<0.05)；随蛋白酶添加水平增加，十二指肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)呈显著线性降低(P<0.05)，其中0.08%蛋白酶组显著低于除0.04%蛋白酶组外的其他各组(P<0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶组与对照组无显著差异(P＞0.05)。

空肠形态随蛋白酶添加水平升高，绒毛高度呈二次曲线升高(P<0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶组显著高于对照组(P<0.05)，0.08%蛋白酶组与对照组差异不显著(P＞0.05)；隐窝深度呈 线性升高(P<0.05)，0.08%蛋白酶组显著高于对 照组(P<0.05)；各组之间V/C差异不显著(P＞0.05)。

回肠形态方面，各组之间绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P＞0.05)，但0.02%蛋白酶组的V/C最高，显著高于0.04%蛋白酶组(P<0.05)。

表4 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响 Table 4 Effects of protease on intestinal morphology of broilers
3 讨 论 3.1 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

本试验表明，在玉米-豆粕-肉骨粉型饲粮中添加蛋白酶，肉仔鸡ADG以0.02%蛋白酶组最高，且有显著先升高后降低的二次曲线关系，与蛋白酶添加水平升高肉仔鸡生长性能呈二次曲线变化的结果[5]相吻合，与玉米-豆粕型饲粮添加复合蛋白酶显著提高肉仔鸡ADG但不影响ADFI的结果[3]不一致。本试验结果显示，蛋白酶能显著提高8～21日龄肉仔鸡的ADFI，可能是因为蛋白酶的添加降低了食糜的黏度而有利于其在肠道的蠕动[7]。另有研究表明，蛋白酶可提高肉仔鸡对低蛋白质饲粮的利用效率[7]，改善低蛋白质对肉仔鸡生长性能造成的影响[2]，且与其他单组分型酶共同使用能有效提高肉仔鸡的ADFI和ADG[8]；单独使用时，也能达到正常蛋白质水平饲粮的饲料效率。然而本试验结果显示，虽然0.02%、0.04%蛋白酶组饲料转化效率较高，但均未显著高于对照组。其主要因可能有2点：1)饲粮类型不同。本试验采用玉米-豆粕-肉骨粉型饲粮，而以往的研究除玉米-豆粕型[2]外，主要成分还涉及小麦[9]、黑小麦[10]和干酒糟及其可溶物(DDGS)[11]等，对于不同的作用底物，蛋白酶作用效果不尽相同。2)试验设计不同。本试验采用正常蛋白质、能量水平的饲粮，与低蛋白质饲粮相比，饲料转化效率的改善效果可能不够明显，具体原因还有待进一步探究。本试验结果提示，饲粮添加0.02%蛋白酶即可改善肉仔鸡生长前期生长性能。

3.2 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸表观消化率的影响

蛋白酶可提高断奶仔猪的饲粮氨基酸表观消化率[12]，提高生长育肥猪氮的回肠表观消化率[13]，提高肉仔鸡粗蛋白质[2]、能量[14]、氮[15]、淀粉[15]和脂肪酸[10]的表观消化率和真代谢能的利用率[14]。本试验探讨了蛋白酶对粗蛋白质和17种氨基酸的表观消化率，结果表明，正常营养水平的玉米-豆粕-肉骨粉型饲粮中添加不同水平蛋白酶可影响21日龄肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率，且整体呈现先升高后降低的二次曲线关系，以0.02%蛋白酶组效果最佳。研究表明，饲用蛋白酶可通过补充内源蛋白酶的不足，并与之协同作用来提高蛋白质利用效率[16]。本试验肉仔鸡氨基酸利用率的提高，可能由于肉仔鸡生长前期的消化系统发育还不够完善，适量添加外源蛋白酶后补充了内源蛋白酶的分泌不足。但当添加超过一定水平后，则可能反馈性的抑制内源蛋白酶分泌，影响消化酶的活性[17]，故本试验中高添加水平的蛋白酶未起到提高营养物质消化率的作用。本试验结果表明，0.01%、0.02%蛋白酶组可提高生长前期肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率。

3.3 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

家禽小肠绒毛是各种养分吸收的主要场所。小肠绒毛高度与细胞数量相关，绒毛变长则扩大细胞表面积，有利于营养物质吸收；绒毛短时成熟的绒毛细胞减少，对养分的吸收能力降低。隐窝深度反映了细胞增殖率，隐窝变浅表明肠上皮细胞成熟率上升，吸收功能增强。因此V/C可综合反映小肠的功能状态，V/C上升则表示黏膜得到改善，消化吸收功能增强[17]。

研究表明，适量酶制剂能提高肉仔鸡的绒毛高度[18]，但过量则不利于肉仔鸡肠道发育[17,19]。另外饲粮蛋白酶可改善球虫感染肉仔鸡肠道黏液层厚度，影响肠壁形态[20]，且与木聚糖酶共同使用可降低回肠相对长度[9]。本试验表明，饲粮中添加0.08%蛋白酶显著提高了21日龄肉仔鸡空肠隐窝深度，降低了V/C，提示高添加水平蛋白酶不利于生长前期肉仔鸡肠道的发育。0.02%蛋白酶组肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠的V/C均最高，且空肠的绒毛高度极显著高于对照组，空肠和回肠的隐窝深度显著低于对照组，可见，饲粮适宜添加水平蛋白酶有利于改善肉仔鸡肠道组织形态，提高肠道消化吸收效率。综合肠道组织形态结果可知，蛋白酶可二次性提高肉仔鸡生长前期的ADG，与适量蛋白酶改善肉仔鸡的肠道组织形态有关；高添加水平蛋白酶对肉仔鸡前期生长不利，与肠道形态发育不佳一致，也可能与蛋白酶活性降低[17]有关，但具体的确切作用机制尚需进一步研究。

4 结 论

① 玉米-豆粕-肉骨粉型基础饲粮中添加蛋白酶能显著提高肉仔鸡生长前期ADFI，提高肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率，

② 0.02%蛋白酶组有利于肉仔鸡肠道组织发育，0.08%蛋白酶组则不利于肉仔鸡肠道组织发育。

③ 本试验条件下，蛋白酶的适宜添加水平为0.02%。

参考文献
[1]GLITSØ V,PONTOPPIDAN K,KNAP I,et al.Development of a feed protease[J]. Industrial Biotechnology,2012,8(4):172-175. (2)
[2]ANGEL C R,SAYLOR W,VIEIRA S L,et al.Effects of a monocomponent protease on performance and protein utilization in 7-to 22-day-old broiler chickens[J]. Poultry Science,2011,90(10):2281-2286. (5)
[3]游金明,瞿明仁,黎观红,等.复合蛋白酶和甘露寡糖对肉鸡生长性能的影响及其互作效应研究[J]. 动物营养学报,2008,20(5):567-571. (2)
[4]PÉRON A,OWUSU-ASIEDU A,DEBICKI-GARNIER A M,et al.Effect of a xylanase,amylase and protease combination on the performance of broiler chickens fed corn-based diets[C]//Actes des 9èmes journées de la recherche avicole.Paris:Institut Technique de l'Aviculture,2011.(2)
[5]FREITAS D M,VIEIRA S L,ANGEL C R,et al.Performance and nutrient utilization of broilers fed diets supplemented with a novel mono-component protease[J]. The Journal of Applied Poultry Research,2011,20(3):222-334. (2)
[6]FRU-NJI F,LUENTER A,FISCHER M,et al.A feed serine protease improves broiler performance and increases protein and energy digestibility[J]. The Journal of Poultry Science,2011,48(4):239-246. (1)
[7]许梓荣,钱利纯.饲粮中活加复合酶制剂对肉鸡生长的影响[J]. 浙江大学学报:农业与生命科学版,1999,25(6):615-618. (2)
[8]BAREKATAIN M R,ANTIPATIS C,CHOCT M,et al.Interaction between protease and xylanase in broiler chicken diets containing sorghum distillers'dried grains with solubles[J]. Animal Feed Science and Technology,2013,182(1/2/3/4):71-81. (1)
[9]KALMENDAL R,TAUSON R.Effects of a xylanase and protease,individually or in combination,and an ionophorecoccidiostat on performance,nutrient utilization,and intestinal morphology in broiler chickens fed a wheat-soybean meal-based diet[J]. Poultry Science,2012,91(6):1387-1393. (2)
[10]AURELI R,KLUENTER A M,FRU F,et al.Efficacy of protease supplementation on apparent ileal digestibility of nitrogen and amino acid of broiler chicken fed a diet based on 40% triticale[C]//Actes des 9èmes journées de la recherche avicole.Paris:Institut Technique de l'Aviculture,2011:384-387.(2)
[11] YAN F,GARRIBAY L,ARCE J,et al.Effects of protease supplementation on broiler performance and in vitro protein digetibility[C]//Proceedings of the 23rd annual australian poultry science symposium.Sydney:Poultry Research Foundation,2012:134-137.(1)
[12]GUGGENBUHL P,WACHÉ Y,WILSON J W.Effects of dietary supplementation with a protease on the apparent ileal digestibility of the weaned piglet[J]. Journal of Animal Science,2012,90(S4):152-154. (1)
[13]MC ALPINE P O,OSHEA C J,VARLEY P F,et al.The effect of protease and xylanase enzymes on growth performance and nutrient digestibility in finisher pigs[J]. Journal of Animal Science,2012,90(S4):375-377. (1)
[14]GHAZI S,ROOKE J A,GALBRAITH H.Improvement of the nutritive value of soybean meal by protease and a-galactosidase treatment in broiler cockerels and broiler chicks[J]. British Poultry Science,2003,44(3):410-418. (1)
[15]SELLE P H,LIU S Y,CAI J,et al.Steam-pelleting temperatures and grain variety of finely ground,sorghum-based broiler diets.Ⅰ.Influence on growth performance,relative gizzard weights,nutrient utilisation,starch and nitrogen digestibility[J]. Animal Production Science,2013,53(3):339-346. (1)
[16]凌宝明,冯定远,左建军.饲用蛋白酶的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(22):7-10. (1)
[17]李慧.蛋白酶和木聚糖酶对肉鸡生长性能、消化机能及血液指标的影响[D]. 硕士学位论文.杨凌:西北农林科技大学,2010:55. (4)
[18]GRACIA M I,LAZARO R,LATORRE M A,et al.Influence of enzyme supplementation of diets and cooking-flaking of maize on digestive traits and growth performance of broilers from 1 to 21 days of age[J]. Animal Feed Science and Technology,2009,150(3/4):303-315. (1)
[19]袁玖.溢多酶对蛋鸡、肉鸡的生产效果及其作用机理研究[D]. 硕士学位论文.杨凌:西北农林科技大学,2006. (1)
[20]PEEK H W,VAN DER KLIS J D,VERMEULEN B,et al.Dietary protease can alleviate negative effects of a coccidiosis infection on production performance in broiler chickens[J]. Animal Feed Science and Technology,2009,150(1):151-159. (1)