消化酶制剂的储存温度和储存时间对仿生消化中模拟鸭肠液消化能力的影响

引用本文

张莉, 赵峰, 严峰, 王钰明, 刘成玲, 张宏福. 消化酶制剂的储存温度和储存时间对仿生消化中模拟鸭肠液消化能力的影响[J]. 动物营养学报, 2014, 26(6): 1545-1555. 复制到剪切板

ZHANG Li, ZHAO Feng, YAN Feng, WANG Yuming, LIU Chengling, ZHANG Hongfu. Effects of Temperature and Time for Storage of Digestive Enzyme Preparation on Digestive Ability of Simulated Intestinal Fluid for Ducks in Bionic Digestion[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014, 26(6): 1545-1555. 复制到剪切板

消化酶制剂的储存温度和储存时间对仿生消化中模拟鸭肠液消化能力的影响

张莉, 赵峰 , 严峰, 王钰明, 刘成玲, 张宏福

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193

收稿日期：2013-12-5

基金项目：基本科研业务费专项（2011yq-1）；科技部创新方法工作专项（2009IM033100）；中国农业科学院科技创新工程

作者简介：张莉（1989- ），女，湖北宜昌人，硕士研究生，从事饲料营养价值的评定。E-mail：douweibahua@163.com

通讯作者：赵峰，副研究员，硕士生导师，E-mail：zsummit@iascaas.net.cn

摘要：本试验旨在探讨消化酶制剂的储存温度和储存时间对仿生消化中模拟鸭肠液消化能力的影响，为规范模拟消化液提供依据。采用2×9两因素完全随机设计，其中储存温度设2个水平，即4 ℃、室温；储存时间设9个水平，即0、1、2、3、4、6、8、10、12个月。试验共18个处理，测定各处理下模拟鸭肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶和α-淀粉酶的活性，并通过仿生消化系统测定玉米、大豆粕、小麦麸3种饲料原料的干物质消化率和酶水解物能值。结果表明：1）与4 ℃储存时相比，室温储存时模拟鸭肠液中α-淀粉酶活性显著降低（P<0.05），而胰蛋白酶和糜蛋白酶活性则无显著变化（P>0.05）。消化酶制剂储存0~12个月时，模拟鸭肠液中上述3种消化酶活性随着储存时间的延长而显著降低（P<0.05）。2）消化酶制剂的储存温度显著地影响了模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率（P<0.05）。与4 ℃储存时相比，室温储存时玉米、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率显著降低（P<0.05）。消化酶制剂的储存温度仅对大豆粕的酶水解物真能值有显著影响（P<0.05），对玉米、小麦麸的酶水解物表观能值和真能值以及大豆粕的酶水解物表观能值均无显著影响（P>0.05）。3）消化酶制剂的储存时间显著地影响了模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率以及酶水解物表观能值和真能值（P<0.05）。然而，在4 ℃或室温下储存0~10个月，模拟鸭肠液对玉米、大豆粕和小麦麸的干物质真消化率和酶水解物真能值保持相对稳定（相对差值分别在1%和0.10 MJ/kg以内）。由此得出，尽管消化酶制剂的储存时间是模拟鸭肠液中消化酶活性降低的主要因素，但在4 ℃或室温下保存10个月以内的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液对饲料原料的消化能力是稳定的。

关键词：北京鸭消化酶制剂储存温度储存时间仿生消化

Effects of Temperature and Time for Storage of Digestive Enzyme Preparation on Digestive Ability of Simulated Intestinal Fluid for Ducks in Bionic Digestion

ZHANG Li, ZHAO Feng , YAN Feng, WANG Yuming, LIU Chengling, ZHANG Hongfu

State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100193, China

Abstract: This experiment was conducted to study the effects of temperature and time for storage of digestive enzyme preparation on digestive ability of simulated intestinal fluid (SIF) for ducks in bionic digestion, which would provide a reference for the standardization of simulated digestive fluid. Storage temperature at 4 ℃ or room temperature and storage time at 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 or 12 months were used in a 2×9 two-factorial completely randomized design. There were 18 treatments in this experiment. The activities of trypsin, chymotrypsin and α-amylase were determined in duck SIF from each treatment. The dry matter digestibility and enzymatic hydrolysate gross energy of corn, soybean meal and wheat bran were determined using bionic digestion system. The results showed as follows:1) the activity of α-amylase in duck SIF was significantly higher for the digestive enzyme preparation stored at 4 ℃ than stored at room temperature (P<0.05), however, the activities of trypsin and chymotrypsin in duck SIF were not significantly different for the digestive enzyme preparation stored at 4 ℃ and stored at room temperature (P>0.05). The activities of these 3 digestive enzymes in duck SIF significantly decreased as the storage time extended from 0 to 12 months for digestive enzyme preparation (P<0.05). 2) The storage temperature of digestive enzyme preparation significantly affected the apparent digestibility and true digestibility of dry matter of corn, soybean meal and wheat bran (P<0.05). The apparent digestibility and true digestibility of dry matter of corn and wheat bran were significantly higher for the digestive enzyme preparation stored at 4 ℃ than stored at room temperature. The storage temperature of digestive enzyme preparation significantly affected the true gross energy of enzymatic hydrolysate of soybean meal (P<0.05), but did not affect the true gross energy of enzymatic hydrolysate of corn and wheat bran, and apparent gross energy of enzymatic hydrolysate of corn, soybean meal and wheat bran (P>0.05). 3)The storage time of digestive enzyme preparation significantly affected the apparent digestibility and true digestibility of dry matter, and the apparent gross energy and true gross energy of enzymatic hydrolysate of corn, soybean meal and wheat bran (P<0.05). However, for the storage temperature of 4 ℃ or room temperature and the storage time extended from 0 to 10 months, the true digestibility of dry matter and the true gross energy of enzymatic hydrolysate of corn, soybean meal and wheat bran showed relatively stable (less than 1% and 0.10 MJ/kg of relative difference, respectively). In conclusion, although the storage time of digestive enzyme preparation is the main factor affecting the activities of digestive enzymes in duck SIF, however, the digestive abilities of SIF are stable for digestive enzyme preparation stored at 4 ℃ or room temperature and no more than 10 months.

Key words: Peking duck digestive enzyme preparation storage temperature storage time bionic digestion

模拟消化液的规范是体外模拟消化研究的关键问题之一。在其制备中，消化酶制剂(如胰液素、试剂酶等)的储存条件，如储存温度、储存时间等对规范模拟消化液的制备非常重要。从已报道的体外消化方法看，模拟小肠液多以一定浓度的胰液素或试剂级胰蛋白酶、糜蛋白酶、α-淀粉酶等制备^[1,2,3,4,5]，但鲜见关于制备中所需关键材料——胰液素或消化酶制剂储存条件及存放有效期的相关研究结果。20世纪80年代，张子仪等^[6]在猪的体外模拟消化研究中得出了猪小肠液冻干粉在25 ℃以下保存时效价可维持3个月稳定不变。近年来，郑卫宽等^[7]研究了储存温度(-20、-70 ℃)与储存时间(0~90 d)对鸭空肠液组成的影响，发现低温储存条件对主要消化酶的活性没有显著影响，而储存时间对部分消化酶活性有显著影响。由此可见，储存温度与储存时间对不同来源的消化酶活性的影响程度不一。因此，消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中主要消化酶的活性有多大影响？它们活性的变化是否会引起模拟鸭肠液消化能力的变化？对这2个问题的探讨将为规范模拟鸭肠液的制备提供科学依据。为此，本试验拟分析在2个温度下和9个时间内储存的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液中主要消化酶活性的变异，及其对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质消化率与酶水解物能值的影响，为规范消化酶制剂的储存温度与储存时间提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

为了大量获取鸭空肠液，试验选用80只健康、体重[(3.25±0.50) kg]基本一致的18周龄成年北京公鸭为鸭空肠液供体。根据鸭的空肠食糜连续采集方法，在试验鸭的卵黄囊憩室部位安装瘘管，并进行相应的术后护理^[8]，试验期间试验鸭均饲喂基础饲粮(表1)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

为了考察消化酶制剂的储存温度与储存时间对模拟鸭肠液消化能力的影响，选择3种常用饲料原料，即玉米、大豆粕和小麦麸。将上述3种饲料原料分别采用四分法取样后用万能粉碎机粉碎并过60目筛，充分混合均匀后贮存于样品瓶中，-20 ℃保存备用。饲料原料的营养水平见表2。

表2 饲料原料的营养水平(干物质基础) Table 2 Nutrient levels of feed ingredients (DM basis) %

1.2 消化酶制剂的制备

从安装有瘘管的试验鸭空肠中收集食糜，经低温浓缩、透析、冻干、乙醇脱脂、冻干后得到鸭肠液消化酶粉剂^[9]，按照与鸭体内肠液3种消化酶的活性水平一致，且鸭肠液消化酶粉剂与试剂级酶[包括胰蛋白酶(Amresco 0458，粉剂)、糜蛋白酶(Amresco 0164，粉剂)、α-淀粉酶(Sigma A3306，水剂)]提供的胰蛋白酶活性比例为25% vs. 75%的原则^[10]，制备消化酶制剂(表3)。

表3 消化酶制剂的制备 Table 3 Preparation of digestive enzyme preparation

1.3 试验设计

本试验采用2×9两因素完全随机设计，其中储存温度设2个水平，即4 ℃、室温(室内年度平均温度25 ℃)；储存时间设9个水平，即0、1、2、3、4、6、8、10、12个月。试验共18个处理，测定各处理下模拟鸭肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶及α-淀粉酶的活性及其对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质消化率和酶水解物能值。其中每个处理的消化酶活性重复测定2次。干物质消化率与酶水解物能值的测定每个处理5个重复，每个重复1根消化管。 1.4 测定指标及方法 1.4.1 模拟鸭肠液中主要消化酶活性的测定

模拟鸭肠液中主要消化酶活性是通过先测定浓缩模拟鸭肠液中相应酶的活性后乘以稀释倍数计算所得。α-淀粉酶活性以可溶性淀粉为底物进行测定^[11]，α-淀粉酶活性单位定义为25 ℃、pH 6.90条件下每分钟释放1 μmol麦芽糖所具有的活性；胰蛋白酶活性以对-苯磺酸-L-精氨酸甲酯(TAME)为底物进行测定^[12]，胰蛋白酶活性单位定义为25 ℃、pH 8.10条件下每分钟释放1 μmol对-甲苯磺酸-L-精氨酸时所具有的活性；糜蛋白酶活性以苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)为底物进行测定^[13]，糜蛋白酶活性单位定义为25 ℃、pH 7.80条件下每分钟释放1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸所具有的活性。 1.4.2 模拟鸭肠液对饲料原料干物质消化率和酶水解物能值的测定

采用SDS-2型单胃动物仿生消化系统测定饲料样品的干物质消化率与酶水解物能值^[14]。其方法为：玉米、小麦麸的上样量各为2 g，大豆粕的上样量为1 g，均精确到0.000 2 g，每个样品测定5个重复。取样后无损失地转移至装有透析袋的模拟消化管中，然后往每管中加入20 mL模拟胃液(含1 550 U/mL胃蛋白酶)。将带有加消化液管道的硅胶塞封闭模拟消化管，并按照《单胃动物仿生消化系统操作手册》^[14]连接管道，在控制软件中设置胃模拟消化时间为4 h，每管注入浓缩模拟鸭肠液(将消化酶制剂溶解于25 mL去离子水中即制成浓缩模拟鸭肠液)2 mL，小肠模拟消化前期为7.5 h，后期为7.5 h，模拟消化后水解产物清洗6次。最后点击软件中“开始”选项，SDS-2型单胃动物仿生消化系统自动完成鸭的胃-小肠模拟消化过程。待整个消化过程完毕后，将透析袋中内容物用去离子水小心冲洗到已知绝干重的培养皿中，65 ℃烘干至无水痕后,在105 ℃烘干至恒重，待测总能。按GB/T 6435—2006方法测定水分含量，并计算干物质含量；按ISO 9831:1998方法测定总能。

1.5 计算公式干物质表观消化率(ADMD，%)=[(M₁-M₂)/M₁]×100；

酶水解物表观能值(AEHGE，MJ/kg)=(E₁-E₂)/M₁/1 000；

干物质真消化率(TDMD，%)=[(M₁-M₂+M₀)/M₁]×100；

酶水解物真能值(TEHGE，MJ/kg)=(E₁-E₂+E₀)/M₁/1 000。

式中:M₁为饲料原料样品干物质重量(g)；M₂为残渣干物质重量(g)；M₀为消化酶干物质残留量(g)；E₁为饲料原料样品总能值(J)；E₂为残渣总能值(J)；E₀为消化酶干物质残留量总能值(J)。

1.6 统计分析

根据两因素完全随机设计，采用SAS 9.0的MEANS模块计算胰蛋白酶、糜蛋白酶、α-淀粉酶的活性，干物质表观消化率、真消化率及酶水解物表观能值和真能值的基本统计量，结果以平均值±标准差表示；采用GLM模块对数据进行方差分析，以Duncan氏法对各处理数据进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析 2.1 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中主要消化酶活性的影响

由表4可知，消化酶制剂的储存温度对模拟鸭肠液中α-淀粉酶的活性有显著影响(P<0.05)，对模拟鸭肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的影响不显著(P>0.05)。消化酶制剂在4 ℃下储存时，模拟鸭肠液中α-淀粉酶的活性显著高于室温下储存时的相应值(P<0.05)。储存时间对模拟鸭肠液中α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性均有显著影响(P<0.05)。随着消化酶制剂储存时间的延长，模拟鸭肠液中上述3种主要消化酶活性均显著降低(P<0.05)。消化酶制剂储存12个月后，在4 ℃和室温条件下，α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性分别为初始活性的67.7%、67.3%、63.0%和64.9%、64.8%、59.4%。消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的影响无显著的交互作用(P>0.05)。

表4 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中主要消化酶活性的影响 Table 4 Effects of temperature and time for storage of digestive enzyme preparation on the activities of main digestive enzymes in simulated intestinal fluid for ducks

储存温度 Storage temperature	储存时间 Storage time/月	α-淀粉酶 α-amylase	胰蛋白酶 Trypsin	糜蛋白酶 Chymotrypsin
4 ℃	0	393.15±8.83	101.45±8.49	37.89±3.54
	1	383.93±11.31	101.33±11.31	36.84±2.40
	2	367.26±12.87	92.57±7.17	33.85±3.46
	3	345.71±10.61	82.21±10.61	30.51±4.10
	4	332.04±3.54	85.31±8.61	29.37±4.74
	6	319.92±15.56	76.93±6.08	27.55±2.63
	8	298.07±7.07	70.22±10.04	25.01±3.34
	10	285.92±10.32	72.98±11.17	24.78±3.86
	12	266.14±14.42	68.32±7.78	23.88±3.44

室温 Room temperature	0	393.15±8.83	101.45±8.49	37.89±3.54
	1	364.11±18.38	90.60±6.63	31.67±4.40
	2	332.51±15.56	81.47±7.92	31.19±4.86
	3	321.59±12.73	79.95±5.37	28.69±4.68
	4	314.80±17.32	77.98±9.90	26.56±3.59
	6	301.58±9.62	69.50±8.34	23.48±3.25
	8	287.31±11.32	67.47±11.74	21.56±2.40
	10	264.09±12.73	67.42±7.07	24.33±4.10
	12	255.14±16.97	65.78±11.17	22.52±3.11
4 ℃		332.46^a	83.48	29.96
室温 Room temperature		314.92^b	77.96	27.54
	0	393.15^a	101.45^a	37.89^a
	1	374.02^b	95.97^ab	34.26^ab
	2	349.89^c	87.02^bc	32.52^abc
	3	333.65^cd	81.08^cd	29.60^bcd
	4	323.42^de	81.64^cd	27.97^de
	6	310.75^ef	73.22^cd	25.52^de
	8	292.69^fg	68.85^d	23.29^e
	10	275.01^gh	70.20^d	24.56^de
	12	260.64^h	67.05^d	23.20^e
方差来源，P值 Sources of variance，P-value
储存温度 Storage temperature		0.000 6	0.084 2	0.065 8
储存时间 Storage time		＜0.000 1	0.000 2	0.000 1
储存温度×储存时间 Storage temperature×storage time		0.772 8	0.989 6	0.985 6
同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液消化饲料原料干物质能力的影响

由表5可知，消化酶制剂的储存温度对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量无显著影响(P>0.05)，但对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率均有显著影响(P<0.05)。消化酶制剂在4 ℃下储存时，模拟鸭肠液对玉米、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率显著高于室温下储存时的相应值(P<0.05)，而对大豆粕的干物质表观消化率和真消化率却显著低于室温下储存时的相应值(P<0.05)。消化酶制剂的储存时间对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量及玉米、大豆粕、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率均有显著影响(P<0.05)。消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量及玉米、大豆粕、小麦麸的干物质表观消化率和真消化率的影响均有显著的交互作用(P<0.05)。4 ℃和室温下储存0~10个月的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质真消化率(最大绝对差值分别为1.31%、0.89%，相对差值分别为0.33%、1.00%)均保持相对稳定，而且处理间的最大差异也处于SDS-2型单胃动物仿生消化系统的测试精度^[15]范围内。

表5 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液消化饲料原料干物质能力的影响 Table 5 Effects of temperature and time for storage of digestive enzyme preparation on the ability of feed ingredient dry matter digested by simulated intestinal fluid for ducks

储存温度 Storage temperature	储存时间Storage time/月	消化酶干物质残留量Dry matter residue of digestive enzymes (M₀)/g	玉米 Corn		大豆粕 Soybean meal		小麦麸 Wheat bran
储存温度 Storage temperature	储存时间Storage time/月	消化酶干物质残留量Dry matter residue of digestive enzymes (M₀)/g	干物质表观消化率 ADMD/%	干物质真消化率 TDMD/%	干物质表观消化率 ADMD/%	干物质真消化率 TDMD/%	干物质表观消化率 ADMD/%	干物质真消化率 TDMD/%
4 ℃	0	0.064 4 ±0.003 7	81.93 ±0.13	85.51 ±0.12	65.19 ±0.46	72.25 ±0.47	45.73 ±0.36	49.24 ±0.36
	1	0.063 3 ±0.001 0	81.17 ±0.44	84.64 ±0.45	64.90 ±0.49	71.84 ±0.50	45.83 ±0.13	49.28 ±0.13
	2	0.066 2 ±0.002 5	80.99 ±0.28	84.68 ±0.28	64.52 ±0.15	71.80 ±0.15	45.64 ±0.24	49.24 ±0.24
	3	0.069 2 ±0.002 4	81.37 ±0.29	85.23 ±0.29	64.30 ±0.35	71.90 ±0.35	45.75 ±0.34	49.51 ±0.34
	4	0.063 2 ±0.004 8	81.88 ±0.32	85.44 ±0.32	65.46 ±0.43	72.42 ±0.41	45.54 ±0.34	49.01 ±0.35
	6	0.070 4 ±0.003 1	81.37 ±0.25	85.25 ±0.24	64.67 ±0.22	72.29 ±0.21	45.96 ±0.35	49.75 ±0.35
	8	0.071 7 ±0.001 1	81.13 ±0.42	84.98 ±0.42	63.98 ±0.16	71.67 ±0.15	45.17 ±0.26	49.07 ±0.26
	10	0.075 6 ±0.005 1	81.78 ±0.60	85.95 ±0.60	63.75 ±0.57	71.68 ±0.58	46.25 ±0.19	50.01 ±0.19
	12	0.078 5 ±0.002 1	80.84 ±0.17	85.22 ±0.17	61.27 ±0.37	69.93 ±0.38	45.08 ±0.26	49.37 ±0.26

室温 Room temperature	0	0.064 4 ±0.003 7	81.93 ±0.13	85.51 ±0.12	65.19 ±0.46	72.25 ±0.47	45.73 ±0.36	49.24 ±0.36
	1	0.065 2 ±0.002 6	81.49 ±0.19	85.07 ±0.19	64.88 ±0.26	72.03 ±0.25	45.39 ±0.44	48.93 ±0.46
	2	0.069 9 ±0.001 6	81.44 ±0.40	85.21 ±0.40	65.32 ±0.32	72.34 ±0.32	45.69 ±0.40	49.49 ±0.40
	3	0.067 3 ±0.003 5	81.25 ±0.18	85.01 ±0.18	64.34 ±0.44	72.35 ±0.42	45.63 ±0.25	49.29 ±0.25
	4	0.066 0 ±0.002 1	81.96 ±0.40	85.61 ±0.40	65.03 ±0.32	72.19 ±0.31	45.90 ±0.14	49.49 ±0.14
	6	0.067 1 ±0.002 8	81.23 ±0.30	84.93 ±0.29	64.67 ±0.17	71.92 ±0.13	45.59 ±0.22	49.22 ±0.22
	8	0.070 7 ±0.001 4	81.36 ±0.61	85.15 ±0.61	64.67 ±0.16	72.30 ±0.16	45.12 ±0.46	48.96 ±0.45
	10	0.079 4 ±0.001 4	80.46 ±0.21	84.84 ±0.21	63.72 ±0.60	71.46 ±0.60	45.54 ±0.29	49.80 ±0.29
	12	0.084 7 ±0.002 2	79.13 ±0.74	83.84 ±0.74	63.47 ±0.53	72.78 ±0.53	44.35 ±0.58	48.95 ±0.58
4 ℃		0.069 3	81.38^a	85.21^a	64.18^b	71.75^b	45.72^a	49.47^a
室温 Room temperature		0.070 5	81.13^b	85.02^b	64.49^a	72.17^a	45.46^b	49.27^b
	0	0.064 4^d	81.93^a	85.51^a	65.19^a	72.25^a	45.73^b	49.24^bcd
	1	0.064 3^d	81.33^b	84.86^cd	64.89^ab	71.94^a	45.61^b	49.11^cd
	2	0.068 3^c	81.21^b	84.95^c	64.92^ab	72.07^a	45.67^b	49.37^bc
	3	0.068 2^c	81.32^b	85.31^bc	64.32^c	72.12^a	45.69^b	49.40^bc
	4	0.064 6^d	81.92^a	85.52^a	65.24^a	72.30^a	45.72^b	49.25^bcd
	6	0.068 8^c	81.30^b	85.09^bc	64.67^bc	72.13^a	45.78^b	49.49^b
	8	0.071 2^c	81.24^b	85.07^bc	64.31^c	71.98^a	45.74^b	49.02^d
	10	0.077 5^b	81.12^b	85.40^ab	63.03^d	71.57^b	46.15^a	50.30^a
	12	0.081 6^a	79.99^c	84.53^d	62.24^e	71.20^c	44.75^c	49.18^bcd
方差来源，P值 Sources of variance,P-value
储存温度 Storage temperature		0.054 7	0.003 5	0.023 6	0.000 6	<0.000 1	0.000 1	0.003 6
储存时间 Storage time		<0.000 1	＜0.000 1	＜0.000 1	＜0.000 1	＜0.000 1	＜0.000 1	＜0.000 1
储存温度×储存时间 Storage temperature× storage time		0.014 2	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	0.000 2

2.3 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液消化饲料原料能量物质能力的影响

由表6可知，消化酶制剂的储存温度对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量总能值及大豆粕的酶水解物真能值有显著影响(P<0.05)，但对玉米、小麦麸的酶水解物表观能值和真能值以及大豆粕的酶水解物表观能值均无显著影响(P>0.05)。消化酶制剂在4 ℃下储存时，模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量总能值显著低于室温下储存时的相应值(P<0.05)，同时模拟鸭肠液对大豆粕的酶水解物真能值也显著低于室温下储存时的相应值(P<0.05)。在4 ℃与室温下储存的消化酶制剂，其制备的模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的酶水解物表观能值的绝对差值分别为0.01、0.03、0.03 MJ/kg，酶水解物真能值绝对差值分别为0.02、0.05、0.03 MJ/kg。消化酶制剂的储存时间对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量总能值及玉米、大豆粕、小麦麸的酶水解物表观能值和真能值均有显著影响(P<0.05)。储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中消化酶干物质残留量总能值及玉米、大豆粕的酶水解物表观能值和真能值的影响均有显著的交互作用(P<0.05)。4 ℃和室温下储存0~10个月的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的酶水解物真能值(最大绝对差值分别为0.35、0.35 MJ/kg，相对差值分别为 0.10、0.08 MJ/kg)均保持相对稳定，而且处理间的最大差异也处于SDS-2型单胃动物仿生消化系统的测试精度^[15]范围内。

表6 消化酶制剂的储存温度和时间对模拟鸭肠液消化饲料原料能量物质能力的影响 Table 6 Effects of temperature and time for storage of digestive enzyme preparation on the ability of feed ingredient energy matter digested by simulated intestinal fluid for ducks

储存温度 Storage temperature	储存时间Storage time/月	消化酶干物质残留量总能值 Gross energy of dry matter residue of digestive enzymes (E₀)/J	玉米 Corn		大豆粕 Soybean meal		小麦麸 Wheat bran
储存温度 Storage temperature	储存时间Storage time/月		酶水解物表观能值 AEHGE/ (MJ/kg)	酶水解物真能值 TEHGE/ (MJ/kg)	酶水解物表观能值 AEHGE/ (MJ/kg)	酶水解物真能值 TEHGE/ (MJ/kg)	酶水解物表观能值 AEHGE/ (MJ/kg)	酶水解物真能值 TEHGE/ (MJ/kg)
4 ℃	0	635.48 ±36.17	16.53 ±0.07	16.89 ±0.07	14.84 ±0.08	15.54 ±0.08	9.33 ±0.10	9.68 ±0.10
	1	606.20 ±9.98	16.46 ±0.13	16.79 ±0.13	14.76 ±0.07	15.43 ±0.07	9.26 ±0.16	9.59 ±0.16
	2	580.66 ±21.54	16.51 ±0.07	16.83 ±0.07	14.72 ±0.12	15.36 ±0.12	9.36 ±0.16	9.68 ±0.16
	3	660.34 ±22.70	16.53 ±0.07	16.90 ±0.07	14.62 ±0.10	15.35 ±0.10	9.39 ±0.12	9.75 ±0.12
	4	679.00 ±51.54	16.44 ±0.05	16.82 ±0.05	14.67 ±0.04	15.41 ±0.04	9.27 ±0.10	9.64 ±0.10
	6	655.00 ±28.40	16.39 ±0.07	16.75 ±0.07	14.73 ±0.07	15.45 ±0.07	9.39 ±0.18	9.74 ±0.18
	8	711.09 ±10.73	16.58 ±0.12	16.96 ±0.12	14.94 ±0.06	15.70 ±0.06	9.55 ±0.08	9.94 ±0.08
	10	768.03 ±51.93	16.33 ±0.14	16.76 ±0.14	14.54 ±0.07	15.38 ±0.07	9.52 ±0.03	9.93 ±0.03
	12	842.44 ±23.04	16.46 ±0.07	16.93 ±0.07	14.49 ±0.12	15.42 ±0.12	9.40 ±0.03	9.86 ±0.03

室温 Room temperature	0	635.09 ±36.17	16.53 ±0.07	16.89 ±0.07	14.84 ±0.08	15.54 ±0.08	9.33 ±0.10	9.68 ±0.10
	1	562.51 ±22.32	16.67 ±0.05	16.97 ±0.05	14.91 ±0.05	15.53 ±0.05	9.28 ±0.16	9.59 ±0.16
	2	620.36 ±14.44	16.55 ±0.11	16.89 ±0.11	14.78 ±0.07	15.46 ±0.07	9.53 ±0.11	9.87 ±0.11
	3	631.08 ±32.55	16.52 ±0.16	16.87 ±0.16	14.76 ±0.08	15.46 ±0.09	9.41 ±0.09	9.75 ±0.09
	4	685.05 ±22.30	16.53 ±0.05	16.91 ±0.05	14.73 ±0.10	15.48 ±0.10	9.45 ±0.03	9.82 ±0.29
	6	730.00 ±30.61	16.41 ±0.06	16.81 ±0.06	14.70 ±0.07	15.49 ±0.07	9.40 ±0.08	9.80 ±0.08
	8	781.19 ±15.35	16.57 ±0.11	16.99 ±0.11	14.77 ±0.06	15.61 ±0.06	9.51 ±0.10	9.83 ±0.10
	10	823.37 ±14.31	16.52 ±0.01	16.98 ±0.01	14.44 ±0.13	15.35 ±0.13	9.53 ±0.03	9.94 ±0.03
	12	897.44 ±23.72	15.97 ±0.31	16.47 ±0.31	14.53 ±0.12	15.52 ±0.12	9.40 ±0.06	9.88 ±0.06
4 ℃	684.93^a	16.47	16.85	14.70	15.45^a	9.38	9.76
室温 Room temperature		703.95^b	16.48	16.87	14.73	15.50^b	9.41	9.79
	0	635.48^e	16.53^ab	16.89^ab	14.84^a	15.54^b	9.33^de	9.68^cd
	1	581.93^f	16.56^a	16.88^ab	14.84^a	15.48^bc	9.27^e	9.59^d
	2	602.71^f	16.53^ab	16.86^ab	14.75^b	15.41^cd	9.45^abc	9.77^bc
	3	645.71^e	16.53^ab	16.89^ab	14.69^b	15.40^cd	9.40^bcd	9.75^c
	4	682.03^d	16.49^abc	16.86^ab	14.71^b	15.45^cd	9.36^cde	9.73^c
	6	692.50^d	16.40^c	16.78^bc	14.72^b	15.46^bc	9.40^bcd	9.77^bc
	8	746.14^c	16.58^a	16.97^a	14.87^a	15.67^a	9.50^ab	9.90^a
	10	795.70^b	16.43^bc	16.87^ab	14.50^c	15.37^d	9.52^a	9.95^a
	12	869.94^a	16.25^d	16.73^c	14.51^c	15.47^bc	9.40^bcd	9.87^ab
方差来源，P值 Sources of variance,P-value
储存温度 Storage temperature		0.000 2	0.830 1	0.439 8	0.362 8	0.024 6	0.249 4	0.085 4
储存时间 Storage time		＜0.000 1	＜0.000 1	0.000 2	＜0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1
储存温度×储存时间 Storage temperature× storage time		<0.000 1	<0.000 1	<0.000 1	0.002 3	0.142 6	0.080 2	0.096 7

3 讨论 3.1 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中主要消化酶活性的影响

消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液中主要消化酶的活性有潜在影响。通常，在低温储存条件下蛋白质化学降解的速度降低，所以动物肠液中主要消化酶的活性可在一定时间内保持稳定。如Furuya等^[3]研究发现，将猪小肠液于-20 ℃条件下储存，其主要消化酶活性在90 d内可保持稳定。郑卫宽等^[7]研究发现，其所制备的北京鸭小肠液于-20及-70 ℃条件下储存时，胰蛋白酶、糜蛋白酶及α-淀粉酶活性在90 d内未发生显著性变化。本试验中，除鸭肠液消化酶粉剂及试剂级胰蛋白酶(Amresco 0458)、糜蛋白酶(Amresco 0164)为固体外，试剂级α-淀粉酶(Sigma A3306)为液体酶，其适宜储存温度为2~8 ℃。考虑到今后在消化酶制剂的运输过程中低温条件难以保证，因此，本试验比较了4 ℃与室温条件下消化酶制剂在储存不同时间后制备的模拟鸭肠液中主要消化酶活性的变异。结果表明，4 ℃条件下α-淀粉酶的活性显著地高于室温条件下的相应值，而胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性无显著差异。随着消化酶制剂储存时间的延长，模拟鸭肠液中上述3种主要消化酶的活性均降低，且2种储存温度下的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液的主要消化酶活性在12个月后均有较大的损失。比较而言，储存温度不是导致消化酶活性损失的主要原因，而储存时间是消化酶活性降低的主要因素。其可能的原因为：首先，冻干蛋白质制品长期保存活性必须具备低水平的残留水，而实验室所使用冻干机制备的鸭肠液消化酶粉剂无法达到低水平的残留水(<1%~2%)^[16]；再者，由于消化酶制剂中含有液体酶[α-淀粉酶(Sigma A3306)]，有研究表明蛋白质在水溶液中长期保存时，多种应激(暴露于空气-水界面、温度升高、搅动等)都能诱发蛋白质聚集和沉淀^[17]，致使酶蛋白变性。因此，2种储存温度条件下都不适宜长期保存消化酶制剂。但从饲料原料干物质消化率及酶水解物能值的变异看，当消化酶制剂中α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别下降32.83%、33.54%和35.79%以内时，其模拟的消化液的消化能力仍是稳定的。
3.2 消化酶制剂的储存温度和储存时间对模拟鸭肠液消化能力的影响

本试验结果表明，消化酶制剂的储存温度对模拟鸭肠液中α-淀粉酶的活性有显著影响，储存时间对模拟鸭肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶、α-淀粉酶的活性均有显著影响，但消化酶活性的变化是否会引起其对饲料消化能力的变化？Furuya等^[3]研究发现，猪小肠液在-20 ℃条件下保存90 d后没有降低其对饲料的粗蛋白质和干物质的消化率；张子仪等^[6]也发现，猪小肠液冻干粉剂在25 ℃以下保存时，其效价可保持3个月稳定不变。由此可见，体外模拟消化中，在适当的储存温度与储存时间内，消化酶制剂对饲料的消化能力可保持相对稳定。从本研究的结果来看，在4 ℃及室温条件下储存的消化酶制剂分别存放0、1、2、3、4、6、8、10、12个月，其制备的模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质消化率和酶水解物能值均有一定差异，部分甚至达到显著水平，但4 ℃和室温下储存0~10个月的消化酶制剂制备的模拟鸭肠液对玉米、大豆粕、小麦麸的干物质真消化率和酶水解物真能值均保持相对稳定，而且处理间的最大差异也处于SDS-2型单胃动物仿生消化系统的测试精度^[15]范围内。由此表明，在4 ℃及室温条件下储存的消化酶制剂，在10个月的储存期内其消化能力是稳定的。结合前面的研究结果，尽管消化酶制剂的主要消化酶活性随其储存温度及储存时间的变化而变化，但并不影响仿生消化中其对玉米、大豆粕和小麦麸的消化程度。由此可以得出，消化酶制剂在4 ℃或者室温条件下储存10个月，其制备的模拟鸭肠液的消化能力是稳定的。消化酶制剂的储存温度与储存时间对饲料样品的干物质消化率与酶水解物能值的影响有交互效应，这表明在2种储存温度下，饲料样品的干物质消化率与酶水解物能值随储存时间的变异规律或变异程度是不同的，这主要是由于消化酶制剂在2种储存温度下储存12个月时的消化能力与储存1~10个月时的消化能力在变化上是不一致的，由此也表明消化酶制剂储存12个月时，其消化能力的不稳定性开始出现。

4 结论

① 消化酶制剂的储存温度不是导致消化酶活性损失的主要原因，而储存时间是消化酶活性降低的主要因素。

② 消化酶制剂在4 ℃或室温下储存10个月以内(模拟鸭肠液中α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别下降32.83%，33.54%和35.79%以内)时，仿生消化中模拟鸭肠液的消化能力是稳定的。

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