抗生素作为饲料添加剂为畜牧业的发展作出了巨大贡献。然而抗生素的滥用和乱用，导致在畜产品中的残留及耐药菌株的产生。寻找无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的饲料添加剂成为动物营养学研究热点之一。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，不易使细菌产生耐药性；此外，还具有抗菌谱广、热稳定性和水溶性好、无残留等特点^[1]。在畜禽饲粮中添加抗菌肽，可减少或替代抗生素的使用，对降低畜禽产品中的抗生素残留，减少耐药细菌，保障人类健康均具有重要意义。前人对天蚕素抗菌肽的研究较多，但对猪源性PR39抗菌肽的研究较少。为此，本试验在断奶仔猪饲粮中添加猪源性PR39抗菌肽，研究其对断奶仔猪生产性能、血清生化指标、肠道菌群的影响，为进一步的科学研究提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

猪源性PR39抗菌肽由华南农业大学生命科学学院提供；天蚕素抗菌肽由成都金之源公司生产；吉他霉素由浙江国邦药业有限公司生产，规格为1×10⁹ U/kg；免疫球蛋白检测试剂盒和补体检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。

猪源性PR39抗菌肽的制备：从斜面试管中取少量导入了目的基因的毕赤酵母重组菌加入5 mL酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养基中，以30 ℃、200 r/min振荡试管24 h。按0.1%接种量，即将0.5 mL菌液转入装有500 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，以30 ℃、200 r/min振荡试管72 h。将菌液装入无菌离心管中，在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，用BMMY培养基重悬菌体(吸取BMMY培养基溶液，将菌体吹下来)，收集所有重悬液并用BMMY培养基定容至500 mL，最后将其转入1 L三角瓶中。以30 ℃、200 r/min振荡96 h进行发酵表达，期间每24 h加0.5 mL纯甲醇。将培养好的发酵液以4 ℃、5 000 r/min离心20 min，取上清液冷冻干燥，得到固体粉末状猪源性PR39抗菌肽。 1.2 试验设计

选用胎次、体重相近，健康状况良好的28日龄断奶仔猪120头，随机分为4组，每组3个重复，每个重复10头(公母各占1/2)。参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)设计基础饲粮(表1)。对照组饲喂基础饲粮，试验Ⅰ组饲喂基础饲粮+120 mg/kg吉他霉素，试验Ⅱ组饲喂基础饲粮+200 mg/kg天蚕素抗菌肽，试验Ⅲ组饲喂基础饲粮+300 mg/kg PR39抗菌肽。 1.3 饲养管理

试验自断奶仔猪28日龄始，试验期21 d。试验前充分冲洗和严格消毒猪圈。试验期间每天喂料5次，采用干拌料，以食槽略剩料为原则。试验猪自由采食、自由饮水。圈舍自然通风，定期打扫，常规接种免疫。 1.4 指标测定及方法 1.4.1 生产性能

断奶仔猪28日龄08:00空腹称重为初重，49日龄08:00空腹称重为末重。以每个重复为单位记录采食量。 平均日增重(ADG，kg/d)=总增重/试验天数； 平均日采食量(ADFI,kg/d)=饲粮总消耗量/试验天数； 料重比(F/G)=ADFI/ADG。 1.4.2 腹泻率

试验期间每天09:00观察猪肛门和猪粪情况，并做好记录。 腹泻率(DR，%)=(腹泻仔猪数/试验仔猪总数)×100。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 60.00 小麦麸 Wheat bran 3.00 豆粕 Soybean meal 23.00 鱼粉 Fish meal 4.00 乳清粉 Dried whey powder 5.00 豆油 Soybean oil 2.00 磷酸氢钙 CaHPO4 0.70 石粉 Limestone 0.80 L-赖氨酸盐酸盐 L-Lys·HCl 0.20 食盐 NaCl 0.30 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 13.96 粗蛋白质 CP 19.56 钙 Ca 0.743 磷 P 0.603 赖氨酸 Lys 1.242 蛋氨酸 Met 0.316 1)预混料(不含抗生素)为每千克饲粮提供 The premix (without antibiotics) provides the following per kg of the diet：Mg 100 mg，K 500 mg，Cu 5 mg，I 0.1 mg，Fe 100 mg，Mn 4 mg，Se 0.3 mg，Zn 100 mg，VA 4 000 IU，VD3 300 IU，VE 20 IU，VK 1 mg，硫胺素 thiamin 1 mg，核黄素 riboflavin 4 mg，泛酸 pantothenic acid 10 mg，烟酸 niacin 15 mg，吡哆醇 pyridoxine 1.5 mg，生物素 biotin 0.05 mg，叶酸 folic acid 0.3 mg，VB12 18 mg，胆碱 choline 500 mg。 2)消化能为计算值，其余为实测值。DE is a calculated value,while the others are measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

试验结束后，每组选取3头试验猪，前腔静脉采血后屠宰，静置1 h后3 000 r/min离心5 min，获取仔猪血清。运用试剂盒，采用免疫比浊法测定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)、补体4(C4)含量。 1.4.4 肠道菌群

断奶仔猪49日龄，每组选取3头猪屠宰，分别采集盲肠、结肠、直肠中的食糜，用平板培养法测定其中大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数，用1 g肠道食糜中细菌数的对数[lg(CFU/g)]表示。在无菌操作台中称取1 g食糜于试管中，加入无菌蒸馏水9 mL，振荡混匀，依次按10倍等比稀释至10^-7。分别吸取稀释液100 μL接种到麦康凯培养基，进行大肠杆菌培养；接种到乳酸杆菌选择性培养基，进行乳酸杆菌培养；接种到双歧杆菌培养基，进行双歧杆菌培养。培养皿放入大干燥器中，将点燃的蜡烛放入后密闭，大肠杆菌37 ℃恒温培养24 h，乳酸杆菌和双歧杆菌37 ℃恒温培养48 h，取出计数。 1.5 数据处理与分析

试验数据用Excel处理后，采用SPSS 19.0软件的ANOVA程序进行显著性分析，用LSD法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。测定结果以“平均值±标准差”表示。 2 结 果 2.1 抗菌肽对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响

由表2可知，各组初重、末重和ADFI差异均不显著(P＞0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组ADG均显著高于对照组(P＜0.05)，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)。试验Ⅰ组F/G显著低于对照组、试验Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)，试验Ⅱ和Ⅲ组间差异不显著(P＞0.05)，试验Ⅱ和Ⅲ组显著低于对照组(P＜0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组腹泻率显著低于对照组(P＜0.05)，试验Ⅱ组显著低于试验Ⅲ组(P＜0.05)，试验Ⅰ组与试验Ⅱ和Ⅲ组差异均不显著(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 抗菌肽对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of antimicrobial peptides on performance and DR of weaner piglets 项目 Items 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Experimental group Ⅰ 试验Ⅱ组 Experimental group Ⅱ 试验Ⅲ组 Experimental group Ⅲ 初重 IBW/kg 7.44±0.14 7.64±0.24 7.71±0.27 7.38±0.23 末重 FBW/kg 14.17±0.35 14.85±0.36 14.78±0.38 14.45±0.47 平均日增重 ADG/(kg/d) 0.320±0.010a 0.343±0.006b 0.337±0.006b 0.337±0.012b 平均日采食量 ADFI/(kg/d) 0.461±0.018 0.482±0.010 0.479±0.009 0.478±0.019 料重比 F/G 1.44±0.01c 1.40±0.01a 1.42±0.01b 1.42±0.01b 腹泻率 DR/% 18.70±1.42c 11.93±0.35ab 11.63±0.21a 13.47±0.70b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05). The same as below.

表2 抗菌肽对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of antimicrobial peptides on performance and DR of weaner piglets

由表3可知，试验Ⅱ和Ⅲ组血清IgG含量显著高于对照组(P＜0.05)；对照组与试验Ⅰ组之间，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组之间差异均不显著(P＞0.05)。试验Ⅱ组血清IgM含量显著高于对照组(P＜0.05)；对照组与试验Ⅰ、Ⅲ组之间，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间差异均不显著(P＞0.05)。各组之间血清IgA、C3和C4含量差异均不显著(P＞0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 抗菌肽对断奶仔猪血清免疫指标的影响 Table 3 Effects of antimicrobial peptides on serum immune indexes of weaner piglets g/L 项目 Items 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Experimental group Ⅰ 试验Ⅱ组 Experimental group Ⅱ 试验Ⅲ组 Experimental group Ⅲ 免疫球蛋白G IgG 2.113±0.037a 2.163±0.090ab 2.201±0.050b 2.207±0.099b 免疫球蛋白A IgA 0.583±0.015 0.596±0.020 0.610±0.020 0.603±0.012 免疫球蛋白M IgM 0.180±0.020a 0.203±0.006ab 0.220±0.010b 0.213±0.017ab 补体3 C3 0.172±0.021 0.181±0.055 0.195±0.015 0.190±0.036 补体4 C4 0.062±0.015 0.064±0.010 0.066±0.012 0.064±0.020

表3 抗菌肽对断奶仔猪血清免疫指标的影响 Table 3 Effects of antimicrobial peptides on serum immune indexes of weaner piglets g/L

由表4可知，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组盲肠和结肠大肠杆菌数显著低于对照组(P＜0.05)，试验Ⅰ组显著低于试验Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)，试验Ⅱ与Ⅲ组差异不显著(P＞0.05)。试验Ⅰ和Ⅱ组直肠大肠杆菌数显著低于对照组和试验Ⅲ组(P＜0.05)，试验Ⅰ 组显著低于试验Ⅱ组(P＜0.05)，对照组与试验Ⅲ 组差异不显著(P＞0.05)。各组盲肠、结肠和直肠乳酸杆菌数差异均不显著(P＞0.05)。试验Ⅰ和Ⅱ组盲肠双歧杆菌数显著高于对照组(P＜0.05)，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)，对照组与试验Ⅲ组差异不显著(P＞0.05)。各组之间结肠和直肠双歧杆菌数差异均不显著(P＞0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 抗菌肽对断奶仔猪肠道菌群的影响 Table 4 Effects of antimicrobial peptides on intestinal microflora of weaner piglets lg(CFU/g) 项目 Items 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Experimental group Ⅰ 试验Ⅱ组 Experimental group Ⅱ 试验Ⅲ组 Experimental group Ⅲ 大肠杆菌 Escherichia coli 盲肠 Cecum 7.98±0.06c 7.57±0.09a 7.71±0.08b 7.78±0.06b 结肠 Colon 7.96±0.05c 7.67±0.06a 7.77±0.05b 7.83±0.05b 直肠 Rectum 7.97±0.05c 7.75±0.03a 7.84±0.06b 7.94±0.03c 乳酸杆菌 Lactobacillus 盲肠 Cecum 8.02±0.07 8.01±0.08 8.00±0.07 8.02±0.04 结肠 Colon 7.81±0.07 7.74±0.05 7.66±0.13 7.80±0.04 直肠 Rectum 7.85±0.05 7.82±0.05 7.84±0.07 7.85±0.03 双歧杆菌 Bifidobacterium 盲肠 Cecum 7.43±0.10a 7.61±0.07b 7.62±0.07b 7.57±0.05ab 结肠 Colon 7.46±0.10 7.55±0.11 7.56±0.03 7.60±0.08 直肠 Rectum 7.49±0.04 7.57±0.15 7.52±0.03 7.59±0.07

表4 抗菌肽对断奶仔猪肠道菌群的影响 Table 4 Effects of antimicrobial peptides on intestinal microflora of weaner piglets lg(CFU/g)

仔猪在断奶后由于采食变化产生应激，容易造成生长受阻，生产性能下降。国内外研究者在断奶仔猪饲粮中添加中草药、酸化剂、酶制剂、微生态制剂等做了大量研究，在饲粮中添加抗菌肽越来越受到重视。对断奶仔猪的生产性能的效果，抗菌肽与某些抗生素相当甚至优于抗生素，但效果与剂量密切相关^[2]。饲粮中添加1%的防御素抗菌肽，断奶仔猪的ADG提高13.66%、F/G下降7.18%^[3]；饲粮添加3‰天蚕素抗菌肽，可提高仔猪ADG 22.2%，降低F/G 18.4%^[4]。仔猪饲粮中添加天蚕素抗菌肽250 mg/kg组在提高饲料转化率、降低饲料成本方面较之抗生素组效果更好^[5]；添加300 mg/kg与常用抗生素配伍可显著提高断奶仔猪末重、ADFI和ADG，且抗菌肽组末重和ADG略高于抗生素组，而F/G略低于抗生素组^[6]。本试验中，饲粮中添加200 mg/kg天蚕素抗菌肽，断奶仔猪的ADG提高了5.31%，F/G下降了1.39%；饲粮中添加300 mg/kg猪源性PR39抗菌肽，断奶仔猪的ADG提高了5.62%，F/G下降了1.39%。抗菌肽缓解了仔猪断奶后产生的应激，改善了肠道内环境，促进了对营养物质的消化吸收，提高了生产性能。 3.2 抗菌肽对断奶仔猪腹泻率的影响

由于仔猪自身免疫系统不完善，饲粮和生活环境急剧改变，断奶第1周仔猪容易腹泻。在仔猪饲粮中添加抗菌肽能显著降低腹泻率^[7]，饲粮添加3‰天蚕素抗菌肽可使其降低66.77%^[6]，1%防御素抗菌肽可使其降低76.08%^[3]。本试验中，饲粮中添加200 mg/kg天蚕素抗菌肽，断奶仔猪的腹泻率下降了37.81%；饲粮中添加300 mg/kg猪源性PR39抗菌肽，断奶仔猪的腹泻率下降了27.97%。猪源性PR39抗菌肽在体外抑菌试验中，对大肠杆菌有较强的抑制作用，对乳酸杆菌抑制作用不明显。通过对肠道菌群比例的测定，发现猪源性PR39抗菌肽能够抑制有害菌繁殖，促进有益菌增殖，改变了肠道菌群的结构，利于仔猪维持肠道稳态，通过这种方式最终降低了仔猪腹泻率。 3.3 抗菌肽对血清免疫指标的影响

仔猪的血液指标变化与健康状况、生长状态密切相关。免疫球蛋白是存在动物机体内广泛参与体液免疫反应的球蛋白，其中IgG和IgA具有抑制菌、抗病毒等免疫活性，IgM具有激活补体等功能^[8]。断奶仔猪饲粮中添加抗菌肽能显著提高免疫球蛋白水平^[9]，饲粮中添加320 g/t的天蚕素抗菌肽可提高断奶仔猪血清中IgG含量^[10]；肉仔鸡饲粮中添加天蚕素抗菌肽，显著促进了IgA分泌^[11]。本试验中天蚕素抗菌肽组和猪源性PR39抗菌肽组血清免疫指标优于抗生素组和对照组，抗生素组与对照组差别不大。抗生素对细菌的杀灭作用，减少了肠道有害菌的同时也杀灭了有益菌；通过肠道进入仔猪血液循环系统，对仔猪体内免疫造成影响。抗菌肽作为一类多肽，在肠道抑制细菌的同时被肠道的酶类降解，不会被吸收进入体内，也无残留。抗菌肽通过调节肠道菌群，减少有害菌对机体的入侵，提高仔猪免疫力。 3.4 抗菌肽对肠道菌群的影响

动物肠道内的正常菌群是重要的非特异性防御因素，它们的存在对于入侵的病原菌有拮抗作用^[12]。正常菌群彼此保持着一种动态平衡，与宿主的正常生理功能有着密切的关系^[13]。关于抗菌肽的抗菌机制，普遍认为是通过作用于细菌的细胞膜，破坏膜的完整性，从而导致细菌死亡^[14]。饲粮中添加外源性的抗菌肽，能够增加动物对外源性病原菌的抵抗能力^[15]。饲粮中添加抗菌肽，显著降低断奶仔猪大肠杆菌数、提高双歧杆菌和乳酸杆菌数^[9]；添加0.3%天蚕素抗菌肽能显著降低断奶仔猪粪中大肠杆菌数^[16]。研究表明，饲粮中添加2 000和4 000 U/kg抗菌肽，仔猪肠道大肠杆菌数分别下降了24.20%和27.01%^[17]。本试验中，饲粮中添加200 mg/kg天蚕素抗菌肽，断奶仔猪肠道的大肠杆菌数减少了2.47%，双歧杆菌数增加了1.43%；饲粮中添加300 mg/kg猪源性PR39抗菌肽，断奶仔猪肠道的大肠杆菌数减少了1.51%，双歧杆菌数增加了1.70%。抗菌肽抑制了大肠杆菌的增殖，使得肠道内大肠杆菌数下降，为有益菌的增殖提供了空间。随着大肠杆菌数减少和双歧杆菌数增加，肠道内菌群结构产生变化；有益菌群比例增加，提高了仔猪的消化机能，能够有效抑制入侵的病原菌，保障仔猪健康。 4 结 论

饲粮中添加PR39抗菌肽和天蚕素抗菌肽可改善断奶仔猪生产性能，降低腹泻率，提高血清免疫球蛋白含量，促进肠道有益菌增殖，抑制有害菌增殖。