近年来，由于水环境的恶化和病害的频发，严重影响草鱼的健康养殖，因此寻找绿色环保的免疫增强剂已成为当前水产动物营养的研究热点。谷氨酰胺(glutaminate，Gln)是近年来研究较多的营养素,它是动物体内含量最多的氨基酸,是肠黏膜细胞、淋巴细胞等快速生长的主要能源，已作为免疫增强剂在鲤鱼的试验中取得了很好的效果^[1]。但是Gln不耐热，对酸敏感，在水中溶解度低，且在溶液中易环化成有毒性的焦谷氨酸^[2]。α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)具有Gln碳架,是三羧酸循环的中心物质，它通过谷氨酸脱氢酶或转氨酶作用生成谷氨酸，并能进一步通过谷氨酰胺合成酶迅速形成Gln^[3]。AKG既是Gln的前体物，又有无毒稳定的特点，因此它可能成为Gln的最佳替代物。研究表明，AKG能促进机体蛋白质的合成，增强机体免疫力，防止疾病感染，可作为饲料添加剂来减轻畜禽动物生产过程中的代谢应激^[4,5]。位莹莹等^[6]研究发现，饲料中添加适量的AKG可以在一定程度上提高松浦镜鲤的增重率和蛋白质效率，降低饲料系数，促进鱼体蛋白质和脂肪代谢。

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是细胞受到各种刺激时产生的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族，普遍存在于原核和真核生物细胞中^[7]。研究表明，热休克蛋白70(HSP70)具有多项功能，主要包括协助新生蛋白质的折叠，参与细胞内蛋白质的转运，参与免疫复合物的形成和分解，降解冗余蛋白质。在医学上，HSP70具有排斥和治疗传染病，促进免疫反应的作用^{[8,9,10,11,12]}。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxi someproliferator activated receptor gama，PPARγ)是一类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖物作为配体激活的核转录因子，可通过与配体结合、活化，调节脂肪代谢，改善胰岛素抵抗，调节炎症、免疫以及细胞分化等^[13,14,15]。研究表明，Gln能提高人肺巨噬细胞和上皮细胞HSP70和热休克蛋白72(HSP72)mRNA的表达，从而抵抗脓毒的损伤作用^[16,17]；能通过调节仔猪PPARγ mRNA的表达缓解断奶应激产生的炎症^[18]。但AKG能否通过调控HSP70、PPARγ mRNA的表达来提高草鱼抗应激和免疫能力尚未见报道。本试验拟采用实时荧光定量PCR方法检测饲料中添加不同浓度的AKG后HSP70和PPARγ mRNA在草鱼不同组织的表达及其规律，以期为AKG作为鱼类抗应激饲料添加剂和免疫增强剂的开发提供理论参考。

根据《草鱼配合饲料营养标准》(SC/T 1024—1997)配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。试验饲料所用AKG购自上海海曲化工有限公司，纯度为99%，参照虹鳟稚鱼^[19]、全雄奥尼罗非鱼^[20]中Gln的添加标准，按质量分数0.25%、0.50%、0.75%、1.00%分别等量替换基础饲料中的次粉。所有饲料原料先粉碎至全部通过0.425 mm的筛，微量成分采取逐级扩大法混合均匀后，所有饲料原料经充分混合，然后经SLX-80型颗粒饲料机制成直径为2.5 mm的颗粒料，自然风干后置于-20 ℃冰柜中保存备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 2.0 豆油 Soybean oil 1.0 豆粕 Soybean meal 18.0 棉籽粕 Cottonseed meal 20.0 菜籽粕 Rapeseed meal 20.0 油糠 Oil bran 10.0 次粉 Wheat middling 20.0 干酒糟及其可溶物 DDGS 4.0 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.9 预混料 Premix1) 3.1 合计 Total 100.0 营养水平 Nutrient levels2) 总能 Gross energy/(MJ/kg) 15.1 粗蛋白质 Crude protein 29.5 粗脂肪 Crude lipid 4.4 粗灰分 Ash 7.6 1)预混料为每千克饲料提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 2 000 IU，VB1 5 mg，VB2 10 mg，VB6 10 mg，VB12 0.02 mg，VD3 2 000 IU，VE 100 IU，VK3 10 mg，VC 300 mg，生物素 biotin 1 mg，叶酸 folic acid 5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 40 mg，烟酸 nicotinic acid 100 mg，氯化胆碱 choline chloride 300 mg，肌醇 inositol 200 mg，抗氧化剂 antioxidant 100 mg，Cu (as copper sulfate) 3 mg，Fe (as ferrous sulfate) 150 mg，Mn (as manganese sulfate) 13 mg，Zn (as zinc sulfate) 34 mg，I (as potassium iodide) 5.50 mg，Se (as sodium selenite) 0.50 mg。 2)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

试验用草鱼购于湖南省水产科学研究所，为同批鱼种。选取平均体重为(35.66±0.39) g的健康草鱼450尾，随机分为5组(每组3个重复，每个重复30尾鱼)：对照组饲喂基础饲料，试验组分别饲喂添加0.25%、0.50%、0.75%、1.00% AGK的试验饲料。

养殖试验在湖南农业大学水产养殖基地室外养殖池塘进行。试验前，将所有试验鱼集中驯养10 d，使其适应试验环境和试验饲料。试验开始时将鱼称重分组，并调整至各组间初始体重差异不显著(P>0.05)。试验鱼以重复为单位饲养于1 m×1 m×1 m的网箱中，为期60 d。分别于每天08：00和16：00进行投喂，日投喂量为鱼体重的2%～4%，观察并记录试验鱼的摄食及活动状况。试验期间，水温为28~32 ℃，pH为6.7~7.2，溶氧浓度在5.0 mg/L以上。不定期对网箱进行清洗，尽量排除外界因素对试验结果的干扰。

饲养试验结束后，停食24 h，以网箱为单位称 重，然后每箱随机取接近平均体重的鱼3尾，丁香油麻醉，用灭菌的解剖工具分别取第3鳃弓、肝胰脏、肾脏、脾脏，液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

参照陈亮等^[21]的方法，以β-肌动蛋白(β-actin)mRNA序列作为内参基因，根据NCBI中草鱼的HSP70、PPARγ基因序列登录号(分别为GU475146、GU997136)，用Primer 5.0软件设计引物(表2)。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 HSP70、PPARγ和β-actin的引物设计 Table 2 Primer design for HSP70,PPARγ and β-actin 基因 Genes 引物序列 Primer sequence 产物大小 Product size/bp 热休克蛋白70 HSP70 上游引物：5′-CCAGACCTTCACCACCTACTCT-3′ 下游引物：5′-CTCTTTTCCAGTGCTTTTGTCC-3′ 220 过氧化物酶体增殖物激活受体γ PPARγ 上游引物：5′-CTGAAGACCAACCATCCAGAC-3′ 下游引物：5′-GTGTAAGCACCAGTCCAACTCC-3′ 138 β-肌动蛋白 β-actin 上游引物：5′-CGTGACATCAAGGAGAAG-3′ 下游引物：5′-CAGTTGAAGGTGGTCTCAT-3′ 116

表2 HSP70、PPARγ和β-actin的引物设计 Table 2 Primer design for HSP70,PPARγ and β-actin >

用天恩泽动物组织提取试剂盒进行总RNA的提取，所有过程均在无菌操作台上严格按照操作说明书进行。采用核酸蛋白质测定仪分别于260和280 nm处检测提取的总RNA的浓度和纯度。cDNA合成按照ReverAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明书进行，反应结束后-20 ℃保存备用。

实时荧光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ染料法，按照SYBR Premix EX Taq^TM(TaKaRa公司)操作说明书在ABI 7300实时荧光定量PCR仪上进行扩增。20 μL反应体系为：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH₂O 5.8 μL，SYBR Premix EX Taq^TM 10 μL，ROX Reference 0.6 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，61 ℃ 31 s，共40个循环。PCR扩增完成后用熔解曲线分析法确定产物特异性。

所有样品的cDNA各取1 μL混匀后，进行10倍系列稀释，选取6个稀释度进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个稀释度设3个重复，根据6个稀释系列实时荧光定量PCR反应结果，以循环阈(threshold cycle，Ct)值为纵坐标，以稀释倍数值为横坐标，获得相对定量标准曲线。β-actin、HSP70和PPARγ的标准曲线分别为Y=-3.182 6X+14.944、Y=-3.191 8X+30.881和Y=-3.217 5X+15.632，相关系数分别为0.991 5、0.992 3和0.994 5，根据公式扩增效率=10^(-1/斜率)-1计算出三者的扩增效率分别为1.061 5、1.057 3和1.045 5，符合实时荧光定量PCR中双Ct法对扩增效率的要求^[22]。

用公式2^{-(△△Ct)[22]}计算各基因mRNA的相对表达量，试验数据用Excel 2003初步整理后，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较，试验结果用平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

统计分析结果(图1、图2)表明，HSP70、PPARγ mRNA在对照组草鱼的肝胰脏、肾脏、鳃和脾脏中均有表达，且在各组织间的相对表达量存在差异。二者均在肾脏中高度表达，且在肾脏中的相对表达量显著高于脾脏、鳃中(P<0.05)。HSP70 mRNA的相对表达量在肾脏、肝胰脏、脾脏、鳃中依次降低，而PPARγ mRNA的相对表达量在肾脏、肝胰脏、鳃、脾脏中依次降低。

图1(Fig. 1)

图1 HSP70 mRNA在不同组织中的相对表达量 Fig.1 Relative expression level of HSP70 mRNA in different tissues

图2(Fig. 2)

图2 PPARγ mRNA在不同组织中的相对表达量 Fig.2 Relative expression level of PPARγ mRNA in different tissues

统计分析结果(表3)表明，饲料中添加AKG极显著影响HSP70 mRNA在草鱼鳃和脾脏中的表达(P＜0.01)，显著影响HSP70 mRNA在草鱼肾脏中的表达(P＜0.05)，而对HSP70 mRNA在草鱼肝胰脏中的表达无显著影响(P＞0.05)。与对照组相比，0.25%、0.50%和0.75% AKG组鳃中HSP70 mRNA的相对表达量虽有所增加，但差异不显著(P＞0.05)，而1.00% AKG组鳃中HSP70 mRNA的相对表达量则极显著增加(P＜0.01)；饲料中添加AKG显著降低了HSP70 mRNA在肾脏中的相对表达量(P＜0.05)，但各AKG添加组间差异不显著(P＞0.05)；随着饲料中AKG添加量的增加，HSP70 mRNA在脾脏中的相对表达量规律性不明显，但0.75% AKG组脾脏中HSP70 mRNA的相对表达量最高，并极显著高于其他各组(P＜0.01)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中添加AKG对草鱼HSP70 mRNA相对表达量的影响 Table 3 Effects of dietary AKG on HSP70 mRNA relative expression level of grass carp 项目 Items 对照组 Control group α-酮戊二酸添加量 AKG supplemental level/% P值 P-value 0.25 0.50 0.75 1.00 鳃 Gill 1.000±0.198Aa 3.300±0.754Aa 3.145±0.615Aa 2.465±0.219Aa 82.134±6.115Bb 0.001 肝胰脏 Hepatopancreas 1.000±0.243 1.255±0.021 0.135±0.025 1.005±0.192 1.117±0.283 0.345 肾脏 Kidney 1.000±0.195b 0.101±0.027a 0.083±0.021a 0.178±0.045a 0.148±0.032a 0.013 脾脏 Spleen 1.000±0.215Aa 0.357±0.081Aa 1.946±0.457Aa 3 301.245±745.254Bb 107.541±31.824Aa 0.000 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 饲料中添加AKG对草鱼HSP70 mRNA相对表达量的影响 Table 3 Effects of dietary AKG on HSP70 mRNA relative expression level of grass carp

统计分析结果(表4)表明，饲料中添加AKG极显著影响PPARγ mRNA在草鱼肝胰脏中的表达(P＜0.01)，显著影响PPARγ mRNA在草鱼鳃、脾脏、肾脏中的表达(P＜0.05)。随着饲料中AKG添加量的增加，PPARγ mRNA在肝胰脏中的相对表达量规律性不明显，但0.25% AKG组肝脏中PPARγ mRNA的相对表达量最高，并极显著高于其他各组(P＜0.01)；与对照组相比，各AKG添加组鳃中PPARγ mRNA的相对表达量均有所增加，但仅1.00% AKG组与对照组达到显著差异(P＜0.05)；饲料中添加AKG显著降低了PPARγ mRNA在肾脏中的相对表达量(P＜0.05)，但各AKG添加组间差异不显著(P＞0.05)；随着饲料中AKG添加量的增加，PPARγ mRNA在脾脏中的相对表达量规律性不明显，但0.75% AKG组脾脏中PPARγ mRNA的相对表达量最高，并极显著高于其他各组(P＜0.01)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料中添加AKG对草鱼PPARγ mRNA相对表达量的影响 Table 4 Effects of dietary AKG on PPARγ mRNA relative expression level of grass carp 项目 Items 对照组 Control group α-酮戊二酸添加量 AKG supplemental level/% P值 P-value 0.25 0.50 0.75 1.00 鳃 Gill 1.000±0.248a 1.863±0.341a 1.180±0.192a 1.475±0.219a 84.260±26.116b 0.021 肝胰脏 Hepatopancreas 1.000±0.225Aa 7.805±0.502Bb 0.240±0.063Aa 0.899±0.286Aa 1.083±0.243Aa 0.007 肾脏 Kidney 1.000±0.191b 0.011±0.001a 0.007±0.001a 0.011±0.009a 0.016±0.004a 0.024 脾脏 Spleen 1.000±0.232a 0.975±0.256a 0.706±0.134a 120.174±34.943b 18.605±4.943a 0.012

表4 饲料中添加AKG对草鱼PPARγ mRNA相对表达量的影响 Table 4 Effects of dietary AKG on PPARγ mRNA relative expression level of grass carp

HSP70作为HSP家族中起重要作用的一员，关于其功能方面的研究已经有很多报道，在哺乳动物中都集中于其作为分子伴侣的作用，即帮助蛋白质折叠以及蛋白质转运^[23]。HSP70还具有保护细胞免受损伤，增强机体对应激的抵抗力的作用；同时，其在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中也起着重要作用^[24]。Lee等^[25]研究发现，HSP70的过量表达可以调节和抑制间质金属蛋白酶(应激时产生的一种丝氨酸蛋白酶，能加速细胞死亡和组织损伤)的活性来减少细胞、组织在缺氧应激情况下的损伤。Nakano等^[26]研究发现，当潮间带杜父鱼体内HSP70含量较高时，机体具有更强的抗应激能力，能适应较大范围的温差变化。HSP70在细胞内的高表达或数量的增多可以改善细胞的生存能力，提高应激耐受力。石君霞等^[27]研究发现，PPARγ对缓解仔猪炎症反应有一定作用，PPARγ可抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等促炎症细胞因子的形成，通过调控这些细胞因子的释放，从而减轻炎症反应。研究表明，PPARγ信号是重要的免疫调节途径，PPARγ信号影响着吞噬作用、细胞因子的生成及 抗原呈递^[15,28]。本试验结果表明，草鱼免疫器官 肾脏和主要代谢器官肝胰脏中HSP70、PPARγ mRNA的相对表达量均较高，这与周小飞^[29]、陈亮等^[21]的研究结果相似，与HSP70和PPARγ主要参与免疫反应和代谢调控的功能相符。在脾脏中，饲料中AKG添加量为0.75%时，HSP70和PPARγ mRNA相对表达量显著或极显著高于对照组。这说明在草鱼饲料中添加适量的AKG能上调HSP70和PPARγ mRNA的表达，草鱼的应激耐受力和免疫能力呈现上升的趋势，从而有利于草鱼的生长。本试验的生长性能数据和免疫指标数据也表明在饲料中添加适量AKG后草鱼免疫能力增强，生长性能显著提高^[30]。本试验中，各AKG添加组草鱼肾脏中HSP70和PPARγ mRNA的相对表达量均显著低于对照组，这是否是由于肾脏可能通过某些特殊的负调控机制参与HSP70和PPARγ mRNA的表达调控还有待进一步探讨。
4 结 论

① HSP70和PPARγ mRNA的相对表达量在草鱼不同组织中存在差异，二者均在肾脏中高度表达，HSP70 mRNA的相对表达量在肾脏、肝胰脏、脾脏、鳃中依次降低，而PPARγ mRNA的相对表达量在肾脏、肝胰脏、鳃、脾脏中依次降低。

② 饲料中添加AKG显著或极显著影响HSP70 mRNA在鳃、肾脏、脾脏中的表达和PPARγ mRNA在鳃、肝胰脏、肾脏、脾脏中的表达。

③ 建议草鱼(体重在35 g左右)饲料中AKG的添加量为0.75%。