乳铁蛋白(lactoferrin)是一种能与铁结合的单体糖蛋白，它是转铁蛋白家族中的一员，分子质量约为80 ku^[1]。乳铁蛋白广泛存在于哺乳动物的外分泌物中，如乳液、泪液、唾液和小肠分泌液中。研究表明，乳铁蛋白作为一种转录激活因子，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、促进淋巴细胞增殖等功能，同时可以调节铁的吸收^[2]。研究表明，猪乳铁蛋 白(porcine lactoferrin)在母猪初乳中的分泌量远 远高于其他哺乳动物^[3]。摄入充足分量含有猪乳铁蛋白乳液的仔猪，在腹泻、呼吸道疾病、由感染引发的哮喘和断奶后贫血等疾病中表现出较低的发病率^[4,5,6]。本研究以表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，探索其对断奶仔猪生长性能及免疫机能的影响，为其作为潜在的饲用抗生素替代品提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验动物

断奶仔猪购自哈尔滨市阿城区育元养猪场。 1.2 菌种及主要试剂

pAMJ399/MG1363、pAMJ399-PLF/MG1363菌种及兔抗猪乳铁蛋白血清由本实验室保存。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)购自Sigma公司。溶菌酶、红霉素购自北京索来宝公司；GM17培养基为青岛高科园海博生物技术有限公司产品；IgG、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.3 重组乳酸乳球菌的发酵培养及鉴定

发酵罐中加入配制好的GM17培养基，115 ℃湿热灭菌30 min，冷却至32 ℃后补加红霉素(10 mg/mL)及pAMJ399-PLF/MG1363菌种(体积比1 ∶ 250)；发酵24 h后无菌条件下收集菌液。取发酵菌液1 mL，5 000 r/min离心10 min，分离上清液和菌体沉淀，以pAMJ399/MG1363发酵菌液为对照，同时进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。重组蛋白经SDS-PAGE后转印到硝酸纤维素膜上，以兔抗猪乳铁蛋白血清为一抗、HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，进行Western-blot分析，确定乳铁蛋白的表达。用试剂盒测定乳铁蛋白表达量。 1.4 基础饲粮

基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 61.00 豆粕 Soybean meal 32.00 植物油 Vegetable oil 2.00 磷酸氢钙 CaHPO4 1.60 石粉 Limestone 1.40 食盐 NaCl 0.30 多维 Multivitamin 0.25 赖氨酸 Lys 0.08 蛋氨酸 Met 0.37 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.66 粗蛋白质 CP 19.50 钙 Ca 0.80 有效磷 AP 0.66 赖氨酸 Lys 1.35 蛋氨酸 Met 0.61 1)预混料可为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet: VA 2 200 IU，VD3 200 IU，VE 16 mg，VK 1 mg，胆碱 choline 200 mg，泛酸 pantothenic acid 6 mg，VB2 2 mg，叶酸 folic acid 0.3 mg，烟酸 nicotinic acid 25 mg，VB1 1.6 mg，VB6 6 mg，生物素 biotin 0.08 mg，VB12 0.01 mg，Cu (as copper sulfate) 6 mg，Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 100 mg，Mn 20 mg，I 0.14 mg，Se 0.3 mg。 2)消化能为计算值，其余为实测值。DE was a calculated value,while the others were measured values．

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

试验采用单因素试验设计，选择36头体重相近的“杜×长×大”三元杂交的断奶仔猪(公母各占1/2)，分为3组，每组3个重复，每个重复4头仔猪，试验期21 d。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组在基础饲粮中添加20 mg/kg的黄霉素和110 mg/kg的金霉素，试验组按仔猪体重在基础饲粮中搅拌添加乳铁蛋白表达量为9.8 μg/mL的乳酸乳球菌发酵菌液，每头仔猪每天饲喂乳铁蛋白含量约为50 μg/kg。 1.6 饲养管理

仔猪饲养于封闭栏舍内，试验猪自由采食，自由饮水，饲喂期间，每天观察仔猪采食和健康状况，记录采食量，免疫消毒程序按猪场常规方法进行。 1.7 测定指标 1.7.1 生长性能

分别于试验开始和结束时，早晨空腹称重，称取仔猪余料量，计算仔猪的平均日增重、平均日采食量及料重比。 1.7.2 盲肠菌群数量

试验结束后，从每重复中随机选取2头体重最接近平均体重且健康状况较好的仔猪麻醉处死，解剖，剪取盲肠段，用线将盲肠两端扎紧，置于冰袋上送入实验室对盲肠内的大肠杆菌、乳酸乳球菌数量进行测定，以试验前的粪便作为对照。用1 g肠道内容物中细菌数量的对数[log(CFU/g)]表示。 1.7.3 肠黏膜形态

选取屠宰仔猪的十二指肠和空肠中段，剪取约1 cm组织样，10%中性福尔马林固定，送电镜实验室进行切片制备及扫描电镜观察，测量小肠绒毛高度与隐窝深度，取其平均值。 1.7.4 免疫器官指数

取屠宰仔猪的脾脏和胸腺，尽量剥离上面的脂肪等多余组织，称重，计算免疫器官指数。 免疫器官指数(g/kg)=脏器重(g)/体重(kg)。 1.7.5 血清中抗体、细胞因子及肠黏液中sIgA含量

试验结束时，所有试验仔猪均从前腔静脉采血5~10 mL，于37 ℃水浴中静置至析出血清，3 000 r/min离心10 min，分离血清分装于EP管中，置于-70 ℃低温冰箱中保存备用。

取屠宰仔猪的空肠起始端到回盲括约肌肠段，用冷双蒸水和磷酸盐缓冲液(PBS)依次流动冲洗后平铺于滤纸上，纵向剪开，暴露黏膜面，4 ℃低温PBS冲洗，用清洁载玻片轻轻刮取肠黏膜表面黏液，微量注射器收集刮取物0.5 mL左右，用4.5 mL PBS稀释并小心搅拌，使其完全溶解，4 ℃ 500 r/min离心5 min，收集上清液备用。

采用北京诚林生物科技有限公司生产的免疫球蛋白试剂盒，利用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定肠黏液中sIgA和血清中IgG及细胞因子IL-1、IL-2的含量。 1.8 数据统计

应用统计软件Minitab 15.0对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用Turkey法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。结果用平均值±标准差表示。 2 结 果 2.1 发酵培养重组乳酸乳球菌pAMJ399-PLF/MG1363的Western-blot鉴定

由图1可知，重组乳酸乳球菌pAMJ399-PLF/MG1363经发酵培养后，在上清液和沉淀中均表达了分子质量约73 ku的猪乳铁蛋白目的条带；ELISA试剂盒检测表达的猪乳铁蛋白在发酵菌液上清液中的含量约4.2 μg/mL，沉淀中含量约为5.6 μg/mL，乳铁蛋白总表达量约为9.8 μg/mL。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 重组乳酸乳球菌pAMJ399-PLF/MG1363的 Western-blot结果 Fig.1 The Western-blot result of recombinant Lactococcus lactis pAMJ399-PLF/MG1363 1:预染蛋白 marker;2:pAMJ399 / MG1363 菌种诱导的 上清液;3: pAMJ399-PLF / MG1363 菌种诱导的上清液; 4: pAMJ399 / MG1363 菌 种 诱 导 的 沉 淀; 5: pAMJ399-PLF / MG1363 菌种诱导的沉淀。 1: prestained protein marker; 2: supernatant induced by strain pAMJ399 / MG1363; 3: supernatant induced by strain pAMJ399-PLF / MG1363; 4: precipitation induced by strain pAMJ399 / MG1363; 5: precipitation induced by strain pAMJ399-PLF / MG1363.

由表2可知，与对照组相比，饲粮添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌显著提高了平均日增重(P<0.05)，极显著降低了料重比(P<0.01)，但与抗生素组差异不显著(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on growth performance of weaner piglets 项目 Items 对照组 Control group 抗生素组 Antibiotic group 试验组 Trial group 始重 Initial weight/kg 9.10±0.20 9.15±0.14 9.14±0.39 末重 Final weight/kg 21.51±1.20a 23.01±0.22b 22.77±0.64b 平均日增重 ADG/(kg/d) 0.59±0.01a 0.66±0.01b 0.65±0.01b 平均日采食量 ADFI/(kg/d) 1.64±0.01 1.68±0.01 1.66±0.01 料重比 F/G 2.78±0.03Aa 2.55±0.02Bb 2.56±0.03Bb 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on growth performance of weaner piglets

由表3可知，与对照组、抗生素组相比，饲粮添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌可降低盲肠中大肠杆菌数量，提高盲肠中乳酸乳球菌数量，均达到极显著水平(P<0.01)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪盲肠菌群数量的影响 Table 3 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on the number of cecal microflora of weaner piglets log(CFU/g) 项目 Items 对照组 Control group 抗生素组 Antibiotic group 试验组 Trial group 乳酸乳球菌数量 The number of Lactococcus lactis 饲喂前 Before feeding 7.83±0.65 7.69±0.54 7.53±0.67 饲喂后 After feeding 7.78±0.56Aa 7.94±0.61Aa 9.02±0.86Bb 大肠杆菌数量 The number of Escherichia coli 饲喂前 Before feeding 7.53±0.45 7.18±0.49 7.75±0.51 饲喂后 After feeding 7.85±0.58Bb 7.96±0.39Bb 6.74±0.42Aa

表3 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪盲肠菌群数量的影响 Table 3 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on the number of cecal microflora of weaner piglets log(CFU/g)

由表4可知，与对照组和抗生素组相比，饲粮添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌显著提高了十二指肠绒毛高度(P<0.05)，极显著提高了十二指肠绒毛高度/隐窝深度(P<0.01)，极显著提高了空肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度(P<0.01)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪肠黏膜形态的影响 Table 4 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on intestinal mucosal morphology of weaner piglets 项目 Items 对照组 Control group 抗生素组 Antibiotic group 试验组 Trial group 十二指肠 Duodenum 绒毛高度 Villous height/μm 393±16a 360±18a 470±17b 隐窝深度 Crypt depth/μm 269±15 250±16 265±12 绒毛高度/隐窝深度 V/C 1.46±0.13Aa 1.44±0.11Aa 1.77±0.19Bb 空肠 Jejunum 绒毛高度 Villous height/μm 356±11Aa 341±13Aa 463±12Bb 隐窝深度 Crypt depth/μm 303±10 254±13 287±15 绒毛高度/隐窝深度 V/C 1.17±0.18Aa 1.34±0.11Aa 1.61±0.08Bb

表4 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪肠黏膜形态的影响 Table 4 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on intestinal mucosal morphology of weaner piglets

由图2可知，试验组肠绒毛完整，整齐度均一，肠基部致密紧凑，无绒毛损伤或断裂的情况(图2-C、图2-F)；对照组的肠绒毛粗细不等，在十二指肠的肠基部有明显断裂出现(图2-A)；抗生素组的肠绒毛萎缩，肠绒毛表面凹凸不平，隐窝细胞增生，肠基部及隐窝内部断层较多(图2-B、图2-E)，由此可知抗生素对仔猪肠道造成一定程度的损伤。

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图2 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪肠黏膜形态的影响 Fig. 2 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on intestinal mucosal morphology of weaner piglets A、B、C 分别为对照组、抗生素组、试验组十二指肠;D、E、F 分别为对照组、抗生素组、试验组空肠。 A, B and C are the duodenum of control group, antibiotic group and trial group, respectively;D, E and F are the jejunum of control group, antibiotic group and trial group, respectively.

由图3、图4可知，试验组脾脏指数和胸腺指数显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)，这表明饲喂表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌可在一定程度上促进断奶仔猪免疫器官发育。

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图3 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪脾脏指数的影响 Fig.3 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on spleen index of weaner piglets 数据柱间无标注表示差异不显著(P>0.05)，标注“*”表示差异显著(P<0.05)，标注“* *”表示差异极显著(P<0.01)。下图同。 Value columns with no label mean no significant difference (P>0.05),while with “*” mean significant difference (P<0.05),and with “* *” mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图4 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对 断奶仔猪胸腺指数的影响 Fig.4 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on thymus index of weaner piglets

由图5、图6可知，与对照组相比，试验组血清中IgG和肠黏液中sIgA含量均得到显著提高(P<0.05)，但与抗生素组相比，均未达到显著水平(P>0.05)。

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图5 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对 仔猪血清IgG含量的影响 Fig.5 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on serum IgG content of weaner piglets

图 6(Figure 6)

Fig. 6

图6 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对 断奶仔猪肠黏液中sIgA含量的影响 Fig.6 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on intestinal mucus sIgA content of weaner piglets

由图7可知，与对照组和抗生素组相比，试验组血清中IL-1含量显著提高(P<0.05)；由图8可知，与对照组相比，试验组血清中IL-2含量极显著提高(P<0.01)，与抗生素组相比显著提高(P<0.05)。

图 7(Figure 7)

Fig. 7

图7 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对 断奶仔猪血清IL-1含量的影响 Fig.7 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on serum IL-1 content of weaner piglets

图 8(Figure 8)

Fig. 8

图8 表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对 断奶仔猪血清IL-2含量的影响 Fig.8 Effects of recombinant Lactococcus lactis expressing porcine lactoferrin on serum IL-2 content of weaner piglets

断奶是仔猪生长过程中最艰难的一段时期，在此时期内仔猪要经历一系列条件的改变^[7]。由于自身免疫系统不完善，在断奶过程中，仔猪抵抗力下降，容易引发腹泻等一系列肠道疾病，严重时可导致死亡。乳铁蛋白是乳汁中提取的一种天然蛋白，作为饲料添加剂具有安全可靠、抗菌、杀菌、无残留、无副作用等特点^[8]。

本试验在5~6周龄的断奶仔猪饲粮中添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌，与对照组相比，显著提高了仔猪平均日增重，极显著降低了料重比；但与抗生素组相比差异不显著，这与Wang等^[9]研究结果一致。乳铁蛋白的抑菌及杀菌作用可以减少或限制特定微生物的生长，从而起到调节肠道菌群的作用^[10]。本试验结果表明，与对照组、抗生素组相比，饲粮添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌可降低盲肠中大肠杆菌数量，提高盲肠中乳酸乳球菌数量，试验组与对照组和抗生素组相比均达到极显著水平。

小肠是营养物质吸收利用的主要场所，肠绒毛高度和隐窝深度反映小肠的功能状态，绒毛高度越高，隐窝深度越浅越利于饲粮中营养物质的吸收^[11]。Wang等^[9]试验结果表明，以乳铁蛋白作饲料添加剂饲喂仔猪，小肠绒毛高度极显著增加，隐窝深度降低。本试验在饲粮中添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌显著提高了十二指肠和空肠的绒毛高度，极显著提高了绒毛高度/隐窝深度。电镜下观察肠黏膜结构，与对照组和抗生素组相比，试验组的肠绒毛完整，整齐度均一，肠基部致密紧凑，无绒毛损伤或断裂的情况；对照组的肠绒毛短小，粗细不等，隐窝深度加深。其原因是乳铁蛋白能增强肠道对铁离子的溶解和吸收，避免其对肠道的直接刺激作用，进而降低肠道的损伤^[12]。

免疫器官指数是生长和免疫器官发育的一个重要指标。一般认为，免疫器官重量的增加是由于自身的细胞分裂增殖所致，是免疫增强的表现，免疫器官指数的升高说明器官成熟的速度更快。胡志和等^[13]用Balb/c小鼠建立免疫低下模型，灌服乳铁蛋白后，分别进行免疫脏器重量、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能指标的检测。结果显示，乳铁蛋白对免疫器官发育和免疫功能具有显著增强作用。本试验结果显示，试验组仔猪脾脏指数和胸腺指数显著高于对照组和抗生素组。

Sfeir等^[14]给小鼠连续口服6周牛乳铁蛋白，结果显示小鼠肠道分泌液中sIgA、IgG含量显著提高。单体中等^[15]采用重组猪乳铁蛋白饲喂断奶仔猪，检测对细胞因子IL-1和IL-2含量的影响。结果显示，仔猪血清中IL-2含量极显著提高，IL-1含量也有提高趋势。本试验结果显示，饲粮中添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌，与对照组相比，血清中IgG及肠黏液中sIgA含量显著提高，但与抗生素组相比未达到显著水平；血清中IL-2含量与对照组相比极显著提高，与抗生素组相比显著提高；与对照组和抗生素组相比，血清中IL-1含量显著提高。从整体上看，仔猪机体免疫球蛋白和肠黏液分泌抗体水平得到提高，主动免疫增强，最终达到提高自身抵抗力的目的。 4 结 论

以发酵培养的表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌pAMJ399-PLF/MG1363作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，能够提高仔猪生长性能，增强免疫力，将其作为仔猪饲料添加剂替代抗生素具有一定的应用前景。