在动物机体中存在2类抗氧化防御体系，包括酶类反应系统和非酶类反应系统。非酶类反应系统主要为具有还原性的小分子物质，如维生素C、一些巯基化合物、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)等物质在体内与过氧化物、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等发生氧化还原反应来起到抗氧化的效应。但通过过量补充此类小分子还原性物质的抗氧化试验并未取得很好的预期效果^[1]。动物机体抗氧化的最主要且根本的措施则是另一类——酶类反应系统，它包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和转化活性物质的Ⅱ相解毒酶系统(phase Ⅱ enzymes)，如醌氧化还原酶-1(NQO1)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，而在动物机体中它们被证实普遍都受到Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)途径的控制，而该途径为实现适度、可控的畜禽抗氧化过程的调节开辟了新途径。

ARE位于频谱细胞保护基因的上游启动子区域，是一个特异的DNA-启动子结合序列^[2]，它调控下游多种基因的表达，包括有：Ⅱ相解毒酶基因(如NQO1、GST等)、抗氧化蛋白类基因(如SOD、CAT、GSH等)、蛋白酶体/分子伴侣类基因(如26S蛋白酶体的20S核心颗粒中的关键催化亚单位psmb5^[3]、含热休克蛋白在内的某些分子伴侣家族^[4,5]等)、抗炎因子类基因(如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、血红素加氧酶-1等)和其他特殊基因(如多向性耐药蛋白1-2^[6]等)。这些基因多数与机体的抗氧化、抗炎症有关，对维护机体的氧化与抗氧化平衡，维持机体氧化还原的稳态有着关键的作用。

Nrf2是CNC(cap‘n’collar)转录因子家族成员，且是其中活力最强的转录调节因子，在生物体多脏器中均高度表达，具有一个高度保守的碱性亮氨酸拉链结构(leucime zipper，bZIP)^[7,8]。Nrf2蛋白分子含有6个不同的功能区域，分别被命名为Neh1~Neh6，如图1所示^[2,9]。Neh1区含有一个C端bZIP结构，能够与细胞核内的小Maf蛋白(small Maf proteins，sMaf)结合，从而识别ARE上的特定基序而结合到ARE上，启动目标基因表达^[10]；Neh2区是Nrf2与Keap1的结合位点，其上的ETGE基序对这一过程起着至关重要的作用^[11]；Neh3、Neh4、Neh5区可与一些转录激活剂，如cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CBP)、组蛋白乙酰基转移酶等作用，启动靶基因转录及上调靶基因表达^{[1, 2, 12]}；Neh6区是氧化还原非敏感区，有大量丝 氨酸残基，对Nrf2有不依赖于Keap1的负调控作用^[13,14]。

Keap1是一个与胞浆肌动蛋白结合的多肽，同时也是Nrf2在细胞质中的结合蛋白，主要通过结合Nrf2使之无法进入细胞核，从而抑制Nrf2的活性，对Nrf2起负调控作用，被认为是机体氧化应激的感受器^{[1, 2, 15]}。Keap1包含5个区域(如图1所示^[2,9])，分别为：N端结构域(NTR)、C端区域(CTR)、插入结构域(IVR)、BTB/POZ结构域和Kelch/DGR(double glycine repeat)结构域。Kelch/DGR区含有6个双链甘氨酸重复片段，既是Keap1与胞浆肌动蛋白的结合位点，也是其与Nrf2的结合位点^[16]；BTB/POZ结构域介导Keap1二聚体化并与其跟Nrf2的结合力有关，并且参与Nrf2的泛素化降解过程^[2,17]；IVR区富含半胱氨酸残基，对氧化信号敏感，因此Keap1与亲电化合物及氧化剂的反应就发生在该区^{[2, 17, 18]}，IVR区亦参与泛素连接酶形成，与Nrf2稳定性有关^[15,17]。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 Keap1、Nrf2的结构域和功能 Fig.1 Domain structure and function of Keap1 and Nrf2[2,9]

在正常的生理状态下，Nrf2的Neh2区通过ETGE基序在胞浆中与含有6个双链甘氨酸重复片段的固定在胞浆肌动蛋白上Keap1的Kelch/DGR区相结合，并且依靠26S蛋白酶体的降解作用维持低含量非活性的稳定状态，此状态下Nrf2无法由细胞质进入细胞核激活下游基因表达^{[9, 16, 19]}；目前认为的Nrf2激活方式有竞争性抑制激活(如前胸腺素α等物质与Keap1的结合能力超过Nrf2从而使Nrf2活化)、降低Nrf2的降解激活(如通过蛋白酶体抑制剂抑制其对Nrf2的降解)等方式^[1]，不过并未获得共识，而有研究还认为Nrf2本身可能也含有氧化应激感受器，但缺乏有力证明^[20]。而现今公认的Nrf2活化的2种主要方式如图2所示^[21]，即当氧化性分子和亲电物质等与Keap1的IVR区反应(IVR区的半胱氨酸残基担负着对应激信号主要的传感作用，其机制是Cys273和Cys288的2处半胱氨酸残基突变为丙氨酸和丝氨酸，导致Nrf2泛素化降低，稳定性升高^[22])使Nrf2活化或是Nrf2在多种蛋白激酶途径中其自身被磷酸化而激活，且目前多认为不同的细胞类型和刺激方式使得Nrf2磷酸化激活的途径不同，如有促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、胰腺内质网激酶(PERK)等几条蛋白激酶途径参与了Nrf2的激活^[23,24,25]。活化的Nrf2不会被蛋白酶体降解并进入细胞核内与小Maf蛋白等其他的bZIP蛋白质结合成异二聚体，之后识别到ARE元件上，并在CBP等转录激活剂、分子伴侣的帮助下，启动ARE下游一系列抗氧化解毒酶类基因的转录表达，提高机体抗氧化能力^[2]。

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图2 亲电试剂或氧化刺激激动Keap1/Nrf2/ARE示意图Fig.2 Schematic overview of Keap1/Nrf2/ARE activation by electrophiles or oxidative stress[21]

自由基介导的氧化应激广泛参与众多病理生理变化，对畜禽生产、肉品质及健康有着极大的负面影响。Nrf2介导的生物机体内源抗氧化途径作为机体最重要的抗氧化、抗炎症措施与动物体的产品品质及健康保护息息相关。

目前，蛋白酶体与肉嫩度等品质的关系已逐渐开始被认识到^[26]，蛋白酶体不仅能够破坏肌原纤维结构，水解肌原纤维蛋白，而且在尸僵后肉的成熟过程中(死后7 d，pH<6.0)，蛋白酶体依然保持很高的多种酶或酶样活性^[27]，而蛋白酶体的亚单位蛋白合成能力随衰老和氧化应激而下降，而且26S蛋白酶体20S核心颗粒中14个亚单位蛋白中12个的表达随着Nrf2激活诱导剂的加入而升高^[3,4]，表明Nrf2可能通过对蛋白酶体产生作用而影响畜禽肉品质。

王成等^[28]研究肉仔鸡卫星细胞氧化应激时发现在地塞米松诱导的肉仔鸡胸肌骨骼肌卫星细胞产生的氧化应激过程中，p38 MAPK通路起着关键作用。不过目前将畜禽的肉品质与Nrf2直接相关联的研究报道还十分少见，仅见胥蕾^[29]从SOD、GST和调控它们表达的MAPK-Nrf2/ECH(chicken erythroid-derived CNC-homology factor，鸡中的Nrf2同源蛋白)-ARE信号通路的角度着手，研究了不同致晕方法(电致晕和气致晕)对肉仔鸡肌肉在储存期间肉色和脂质氧化的影响及脂质过氧化物清除的机制，其结果显示在致晕处理中，G40%(40%二氧化碳致晕)和E65 V(65 V电致晕)都有维护储存期肉色稳定的效果。但其中E65 V通过升高血清尿酸水平，激活MAPK-Nrf2信号通路及该通路下游的SOD和GST的基因表达，增强了抗氧化能力，缓解了肉品在储存期间的脂质过氧化，而G40%由于屠宰初期对上述基因的表达发生抑制，显示适应性较低，肉品在储存期间受到更强的氧化损伤，这不仅说明E65 V电致晕对保存期肉品质有更优的效果，更充分说明Nrf2/ECH介导的机体抗氧化途径抑制脂质过氧化，对提升畜禽肉质有重要作用。

应激根据应激原不同分为冷应激、热应激、断奶应激、噪声应激等^[30]，机体的应激反应可能造成机体的氧化还原状态失衡，如宋小珍等^[31]和王妍琪^[32]分别报道了热应激均导致了肉牛和肉仔鸡机体产生了明显的氧化损伤，且机体中多种抗氧化酶活性呈先降低后缓慢升高的态势；又如Shustanova等^[33]研究发现，冷应激通过改变生物体的促氧化和抗氧化间的平衡，降低髓过氧化酶活性等，使机体产生过多的自由基，脂质过氧化作用增强，诱发氧化损伤，王金涛等^[34,35]进一步研究发现急性冷应激时雏鸡的总抗氧化能力(T-AOC)在下丘脑、腓肠肌及血清中均呈下降趋势，且下丘脑GSH-Px活性随应激时间的延长逐渐降低，但血清中GSH-Px活性变化规律则反之。急、慢性冷应激条件下，雏鸡下丘脑与血清SOD、CAT活性降低，但随应激时间的延长又代偿性渐缓升高，黄芳芳^[36]在间歇低温刺激对肉鸡抗氧化功能等的研究中也得到了类似结论。而动物机体中各种抗氧化酶的表达及活性均受到Keap1-Nrf2-ARE通路的精密调控，上述各不同应激条件下动物机体中多种抗氧化酶活性的变化都说明Nrf2参与了动物机 体的抗应激及抗由应激造成的氧化损伤的过程。同时刘晓丹^[37]在对肉鸡冷应激相关基因的mRNA表达谱分析及差异表达基因的研究中，通过Pathway分析表明差异表达的基因主要富集在MAPK信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、氧化磷酸化、过氧化物酶、糖酵解/异生等过程中，提示肉鸡在冷应激条件下可能通过激活的MAPK、磷脂酰肌醇等通路中的激酶使Nrf2磷酸化而激活，进而由Nrf2启动ARE下游的一系列抗氧化、解毒酶类表达从而使机体抵抗因冷应激而产生的氧化损伤。

目前，在医学上利用无毒或毒性较低的天然化合物通过调控Keap1-Nrf2-ARE途径来保护多脏器，实现抗氧化、抗炎症以及抑癌等的研究方兴未艾。在现代畜禽生产中，通过开发动物体的新型绿色保健药物或是天然饲料添加剂来激活机体内源的抗氧化、抗炎症机制，调节畜禽机体的氧化还原平衡，提高畜禽生产性能，保持畜禽健康和肉品质的研究亦极具潜力。如表1所示，总结介绍了近年来研究的多种对机体抗氧化及对Nrf2-ARE途径具有激动诱导作用的天然产物。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 具有激活Nrf2抗氧化途径作用的天然产物Table 1 Natural products activate of the Nrf2 antioxidant response pathway 名称 Names 种类 Type 来源 Source 试验模型 Experiment model 试验效果 Experiment effect 剂量 Dose 研究者 Researcher 莱菔硫烷 SFN 异硫 氰酸酯 十字花 科植物 小鼠 十二指肠和膀胱中GST 和NQO1活性提高 40 μmol/ (kg·d) Munday 等[38] 维生素E Vitamin E 生育酚 乙酸酯 来源 广泛 肉仔鸡 (骨骼肌中) 添加2周上调腿肌 MAPK-P38、ECH表达； 添加3周上调胸肌、腿肌 ECH表达 饲粮添加 200 mg/kg 胥蕾[29] 羟基红花黄素A HSYA 单查尔酮苷 类结构 化合物 菊科植 物红花 H9c2 心肌细胞 上调HO-1表达；升高细 胞核蛋白中Nrf2含量 20 μmol/L 刘善新[39] 葛根素 Puerarin 黄酮类 豆科植 物葛、野葛 的根 大鼠黑质 神经细胞 剂量依赖型提高GSH、 CAT活性及提高Nrf2 蛋白含量 20、40、 80 mg/kg，持 续灌胃给药 30 d 黎荣等[40] 姜黄素Curcumin 多酚 姜黄根茎等 大鼠 大鼠肝中GSH、SOD活性升高，Nrf2蛋白表达升高 持续灌胃给药6周，50 mg/(kg·d) 李兵兵等[41] 茶多酚Tea polyphenols 茶叶等 HepG2-C8细胞株 激活所有MAPK家族激酶，ARE-荧光素酶活性升高 25 μmol/L Chen等[42] 槲皮素Quercetin 八角莲、红麻等 HepG2细胞株 Nrf2的mRNA和蛋白表达升高 40 μmol/L Tanigawa等[43] 白藜芦醇Resveratrol 葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物 PC12细胞株 Nrf2活性提高，HO-1的表达及活性上升 15 μmol/L Chen等[44] 二烯丙基硫醚/二硫/三硫 Diallyl sulfide 二烯丙基硫化物 葱属蔬菜 HepG2细胞株 以剂量和时间依赖性提高HO-1和NQO1表达，Nrf2蛋白表达及核转位增强 100 μmol/L；1 mmol/L Chen等[45]；Gong等[46] 番茄红素Lycopene 类胡萝卜素 番茄等 MCF-7细胞和HepG2细胞株 升高NQO1等Ⅱ相酶表达，促进Nrf2入核，促进ARE报告基因表达 2～4 μmol/L Ben-Dor等[47] 咖啡醇Cafestol 双萜化合物 咖啡 Nrf2野生型小鼠 小肠组织细胞胞浆中的NQO1和GST表达和活性提高 饲粮中添加0.025% McMahon等[48] 辣椒素Capsaicin 辣椒素类化合物 辣椒等 HepG2细胞株 PI3K表达及Nrf2活性提高，HO-1 mRNA和蛋白表达上升，NQO1表达及活性提高 200 μmol/L Joung等[49] 巴西苏木素Brazilin 苏木 HEI-OC1细胞 HO-1的mRNA和蛋白表达升高，Nrf2核转位增高 10 mmol/L Choi等[50] 胡椒碱Piperine 生物碱 胡椒、荜茇等 HEI-OC1细胞 HO-1表达升高，Nrf2核转位增高 50 μmol/L Choi等[51] 表没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG 儿茶素类单体 茶叶等 HepG2细胞株 激活MAPK，ARE-荧光素酶活性升高 25 μmol/L Chen等[42] MCF-10A细胞株 Nrf2入核及与ARE结合增强，HO-1和Mn-SOD蛋白及mRNA表达升高 100 μmol/L Na等[52] B淋巴母细胞 HO-1表达升高，Nrf2核转位增高 20 μmol/L Andreadi等[53] 牛主动脉内皮细胞 HO-1表达升高，核中Nrf2水平升高，ARE-荧光素酶活性升高 50 μmol/L Wu等[54] 肉桂醛 Cinnamaldehyde 醛类 肉桂、藿香、桂皮、风信子等 人血管内皮细胞 HO-1表达升高，Nrf2转移入细胞核增多，促进ARE报告基因表达 100 μmol/L Liao等[55] 叶绿酸 Chlorophyllin 水溶性金属卟啉类化合物 绿色叶类蔬菜等 人脐静脉内皮细胞 PIK3磷酸化增强，Nrf2在细胞核中积累增加，HO-1和NQO1表达升高 50 μmol/L Zhang等[56]

表1 具有激活Nrf2抗氧化途径作用的天然产物 Table 1 Natural products activate of the Nrf2 antioxidant response pathway

表1中列举的多种天然产物实际上有一些已开始在畜牧业中作为饲料添加剂或畜禽保健产品来使用，或是正在尝试着进行相关的开发研究，如姜黄素、茶多酚等，而另外的也极具开发潜力。除此之外，还有诸如大豆异黄酮、花青素等亦具有类似功能。利用天然产物激动机体Nrf2抗氧化途径的特性来研究、开发相应的畜禽保健品或饲料添加剂的前景十分广阔。

Nrf2介导的抗氧化途径广泛存在于畜禽机体中，并被证明与动物的生长发育极度相关。而在动物营养领域目前相关的研究主要集中在猪上。Wang等^[57]研究发现出生重低的仔猪的空肠重量极显著低于正常出生重仔猪，其空肠组织中氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)亦极显著高于正常出生重的仔猪，表明低出生重仔猪肠道发育受到抑制，同时肠道氧化应激损伤严重。Yin等^[58]研究新生仔猪受到的氧化应激及其与机体抗氧化系统的发育时发现，新生仔猪在出生时(1日龄)其血浆丙二醛、蛋白羰基化及8-羟基-(脱氧)鸟嘌呤水平均很高，表明新生仔猪在出生时受到全面且严重的氧化应激损伤，而血浆和肠道中SOD等抗氧化酶及Nrf2的基因表达及含量升高，使机体不断对抗氧化应激损伤，同时不断完善自身的内源抗氧化系统，保障机体的正常生长发育，特别是肠道等营养器官的生长发育。这些都说明Nrf2调控的抗氧化途径与畜禽的生长发育及营养代谢息息相关。

机体氧化还原水平失衡是多种疾病的病理生理基础，亦会对动物的营养代谢、抗应激能力及发育机能造成影响，进而降低畜禽生长、繁殖性能，同时氧化还原水平的失衡对畜禽的肉品质亦有危害，降低畜禽产品质量。不同于以往其他的抗氧化剂，Nrf2-ARE通路由于是细胞调控多种抗氧化酶转录表达的关键通路，能使细胞免受氧化损伤，此通路为实现有效、适度的抗氧化调控提供了新方法。而目前发现多种天然产物对Nrf2-ARE通路有激动作用，通过对这些以及对Nrf2和其调控的抗氧化通路全面、精确的了解，将为开发新型畜禽抗氧化保健品或饲料添加剂以及实现对机体内源抗氧化进行适度、有效的调控开辟新的途径。