乳脂是乳中重要营养物质之一，一般含量在3%~5%，其中97%可被人体吸收和利用。随着奶业的飞速发展，牛奶质量和营养价值越来越受到消费者及整个社会的关注，乳品质量关系到乳品质量安全和消费者的健康^[1]。乙酸、β-羟丁酸是瘤胃微生物发酵产生的重要短链脂肪酸，是乳腺组织脂肪酸从头合成过程重要的前体物。血液中脂肪酸前体物的浓度对乳脂合成很重要^[2]。孙满吉等^[3]研究表明，阴外动脉灌注乙酸钠可显著提高乳脂率，使乳腺摄取的乳脂前体物转化为乳脂能的效率增加。乳脂前体物不仅对乳脂的合成有影响,而且也会对乳蛋白和乳糖合成产生作用^[4]。刘仕军等^[5]在研究中发现,饲粮中添加亚油酸在一定程度上可以降低乳蛋白、酪蛋白和亚细胞器蛋白质含量。在体外试验方面，体外培养的乳腺上皮细胞是研究乳腺的发育机制、乳汁的分泌机制、乳腺生物反应器的构建以及乳腺癌发病机理的重要模型。本试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为模型，研究添加不同浓度的乙酸钠、β-羟丁酸钠以及不同配比的乙酸钠和β-羟丁酸钠对乳脂合成相关基因[乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、二酰甘油酰基转移酶(DGAT)、乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)]和乳蛋白合成相关基因[αs1酪蛋白(CSN1S1)、κ酪蛋白(CSN3)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)]表达量的影响，同时检测胞内甘油三酯(TAG)含量的变化规律，旨在为调控乳脂和乳蛋白合成提供理论依据。

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、双抗均购自美国Gibco公司；乙酸钠、β-羟丁酸钠、氢化可的松、胰岛素转铁蛋白、表皮生长因子、催乳素均购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)溶液购自美国HyClone公司；总RNA提取试剂盒RNA isoPlus、反转录PCR试剂盒Prime Script TMRT reagent Kit、实时定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；TAG试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

选取体况健康、处于泌乳高峰期的荷斯坦奶牛，采集约50 g腺泡较丰富的乳腺组织，利用胶原酶消化法获得原代BMECs。待原代细胞长满培养瓶底的70%~80%时，根据不同的贴壁时间和对胰岛素的敏感度来纯化BMECs并传代。BMECs传至第2代(P2)备用。

试验分2部分，均采用单因子完全随机试验设计。第1部分，向培养48 h的BMECs中单独添加乙酸钠或β-羟丁酸钠。乙酸钠的添加浓度分别为0(对照)、6.00、9.00、12.00和15.00 mmol/L；β-羟丁酸钠的添加浓度分别为0(对照)、0.80、1.60和2.40 mmol/L。根据第1部分的结果，筛选出能促进乳脂和乳蛋白合成的适宜的乙酸钠和β-羟丁酸钠添加浓度，开展第2部分的试验。第2部分，以乙酸钠和β-羟丁酸钠的适宜浓度为总和，设定了BMECs体外培养液中乙酸钠和β-羟丁酸钠浓度的3种不同配比，分别为1 ∶ 1、2 ∶ 1和4 ∶ 1，对照组不添加乙酸钠和β-羟丁酸钠。试验重复3次，每组均设3个重复。

将P2代细胞消化后，以8×10⁵个/瓶密度接种于培养瓶中。待细胞生长至培养瓶底的60%~70%时，添加含乙酸钠和β-羟丁酸钠的生长培养基处理48 h，利用胰蛋白酶/EDTA消化细胞，利用TAG试剂盒进行胞内TAG含量的测定。

利用实时定量PCR法检测BMECs乳脂、乳蛋白合成相关基因的表达。将P2代细胞消化后，以8×10⁵个/瓶密度接种于培养瓶中。待细胞生长至培养瓶底的60%~70%时，添加含有不同浓度的乙酸钠和β-羟丁酸钠的生长培养基，将细胞培养板置于37 ℃、5%的CO₂培养箱中继续培养48 h。利用胰蛋白酶/EDTA消化细胞，消化的细胞用PBS洗2次。细胞总RNA的提取采用试剂盒按说明进行，用分光光度计测定提取的总RNA的浓度及OD_{260 nm}/OD_{280 nm}。反转录PCR采用试剂盒按说明进行。引物序列及参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 引物序列与参数 Table 1 Primer sequences and parameters 基因 Genes 序列 Sequences GenBank登录号 GenBank accession No. 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH 上游：5′-GTTTGTGATGGGCGTGAACC-3′ 下游：5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′ XM-001252479 乙酰辅酶A羧化酶 ACC 上游：5′-GTTTGTGATGGGCGTGAACC-3′ 下游：5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′ AJ132890 脂肪酸合成酶 FAS 上游：5′-GTTTGTGATGGGCGTGAACC-3′ 下游：5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′ NM_001012699 二酰甘油酰基转移酶 DGAT 上游：5′-AAGACTGCCCTTCCATCATG-3′ 下游：5′-CGGTAGTTGGGCAGCTCATA-3′ NM_205793 乙酰辅酶A合成酶2 ACSS2 上游：5′-AGCTTGTCTTCCTTGTCCTC-3′ 下游：5′-TATTCCTACAACCACAGGGC-3′ NM_019811 过氧化物酶体增殖物激活受体 PPARG 上游：5′-ATGTCTCATAATGCCATCAGGTT-3′ 下游：5′-GATAACAAACGGTGATTTGTCTGTC-3′ NM_181024 αs1酪蛋白 CSN1S1 上游：5′-TTCCCTCTTTCATACTGTGAAGTCGT-3′ 下游：5′-GGCTATGGCTCCTAAGCACA-3′ EU908730.1 κ酪蛋白 CSN3 上游：5′-CCAGCTGCAGTTAGGTCAC-3′ 下游：5′-GGTGGAATGGCCATAAATGAT-3′ M36641.1 雷帕霉素靶蛋白 mTOR 上游：5′-TGTGGAGTTTGAGGTGAAGC-3′ 下游：5′-ATTATCAAAGAAGGGCTGCAC-3′ XM_002694043.1

表1 引物序列与参数 Table 1 Primer sequences and parameters

试验数据采用Excel 2007进行计算和整理，实时定量PCR试验结果采用2^-△△Ct法进行相对定量数据分析^[6]。利用SAS 9.0软件的ANOVA程序对数据进行方差分析，多重比较采用Duncan氏法。P<0.05表示差异显著，0.05<P<0.10表示差异趋于显著。

从表2可以看出，12.00 mmol/L乙酸钠试验组ACC、DGAT、ACSS2和PPARG基因的表达量均显著高于6.00、9.00、15.00 mmol/L乙酸钠试验组和对照组(P<0.05)，FAS基因的表达量均显著高于6.00、9.00 mmol/L乙酸钠试验组和对照组(P<0.05)。6.00 mmol/L乙酸钠试验组CSN1S1基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)，而9.00、12.00和15.00 mmol/L乙酸钠试验组均显著低于对照组(P<0.05)。乙酸钠浓度在6.00、9.00 mmol/L时，CSN3基因的表达量显著高于对照组及12.00、15.00 mmol/L乙酸钠试验组(P<0.05)。乙酸钠浓度在15.00 mmol/L时，mTOR基因的表达量显著高于对照组及6.00、9.00、12.00 mmol/L乙酸钠试验组(P<0.05)。乙酸钠浓度在12.00 mmol/L时，BMECs中TAG含量显著 高于对照组及9.00、12.00、15.00 mmol/L乙酸钠 试验组(P<0.05)。综合以上，乙酸钠的最佳浓度为12 mmol/L。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 乙酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 2 Effects of sodium acetate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs 项目 Items 乙酸钠 Sodium acetate/(mmol/L) 0 6.00 9.00 12.00 15.00 乙酰辅酶A羧化 ACC 1.00±0.00c 0.68±0.06d 0.96±0.19c 6.80±0.27a 3.46±0.25b 脂肪酸合成酶 FAS 1.00±0.00c 1.03±0.05d 1.17±0.21c 2.24±0.22a 1.97±0.16ab 二酰甘油酰基转移酶 DGAT 1.00±0.00b 0.52±0.04d 1.00±0.07b 2.01±0.10a 0.90±0.03d 乙酰辅酶A合成酶2 ACSS2 1.00±0.00e 1.48±0.36d 2.12±0.18c 8.50±0.40a 7.90±0.19b 过氧化物酶体增殖物激活受体 PPARG 1.00±0.00d 0.78±0.07e 1.50±0.35c 3.60±0.36a 2.90±0.26b αs1酪蛋白 CSN1S1 1.00±0.00b 2.00±0.09a 0.88±0.04c 0.74±0.01d 0.63±0.00e κ酪蛋白 CSN3 1.00±0.00c 2.04±0.05a 2.00±0.03a 1.48±0.01b 0.67±0.01c 雷帕霉素靶蛋白 mTOR 1.00±0.00d 0.81±0.01e 2.13±0.04c 3.17±0.02b 3.66±0.60a 甘油三酯 TAG/(mmol/L) 0.077±0.002b 0.071±0.008bc 0.054±0.005c 0.116±0.017a 0.079±0.004b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无小写字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no small letter superscripts mean no significant difference(P>0.05). The same as below.

表2 乙酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 2 Effects of sodium acetate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs

从表3可以看出，添加β-羟丁酸钠后BMECs的ACC、FAS、ACSS2、PPARG和mTOR基因的表达量均显著高于对照组，而CSN1S1和CSN3基因的表达量显著低于对照组(P<0.05)。与未添加β-羟丁酸钠的BMECs相比，2.40 mmol/L β-羟丁酸钠试验组ACC和ACSS2基因的表达量显著高于0.80和1.60 mmol/L β-羟丁酸钠试验组(P< 0.05),FAS基因的表达量显著高于1.60 mmol/L β-羟丁酸钠试验组(P<0.05)。0.80 mmol/L β-羟丁酸钠试验组，DGAT、PPARG和mTOR基因的表达量显著高于1.60和2.40 mmol/L β-羟丁酸钠试验组(P<0.05)。与对照组相比，随着β-羟丁酸钠添加浓度的增加，BMECs内TAG的含量呈现先下降后升高的趋势，其中2.40 mmol/L β-羟丁酸钠试验组胞内TAG含量显著高于对照组、0.80和1.60 mmol/L β-羟丁酸钠试验组(P<0.05)。综合以上，β-羟丁酸钠的最佳浓度为2.40 mmol/L。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 β-羟丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 3 Effects of sodium β-hydroxybutyrate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs 项目 Items β-羟丁酸钠 Sodium β-hydroxybutyrate/(mmol/L) 0 0.80 1.60 2.40 乙酰辅酶A羧化 ACC 1.00±0.00d 2.78±0.11b 2.23±0.18c 5.89±0.07a 脂肪酸合成酶 FAS 1.00±0.00c 1.43±0.19a 1.17±0.16b 1.49±0.09a 二酰甘油酰基转移酶 DGAT 1.00±0.00bc 3.33±0.11a 1.19±0.19b 0.69±0.07c 乙酰辅酶A合成酶2 ACSS2 1.00±0.00c 1.54±0.20b 1.60±0.10b 4.36±0.22a 过氧化物酶体增殖物激活受体 PPARG 1.00±0.00d 2.46±0.23a 1.46±0.05c 1.75±0.12b αs1酪蛋白 CSN1S1 1.00±0.00a 0.21±0.02d 0.32±0.03c 0.43±0.04b κ酪蛋白 CSN3 1.00±0.00a 0.49±0.03d 0.62±0.08c 0.93±0.04b 雷帕霉素靶蛋白 mTOR 1.00±0.00d 3.44±0.20a 2.50±0.20b 1.90±0.12c 甘油三酯 TAG/(mmol/L) 0.077±0.002b 0.069±0.003bc 0.059±0.010c 0.095±0.004a

表3 β-羟丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 3 Effects of sodium β-hydroxybutyrate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs

根据第1部分的试验结果，乙酸钠和β-羟丁酸钠的最佳浓度之合为14.40 mmol/L，根据试验设计，乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠为1 ∶ 1、2 ∶ 1、4 ∶ 1时，乙酸钠和β-羟丁酸钠实际添加浓度分别为7.20和7.20、9.60和4.80、11.52和2.88 mmol/L。

从表4可以看出，与对照组相比，混合添加乙酸钠和β-羟丁酸钠均不同程度地上调了乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。其中，4 ∶ 1组ACC、FAS、ACSS2和mTOR基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)，2 ∶ 1组和4 ∶ 1组ACC基因的表达量差异不显著(P>0.05)。2 ∶ 1组PPARG和CSN3基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)，2 ∶ 1组和1 ∶ 1组PPARG基因的表达量差异不显著(P>0.05)。1 ∶ 1组CSN1S1基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)。2 ∶ 1组和4 ∶ 1组BMECs内TAG含量显著高于对照组和1 ∶ 1组(P<0.05)，2 ∶ 1组和4 ∶ 1组之间显著不差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 4 Effects of sodium acetate ∶ sodium β-hydroxybutyrate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs 项目 Items 对照组 Control group 乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠 Sodium acetate ∶ sodium β-hydroxybutyrate 1 ∶ 1 2 ∶ 1 4 ∶ 1 乙酰辅酶A羧化 ACC 1.00±0.00c 3.72±0.13b 7.23±0.03a 7.27±0.05a 脂肪酸合成酶 FAS 1.00±0.00c 1.57±0.04b 1.69±0.10b 2.14±0.20a 二酰甘油酰基转移酶 DGAT 1.00±0.00d 3.12±0.17a 1.77±0.04c 1.99±0.24b 乙酰辅酶A合成酶2 ACSS2 1.00±0.00d 2.79±0.12c 3.80±0.23b 7.96±0.31a 过氧化物酶体增殖物激活受体 PPARG 1.00±0.00d 4.04±0.11a 3.16±0.16a 3.02±0.17c αs1酪蛋白 CSN1S1 1.00±0.00d 2.67±0.15a 2.00±0.19b 1.26±0.07c κ酪蛋白 CSN3 1.00±0.00d 1.16±0.14b 2.39±0.21a 0.85±0.07c 雷帕霉素靶蛋白 mTOR 1.00±0.00d 4.53±0.24c 4.99±0.16b 5.93±0.09a 甘油三酯 TAG/(mmol/L) 0.083±0.001b 0.080±0.016b 0.137±0.021a 0.145±0.031a

表4 乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达量及甘油三酯含量的影响 Table 4 Effects of sodium acetate ∶ sodium β-hydroxybutyrate on expression levels of genes involved in milk fat and protein synthesis and TAG content in BMECs

科研工作者针对如何提高牛奶的乳脂率开展了大量的研究工作。在活体试验中，研究者主要是通过灌注乳脂前体物研究其对乳脂合成的影响。乙酸和β-羟丁酸作为奶牛乳脂肪酸从头合成主要的前体物，前人运用灌注的方法研究了乙酸和β-羟丁酸对乳脂合成的影响^[7,8]。灌注乙酸会增加血液中的乙酸含量，致使乳腺组织乙酸摄入量增加，从而增加乳脂的产量^[9]。但是灌注β-羟丁酸的结果不尽相同。Storry等^[10]给奶牛静脉灌注β-羟丁酸,发现可以显著增加乳脂中豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸的合成；同时灌注β-羟丁酸降低了乳脂的产量。相反，Maxin等^[11]研究表明，给奶牛瘤胃灌注β-羟丁酸能够增加乳脂产量，并增加乳脂中C4~C16脂肪酸的含量。

乳腺在生长、发育、分化以及乳脂合成、分泌等生理过程中伴随着功能基因的表达变化^[12]。反刍动物乳腺组织利用的脂肪酸来源于2个部分。长链脂肪酸和单不饱和脂肪酸直接从血液中摄取，短链和中链脂肪酸是由乳腺从头合成。脂肪酸从头合成过程主要由ACC和FAS这2种酶催化。其中ACC是脂肪酸从头合成过程中的限速酶，FAS在脂肪酸合成过程中具有决定性。作为乳脂合成前体物，适宜浓度的乙酸和β-羟丁酸均能促进脂肪酸从头合成过程关键酶的基因表达^[13]。Jacobs等^[14]向MAC-T细胞系(牛永生乳腺上皮细胞细胞系)中添加乙酸和β-羟丁酸，研究其对乳脂合成相关基因[ACC、FAS、硬脂酰辅酶a脱氢酶(SCD)、胆固醇调节元件结合蛋白(SREBF1)]表达的影响，结果表明，乙酸和β-羟丁酸均能上调ACC和FAS基因的表达，乙酸的上调程度更大。孔庆洋^[15]在BMECs中添加乙酸钠和丁酸钠，检测其对乳腺脂肪酸合成相关基因表达的影响。结果表明，添加乙酸钠和丁酸钠后，BMECs中ACC和FAS基因表达显著增加，在高峰期大约是未添加细胞的5~8倍。齐利枝等^[16]研究表明，乙酸对BMECs内脂滴的形成、TAG的积累有显著的促进作用。本试验的结果与前人的研究结果相一致。综合考虑BMECs中TAG的含量，以及乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达量，作者认为乙酸钠浓度为12.00 mmol/L和β-羟丁酸钠浓度为2.40 mmol/L时，对乳脂和乳蛋白合成的促进效果均较好。

DGAT催化二酰甘油和酰基辅酶A合成甘油三酯，而且DGAT是甘油三酯合成过程中的唯一限速酶^[17]。乙酰辅酶A合成酶[乙酰辅酶A合成酶(ACSS1)、ACSS2)]活化短链脂肪酸转化为乙酰辅酶A，并进入脂类合成途径参与生物体的新陈代谢。ACSS2对乙酸有较高的亲和力^[18]。本试验中，与对照组相比，乙酸钠添加浓度为12.00~15.00 mmol/L时，DGAT、ACSS2基因的表达量较高。丁酸钠浓度在1.60~2.40 mmol/L时，ACSS2基因的表达量较高。β-羟丁酸钠浓度在0.80 mmol/L时，DGAT基因表达量最高。混合添加时，乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠为4 ∶ 1时ACSS2基因的表达量最高；乙酸钠 ∶ β-羟丁酸钠为1 ∶ 1时，DGAT基因表达量显著高于对照组及其他2个试验组。

PPARG是与维甲酸、类固醇、甲状腺受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。Bionaz等^[19]认为在乳脂合成和分泌过程中，SREBF1不是唯一的转录调控因子，而PPARG、PPARG辅激活因子1A(PPARGC1A)、胰岛素诱导基因1(INSIG1)与SREBF1协同作用调节乳脂合成。MAC-T细胞中添加PPARG激动剂罗格列酮会促进乳脂合成相关基因(ACC、FAS、DGAT、SCD等)表达量升高，在BMECs中，上述基因被公认是PPARG的靶基因^[20]。在处于泌乳期的BMECs中，PPARG及其靶基因对泌乳起到正调节作用。Yonezawa等^[21]研究表明，在BMECs中添加10.00 mmol/L的乙酸促进了PPARγ2蛋白的合成。本试验结果显示，适宜浓度的乙酸钠(9.00~12.00 mmol/L)和β-羟丁酸钠(0.80~2.40 mmol/L)均显著上调了PPARG的基因表达，这与前人的研究结果是一致的。

乳蛋白是乳的重要组成成分，具有较高的营养价值。牛乳中乳蛋白的含量为3.4%左右，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成。其中，酪蛋白含量最高，占总蛋白的80%左右^[22]。CSN1S1、CSN3是2个主要酪蛋白的基因，BMECs这2个基因表达水平与乳蛋白的合成有很强的相关性^[23]。本试验结果表明，乙酸钠浓度为6.00 mmol/L时，CSN1S1基因的表达量显著高于对照组，而9.00、12.00、15.00 mmol/L乙酸钠试验组中CSN1S1基因的表达量均低于对照组。β-羟丁酸钠试验组CSN1S1、CSN3基因的表达量均低于对照组。

本试验得出，乙酸钠浓度为9.00~15.00 mmol/L时，显著下调了CSN1S1基因的表达量，这一结果与前人的研究结果是一致的^[24]。当乙酸钠浓度为6.00~12.00 mmol/L时，显著上调了CSN3基因的表达量，这表明，添加适宜浓度的乙酸钠可能会促进BMECs中该蛋白的合成。此外，从本试验的结果我们发现，β-羟丁酸钠试验组CSN1S1和CSN3基因的表达量均显著低于对照组。这与齐利枝^[24]研究得出的β-羟丁酸浓度为2.32~9.28 mmol/L可上调CSN1S1基因表达的结果不尽一致，具体原因还有待进一步深入研究。

mTOR是雷帕霉素(rapamycin)的靶分子，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用。在乳腺组织中，乳蛋白的合成受不同信号通路的影响^[25]。mTOR信号通路通过真核生物起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(4E-BP1)和p70核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)的磷酸化调控蛋白质合成^[26]。本试验结果表明，除了6.00 mmol/L乙酸钠试验组，单独添加或混合添加试验组均上调了mTOR基因的表达。目前，乙酸和β-羟丁酸对乳蛋白合成相关基因表达的影响还没有系统的报道，因此，乙酸和β-羟丁酸对乳蛋白合成的影响还有待于进一步探讨。

齐利枝^[24]研究了梯度养分饲粮条件下不同饲粮模式对奶牛产奶性能、乳蛋白与乳脂合成的影响及乳腺对乳脂合成前体物的摄取规律，结果表明，在乳蛋白含量与产量最高、乳脂量最高的饲粮模式下，进入奶牛乳腺阴外动脉血中的乙酸和β-羟丁酸浓度比为2 ∶ 1。本试验结果表明，4 ∶ 1组ACC、FAS、ACSS2和mTOR基因的表达量最高，但是1 ∶ 1组CSN1S1、PPARG和DGAT2基因的表达量最高。但如果同时考虑乳脂前体物对乳脂、乳蛋白的影响，2 ∶ 1组综合效果较好。

综合各项指标，以9.60 mmol/L乙酸钠和4.80 mmol/L β-羟丁酸钠混合添加对乳脂和乳蛋白合成的促进效果较好。