目前，在高密度集约化水产养殖发展的同时，养殖动物疾病频发、养殖水体污染日趋严重，导致水产养殖业效益下降。传统的广谱抗生素虽然能有效控制某些病害的发生，但同时会杀灭动物体内的有益微生物，破坏内环境的微生态平衡，同时也会使细菌的耐药性增加[1]。研究发现，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、软磷脂酵素等多种胞外酶[2]。近年来，随着对枯草芽孢杆菌研究的深入，研究者发现枯草芽孢杆菌可提高奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureu)[3]、凡纳滨对虾(Pennaus vannamei)[4]和印度明对虾(Fenneropenaeus indicu)的消化酶活性和饲料转化率[5]。同时，枯草芽孢杆菌在代谢过程中能合成B族维生素及维生素E、维生素K等营养素，还能促进钙、磷吸收，提高动物的生长性能[6]。作为一种好氧益生菌，枯草芽孢杆菌的芽孢进入肠道后迅速萌发，生长过程中大量消耗消化道中的游离氧，使得肠道中好氧的有害菌生长受到抑制，厌氧的有益菌成为优势菌群[7]。枯草芽孢杆菌代谢产生的乳酸等有机酸以及乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸可维持肠道酸性环境，抑制病原菌的生长[8]。研究表明，枯草芽孢杆菌在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[9]、杂交鲟(Acipenser baeri ×Acipenser schrenkii ♀)[10]、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)[11]、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)[12]的试验中均具有提高免疫力和抗氧化功能的作用。
现阶段，饲喂枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼(genetic improvement of farmed tilapia，GIFT)生长性能、免疫力和抗氧化功能的研究尚未见报道。本试验拟用添加不同剂量枯草芽孢杆菌的饲料连续喂养吉富罗非鱼幼鱼，通过测定其生长、免疫和抗氧化相关指标以及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后168 h内的累计存活率等，评定饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼生长、免疫和抗氧化方面的作用，并确定其饲料中枯草芽孢杆菌的适宜添加量，以期为吉富罗非鱼饲料添加剂的研制以及枯草芽孢杆菌在水产健康养殖上的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验饲料参照NRC(1998)中罗非鱼的营养需求，以进口鱼粉、豆粕、菜籽粕、花生麸、面粉等为原料，配制枯草芽孢杆菌(所用枯草芽孢杆菌为湖北安琪酵母股份有限公司生产的枯草芽孢杆菌干粉，活菌数为2.4×1013 cfu/kg，生产批号：20121007)添加量分别为0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%、0.18%(对应的实际活菌数分别为0.20×102、0.69×1010、1.38×1010、2.05×1010、2.82×1010、3.55×1010、4.23×1010 cfu/kg)的7组试验饲料，并记作1(对照组)、2、3、4、5、6、7组。试验饲料组成及营养水平见表1。原料混合后通过绞肉机制成2 mm条状饲料，60 ℃恒温箱中烘干5 h后，密封冷藏保存。使用前将条状饲料破碎，经10和2目筛网2级过筛后分成3种不同规格的小颗粒饲料待用。
1.2 试验鱼和饲养管理试验用吉富罗非鱼幼鱼由广西省水产研究所提供。选取规格均匀的平均体长(2.80±0.03) cm、平均体重(0.43±0.02) g的试验鱼1 050尾，驯养7 d后随机分为7组，每组设3个重复，每个重复50尾。以重复为单位分养到21个室 外水泥池(1.5 m×1.5 m×1.0 m)中，试验期为56 d。
水源为曝气去氯后的自来水，养殖过程中每天保持24 h充氧。每天09:00和17:00各投饲1次，投饲量为鱼体重的5%～7%。每天早上吸污后，换水1/4并记录水温。试验期间平均水温为(27.6±0.8) ℃，溶氧(DO)浓度为(7.10±0.19) mg/L，pH为6.9±0.1，氨氮(NH3-N)浓度为(0.04±0.01) mg/L。
1.3 指标检测养殖试验结束后，试验鱼停饲24 h后称重，计算增重率、特定生长率和饲料系数。每池随机取鱼10尾，解剖，完全分离脾脏，用生理盐水稍加冲洗，吸水纸吸干表面水分后准确称重，计算脾脏指数。另每池随机取鱼10尾，迅速抽血4~5 mL置于4 ℃冰箱中静置2~4 h，待血液凝固析出血清后，用台式离心机4 ℃离心15 min(3 000 r/min)，分离出血清，置于-40 ℃冰箱中保存，用于测定免疫和抗氧化指标。血清溶菌酶(lysozyme,LSZ)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性，总抗氧化力(total anti-oxidation capacity,T-AOC)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量由南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定，并严格按照试剂盒的操作说明进行。血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性，补体3(complement 3,C3)、总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLB)含量均采用全自动生化分析仪进行测定。
1.4 人工攻毒试验所用的病原为嗜水气单胞菌，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)。将嗜水气单胞菌接种在FWA培养基(蛋白胨5 g/L、牛肉膏2.5 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖1 g/L、NaCl 15 g/L、MgSO4 0.05 g/L、K2HPO4 0.2 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.2~7.4)上，30 ℃培养36 h后，用0.85%的无菌生理盐水洗脱菌体，调整菌液浓度为4.96×107 cfu/mL。在56 d的养殖试验结束后，每池随机取10尾鱼，经胸鳍基部注射0.3 mL嗜水气单胞菌活菌悬液，进行攻毒试验，分别记录攻毒后1、24、48、72、96、120、144、168 h的死亡情况，计算累计存活率。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % |
增重率(%)=100×(Wt－W0)/W0;
特定生长率(%/d)=100×(lnWt－lnW0)/t;
饲料系数=It/(Wtt－W0t+Wdt);
脾脏指数(%)=100×Ws/Wt;
攻毒后累计存活率(%)=100×Xt/X0。
式中：W0为试验开始时鱼体平均重量(g)；Wt为试验结束时鱼体平均重量(g)；W0t为试验开始时鱼体总重量(g)；Wtt为试验结束时鱼体总重量(g)；Wdt为试验中死亡鱼体总重量(g)；Ws为试验结束时脾脏平均重量(g)；It为总摄食量(g)；t为饲养时间(d)；X0为开始攻毒时试验鱼的尾数；Xt为攻毒t时间后试验鱼的存活尾数。
1.6 数据统计与分析试验结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。数据用SPSS 15.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较，检验组间差异的显著性，显著水平为P<0.05。
2 结 果 2.1 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响由表2可知，饲料中添加0.03%~0.18%枯草芽孢杆菌后，试验鱼的增重率和特定生长率均有所升高，且以7组升高最多，分别为(10 851.67±851.87)%、(8.38±0.14)%/d，但各试验组与对照组均没有显著差异(P>0.05)。从数据上看，各试 验组的饲料系数都小于对照组，但在统计学上无 显著差异(P>0.05)。
| 表2 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary Bacillus subtilis on growth performance of juvenile GIFT |
由表3可知，饲料中添加0.03%~0.18%枯草芽孢杆菌后，试验鱼的脾脏指数以及血清LSZ、ALP活性均有所升高。其中，脾脏指数以4组为最高，显著高于1、2、3组(P<0.05)，但与5、6、7组差异不显著(P>0.05)；血清LSZ、ALP活性在6组达到最高，分别为486.89 U/mL、37.00 U/L，显著高于1、2组(P<0.05)，但与5、6、7组差异不显著(P>0.05)。血清C3含量先随枯草芽孢杆菌添加量的升高而升高，在6组时有所降低，而后在7组回升并达到最大，4、5组次之，随后是6组，6组显著高于1、2、3组(P<0.05)，又显著低于5组(P<0.05)，但与4组差异不显著(P>0.05)；随着饲料中枯草芽孢杆菌添加量的升高，血清AST和ALT活性先呈下降趋势，在4组时有所回升，其中AST活性在5组达到最低，且显著低于1、2、4组(P<0.05)，但与3、6、7组差异不显著(P>0.05)，而ALT活性在3组达到最低，并显著低于1、2、4组(P<0.05)，但与5、6、7组差异不显著(P>0.05)。饲料中添加0.03%~0.18%枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼血清TP、ALB及GLB含量均无显著影响(P>0.05)。
| 表3 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼脾脏指数及血清免疫指标的影响
Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis on spleen index and serum immune indices of juvenile GIFT
|
由表4可知，饲料中添加0.03%~0.18%枯草芽孢杆菌后，试验鱼血清T-SOD、CAT活性及T-AOC(3组血清T-AOC除外)均有不同程度的升高。4、5、6、7组的血清T-SOD活性相对较高，并显著高于1、2组(P<0.05)，与3组差异不显著(P>0.05)，4、5、6、7组之间差异也不显著(P>0.05)。4、5、6、7组的血清CAT活性相对较高，除5组与3组差异不显著(P>0.05)外，4、5、6、7组均显著高于1、2、3组(P<0.05)，4、5、6、7组之间差异不显著(P>0.05)。血清T-AOC在5、6、7组时显著高于其他各组(P<0.05)，且5、6、7组之间差异不显著(P>0.05)。饲料中添加0.03%~0.18%枯草芽孢杆菌后，试验鱼血清MDA含量均有不同程度的降低，以3组血清MDA含量最低，为(5.17±0.44) nmol/mL，显著低于1、2组(P<0.05)，随后有上下波动，但差异不显著(P>0.05)。
| 表4 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼血清抗氧化指标的影响
Table 4 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum anti-oxidation indices of juvenile GIFT
|
由表5可知，注射嗜水气单胞菌后168 h，试验鱼的累计存活率随枯草芽孢杆菌添加量的升高呈上升趋势，以7组的累计存活率最高，为60.00%，4、5、6、7组的累计存活率均显著高于对照组(P<0.05)。攻毒后24 h，对照组的累计存活率最低，为73.33%，试验组中2、3组最低，均为76.67%，7组最高，为96.67%；攻毒后48 h，对照组累计存活率降至33.33%，变化幅度最大，此时所有试验组的累计存活率均显著高于对照组(P<0.05)，2组为试验组中最低(66.67%)，最高的仍为7组(86.67%)；攻毒后96 h，对照组累计存活率为26.67%，趋于稳定，各试验组累计存活率下降幅度较大，3组下降幅度最大，由73.33%降到43.33%，5组下降幅度最小，其次为7组；攻毒后168 h，对照组及各试验组累计存活率变化趋于稳定。由此可见，对照组试验鱼死亡多发生在攻毒后1~48 h，各试验组试验鱼死亡多发生在攻毒后48~96 h。
| 表5 饲料中添加枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌攻毒后吉富罗非鱼幼鱼累计存活率的影响 Table 5 Effects of dietary Bacillus subtilis on cumulative survival rate of juvenile GIFT challenged with Aeromonas hydrophila % |
江永明等[3]从生长及消化酶活性角度研究发现，在饲料中添加3.0×1011 cfu/kg的枯草芽孢杆菌，投喂初始体重(34.50±0.25) g的健康奥尼罗非鱼56 d，与对照组相比增重率提高了12.27%，饲料系数降低了10.92%；丁贤等[4]研究枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长的影响时发现，在凡纳滨对虾的2个生长阶段中，试验组的特定生长率均显著高于对照组；刘波等[13]研究发现，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对异育银鲫(Allogynogenetic crucian)的生长有一定的促进作用。但也有研究表明，饲料中添加0.2%的芽孢杆菌时，网箱养殖鲤(Cryprinus carpiod)的增重率和饲料利用率出现下降[14]。以上研究结果的不一致性，可能是由养殖对象和种类的差异、益生菌种类的差异、养殖方式和环境的差异以及益生菌在养殖对象消化道中适应性的差异等因素造成的。本试验中，添加不同剂量枯草芽孢杆菌的6个试验组与未添加枯草芽孢杆菌的对照组的增重率、特定生长率和饲料系数均不存在显著差异。与江永明等[3]的研究相比，本试验是以吉富罗非鱼作为研究对象，且个体为较小的幼鱼[初始体重(0.43±0.02) g]，同时本试验最大添加量为4.23×1010 cfu/kg，远低于其3.0×1011 cfu/kg的添加量，这些都可能是造成差异的原因。
3.2 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼脾脏指数及血清免疫指标的影响Newaj-Fyzul等[15]研究发现，饲料中添加1×107 cfu/g的枯草芽孢杆菌能使虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的血清LSZ活性达1 269 U/mL，显著高于对照组的438 U/mL；夏耘等[16]用含1×1010 cfu/kg枯草芽孢杆菌的饲料饲喂花鲈20 d后发现花鲈血清LSZ活性显著高于对照组。现代研究已表明，LSZ是一种能水解细菌细胞壁中黏多糖的碱性蛋白，其主要作用于革兰氏阳性菌，是机体吞噬细胞杀灭病原菌的物质基础[17,18]。有学者认为，鱼类的LSZ活性比高等脊椎动物的更强，在鱼类防御体系中扮演着重要角色[19,20,21,22]。本试验采用不同枯草芽孢杆菌添加量的饲料投喂吉富罗非鱼幼鱼，研究发现，血清LSZ活性随饲料中枯草芽孢杆菌添加量的升高而升高，在饲料中添加0.06%~0.18%的枯草芽孢杆菌能显著提高吉富罗非鱼幼鱼的血清LSZ活性，其中添加量为0.15%时血清LSZ活性达最高，为486.89 U/mL，这表明，枯草芽孢杆菌能显著提高吉富罗非鱼幼鱼的血清LSZ活性，与Merrifield等[23]对虹鳟、刘晓勇等[10]对杂交鲟、王雄等[24]对银鲫(Carassius auratus)的研究结论相似。
脾脏是鱼类主要的免疫器官之一，其重量变化在一定程度上反映着机体免疫功能的变化[25,26]。因此，本试验对各组试验鱼的脾脏指数进行了测定，结果发现，添加量为0.03%、0.06%时脾脏指数依次增高，但与对照组没有显著差异，在添加量为0.09%时达到最大值0.20%，枯草芽孢杆菌添加量为0.09%~0.18%时，各试验组显著高于对照组，且各试验组间差异不显著。这表明枯草芽孢杆菌可以刺激吉富罗非鱼鱼体的免疫器官发育，低剂量时效果不显著，当达到一定剂量后效果趋于稳定。本试验中，血清ALP的活性变化也有类似先增高后稳定的趋势，饲料中枯草芽孢杆菌添加量为0.03%~0.09%时，血清ALP活性逐渐升高，在添加量为0.12%~0.18%时，各试验组血清ALP活性均显著高于对照组，且各试验组间差异不显著。枯草芽孢杆菌对血清ALP活性的增强作用与陆家昌等[27]、朱学芝等[28]对凡纳滨对虾及刘晓勇等[10]对杂交鲟的研究结果一致，说明枯草芽孢杆菌可增强机体的免疫力。这是由于ALP是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢[29]，它可通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物破坏掉，并可修饰或改变外来异物的表面分子组成[30]，从而提高吞噬细胞的吞噬效率及对异物的降解速度，提高机体免疫力。
赵晶晶等[31]对点带石斑鱼(E. malabaricus)的研究发现，在饲料中添加枯草芽孢杆菌后，试验鱼血清C3含量与对照组相比虽有提高，但无显著差异。在本试验中，血清C3含量先随枯草芽孢杆菌添加量的升高而升高，在6组时有所降低，而后在7组回升并达到最大，饲料中枯草芽孢杆菌添加量在0.09%~0.18%时，各试验组血清C3含量显著高于对照组。本试验结果与赵晶晶等[31]的研究结果存在差异，这可能是由试验鱼的种类、规格差异造成的。
AST和ALT是肝脏受损的灵敏指标[32]。朱学芝等[28]研究发现，饲料中添加7.9×106 cfu/g的枯草芽孢杆菌能显著降低凡纳滨对虾血清AST、ALT活性。管越强等[33]对中华鳖的研究也表明枯草芽孢杆菌能显著降低其血清AST、ALT活性。本试验发现，随着饲料中枯草芽孢杆菌添加量的升高，吉富罗非鱼血清AST、ALT活性呈下降趋势，当饲料中添加0.12%~0.18%的枯草芽孢杆菌时，AST、ALT活性均显著低于对照组，且各试验组间差异不显著，与以上研究结果一致，说明枯草芽孢杆菌对肝脏具有保护作用，能降低血清中AST、ALT活性。其原因可能是，枯草芽孢杆菌进入机体后能在肠道迅速萌发，并通过生物夺氧、生物拮抗作用抑制肠道病原菌繁殖[2,7]，从而对机体起到保护作用；同时，枯草芽孢杆菌进入水体后能清除水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害物质，降低肝脏的解毒负担，对肝脏起到保护作用[34,35]。
3.3 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼血清抗氧化指标的影响T-AOC可作为脂质过氧化产物形成的抑制水平的评估指标[36]。超氧化物歧化酶(SOD)是机体清除体内超氧阴离子自由基的酶类，能够催化超氧阴离子发生歧化反应，生成H2O2和O2，CAT则将H2O2分解成H2O和O2，从而清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤[37,38]。Shen等[39]研究表明，饲料中添加5×104 cfu/g的枯草芽孢杆菌能显著提高凡纳滨对虾的血清T-AOC和SOD活性。在水体中添加枯草芽孢杆菌也能增强鱼类的血清T-AOC[40]。本试验中，饲料中枯草芽孢杆菌添加量为0.09%~0.18%时，各试验组血清T-SOD、CAT活性均显著高于对照组，且各试验组间差异不显著；饲料中枯草芽孢杆菌添加量为0.12%~0.18%时，各试验组血清T-AOC均显著高于对照组，且各试验组间差异不显著。沈文英等[9]在试验组草鱼饲料中添加1×105 cfu/g的枯草芽孢杆菌，其血清T-AOC以及SOD和CAT活性均显著高于对照组，同时试验组血清MDA含量显著低于对照组。有学者指出，MDA是体内氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而产生的重要产物，可以反映细胞受损伤程度以及脂质过氧化程度[41]，因此，血清中SOD活性和MDA含量一般呈对立关系，两者一般在血液指标测定时起到相辅相成的作用[42,43]。本试验结果表明，饲料中添加枯草芽孢杆菌可降低吉富罗非鱼幼鱼血清MDA含量，在添加量为0.06%~0.18%时，各试验组血清MDA含量均显著低于对照组。综上可知，饲料枯草芽孢杆菌添加量在0.12%~0.18%时能显著提高吉富罗非鱼幼鱼的血清T-AOC及T-SOD和CAT活性，降低MDA含量，增强机体自由基清除能力，提高机体免疫能力。
3.4 饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼攻毒后累计存活率的影响益生菌的非抗生素活性物质如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等具有免疫原性，可刺激动物免疫反应因子产生活性，诱导动物自身免疫反应，提高自身免疫力[44,45]。而Himanen等[46]研究发现，枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)和肽聚糖-磷壁酸复合物(peptidoglycan-teichoic acid complex,PG-TA)是良好的免疫佐剂，能促进动物粒细胞增殖，增强动物免疫功能。朱学芝等[28]对凡纳滨对虾、陈文典等[12]对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的研究都表明，枯草芽孢杆菌可以降低水产动物攻毒后的累积死亡率。本试验中，长期进食含枯草芽孢杆菌饲料的吉富罗非鱼幼鱼在感染了嗜水气单胞菌后，对照组病鱼死亡多发生在攻毒后1~48 h，各试验组病鱼死亡多发生在攻毒后48~96 h，病鱼死亡时间得到延缓；攻毒后168 h，病鱼累计存活率随饲料枯草芽孢杆菌添加量的增加而升高，在添加量为0.18%时达到最大值60.00%，在添加量为0.09%~0.18%时，各试验组的累计存活率显著高于对照组，其中添加量为0.12%、0.15%、0.18%的3组间差异不显著。这说明饲料中添加0.12%~0.18%的枯草芽孢杆菌可使吉富罗非鱼幼鱼对疾病的抗性得到有效提升，且作用效果趋于稳定。
4 结 论① 本试验中，饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼的生长有一定促进作用，但统计学分析效果不显著。
② 饲料中枯草芽孢杆菌添加量在0.12%~0.18%时，各试验组与免疫和抗氧化相关的血清生化指标及攻毒后168 h累计存活率都显著优于对照组，且各试验组间差异不显著，作用效果稳定。
③ 综合认为，饲料中添加0.12%~0.18%的枯草芽孢杆菌能够提高吉富罗非鱼幼鱼的免疫力和抗氧化功能，考虑到过多添加会提高成本并造成浪费，其推荐添加量为0.12%，即2.82×1010 cfu/kg。
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