2. 河南牧业经济学院, 郑州 450011;
3. 河南省畜牧局, 郑州 450008;
4. 河南德邻生物制品有限公司, 新乡 453000
2. Henan College of Animal Husbandry and Economics, Zhengzhou 450011, China;
3. Henan Animal Husbandry Bureau, Zhengzhou 450008, China;
4. Henan Delin Biological Product Co., Ltd., Xinxiang 453000, China
根据联合国粮农组织(FAO)2002年资料，世界上约有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染[ 1 ]，而危害饲料最严重的有黄曲霉(Aspergillus flavus)、镰刀菌和青霉3种。黄曲霉毒素是由黄曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物[ 2 ]，所产生的黄曲霉毒素包括B1、B2、G1、G2、M1、M2 6种类型，其中分布范围最广、化学性质最稳定、毒性最高的是黄曲霉毒素B1(AFB1)。AFB1在1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为甲类致癌物，严重时可导致肝癌甚至死亡[ 1,3 ]。动物在采食含有不同剂量黄曲霉毒素的饲粮时，表现为生长受阻、采食量减少、饲料利用率降低、被毛粗乱、精神沉郁、厌食、免疫抑制、肝损伤、黄疸、凝血病、贫血、出血性腹泻等不同症状，严重时可导致动物死亡。另外，饲料霉变后营养物质平均损失15%，甚至完全失去饲用价值[ 4 ]。霉菌毒素的脱毒方法一般有物理、化学和生物脱毒法。物理和化学方法因其操作困难、成本高、效果差，无法用此类方法对大批量的饲料进行处理，而且经化学脱毒处理后往往会降低饲料的营养品质和适口性，造成污染环境并存在安全隐患，故在实际生产中均不适用[ 5,6 ]。大量的研究证实，生物脱毒法是最有效的方法[ 7,8 ]。但生物脱毒法存在着优良菌种少和霉菌毒素降解酶效价低等问题。体外解毒试验表明，益生菌与霉菌毒素降解酶组合可有效地降解AFB1。本研究为了验证该组合体内试验的有效性，有意地提高肉鸡基础饲粮中AFB1的含量，通过肉鸡的饲养试验，研究肉鸡在采食高剂量AFB1饲粮时的反应及解毒效果，为最终消除霉菌毒素的危害奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验用微生物的准备乳酪杆菌、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、黄曲霉及产黄曲霉毒素降解酶的米曲霉由河南农业大学动物营养研究室分离和保存。乳酪杆菌、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌液体培养后制成冻干菌粉，其有效活菌数分别为1.58×1011、1.77×1010和1.28×109 CFU/g。各种微生物的培养参照前人的报道[ 9,10 ]。
1.2 AFB1降解酶粗酶液的制备挑取降解AFB1米曲霉菌株，将其涂布于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基固体平皿上。PDA培养基的制备方法为：葡萄糖20.0 g，可溶性淀粉6.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO4 1.0 g，酵母2 g，大豆蛋白胨5 g，琼脂粉15 g，用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL，在121 ℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌后倾倒于固体平皿。平皿接种后置于30 ℃恒温培养箱至孢子大量产生时(约96 h)，在平皿中加入适量灭菌生理盐水，用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用4层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×108 CFU/mL，按每瓶5 mL接种于固体发酵培养基中，混合均匀后置于30 ℃恒温培养箱中培养5 d后收获。按照固液比1 ∶ 2的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡1 h(浸泡过程中间断搅拌)。浸泡完成后先用8层纱布过滤发酵培养物，之后将滤液在12 000 r/min条件下离心5 min，再用定性滤纸过滤，最后用0.20 μm的滤膜过滤除菌后保存于4 ℃冰箱中，即为米曲霉所产降解AFB1的粗酶液。
1.3 益生菌和AFB1降解酶的制备乳酪杆菌、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌的干粉与降解AFB1的粗酶液按2 ∶ 3(m/v)的比例混合后，低温烘干制备益生菌和AFB1降解酶即为霉菌毒素解毒剂，具体配比流程和原理参照前期本研究室的研究结果[ 10 ]。
1.4 含有AFB1的发霉玉米制备挑取活化过的黄曲霉孢子，将其涂布于黄曲霉固体培养基上，培养至孢子大量产生时收获(约120 h)。在平皿中加入适量灭菌生理盐水，用涂布棒将平皿上的孢子刮下，制成黄曲霉孢子悬液(孢子浓度约为1×108 CFU/mL)。然后取粉碎后的玉米800 g(过8目筛)，装入2 L三角瓶中，加水400 mL搅拌均匀后于121 ℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。冷却后接种黄曲霉孢子悬液20 mL，用灭菌玻璃棒拌匀后置于28 ℃培养箱中恒温培养。7 d后收获，在121 ℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min以杀灭霉菌孢子，置于65 ℃烘箱中烘干。将不同三角瓶中的发霉玉米混合均匀，粉碎过20目筛，避光保存。测定其中AFB1的含量为3 961.04 μg/kg。
1.5 试验设计与饲养管理采用单因子试验设计，选择1日龄健康的健康爱拔益加(AA)肉仔鸡200只，随机分为5个组，每个组5个重复，每个重复8只鸡，公母各占1/2。A组(对照组)饲喂基础饲粮(AFB1含量178.79 μg/kg)，B(负对照组)、C、D和E组分别在基础饲粮添加100 μg/kg的AFB1，并按照0、0.05%、0.10%和0.15%的比例分别添加益生菌和AFB1降解酶。饲养试验在河南农业大学畜牧站进行，采用多层笼养，每天分3次定时饲喂试验饲粮，自由采食和饮水，24 h光照，自然通风，免疫程序按常规进行。试验期21 d。
1.6 试验饲粮试验饲粮参照NRC(1994)肉鸡饲养标准配制。用不同比例的发霉玉米替代基础饲粮中的正常玉米，饲粮为粉状。饲粮组成及营养水平见表1。
1.7 测定指标及方法 1.7.1 生长性能测定每天记录各重复鸡只的采食量，观察记录鸡的健康状况和腹泻情况。在第1天和第21天进行空腹称重，计算鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹泻率。
腹泻率=总腹泻天数/(鸡只总数×试验天数)。 1.7.2 饲料和粪便中常规营养成分测定采用全收粪法收集第19~21天的排泄物。小心去除毛、皮屑和杂物后将每天的排泄物混匀，滴加10％盐酸以固定氮，冷冻保存于-20 ℃冰箱中，试验结束后混匀3 d收集的排泄物，65 ℃烘干并充分回潮，粉碎后测定粪样中各项营养指标。饲料和粪样中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙和磷含量的测定分别按照GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002和GB/T 6437—2002方法进行。饲料中AFB1含量测定按照GB/T 17480—2008方法进行。
 | 表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) % |
鸡颈动脉放血处死后，剖腹取十二指肠、回肠、盲肠段食糜，置于5 mL灭菌离心管中。准确称取0.5 g置于含有4.5 mL灭菌生理盐水的10 mL离心管中，混合均匀，此时为10倍稀释。从10倍稀释液中准确吸取0.5 mL置于含有4.5 mL灭菌生理盐水的10 mL离心管中，此时为100倍稀释，按此方法将其稀释至10-7。取适当稀释度，用微量移液器吸取0.1 mL置于相应固体培养基中(每个稀释度2个重复)，涂布均匀后置于恒温培养箱培养。其中大肠杆菌数量测定采用伊红美蓝培养基，37 ℃有氧条件下培养48 h；乳酸菌数量测定采用MRS培养基，37 ℃厌氧条件下培养48 h。选取菌落数在10~100个的平皿进行计数，结果换算为每克内容物所含菌落数的对数[lg(CFU/g)]。
1.7.4 血清和肝脏生化指标的测定从每个重复中选择体重中等的鸡颈动脉采血，每只采血5 mL，3 000 r/min离心5 min分离血清，使用全自动血液生化自动分析仪测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷酰转肽酶(GH)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、胆碱酯酶(CHE)活性及总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、肌酐、葡萄糖、尿酸、尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量。血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。
1.8 数据统计分析试验数据以平均值±标准差表示，用SAS 6.12统计软件中ANOVA过程进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡生长性能的影响从表2可以看出，E组平均日采食量和平均日增重均显著高于B组(P<0.05)，分别提高了11.59%和16.87%，但与对照组差异不显著(P>0.05)。各组鸡只的腹泻率均显著低于B组(P<0.05)，C、D、E组分别降低了53.36%、55.32%和56.58%。各组鸡只的死亡率也显著低于B组(P<0.05)，C、D、E组分别降低了66.67%、77.78%和88.89%。
| 表2 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary probiotics and AFB1 degrading enzyme on growth performance of broilers (n=5) |
从表3可以看出，与B组相比，各组粗蛋白质、粗脂肪和磷的代谢率显著提高(P<0.05)，E组钙的代谢率显著高于B组(P<0.05)。
| 表3 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡营养物质代谢率的影响 Table 3 Effects of dietary probiotics and AFB1 degrading enzyme on nutrient metabolic rates of broilers (n=5) % |
从表4可以看出，饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶显著降低了十二指肠中大肠杆菌的数量，并显著提高了回肠和盲肠中乳酸菌的数量(P<0.05)。
| 表4 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡前期肠道微生物数量的影响 Table 4 Effects of dietary probiotics and AFB1 degrading enzyme on gut microbial number of broilers lg(CFU/g) |
从表5可以看出，E组血清间接胆红素含量显著高于B组(P<0.05)，低密度脂蛋白含量显著低于B组(P<0.05)，其他生化指标各组无显著差异(P>0.05)。
| 表5 饲粮中添加添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡血清生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary probiotics and AFB1 degrading enzyme on serum biochemical indexes of broilers (n=5) |
从表6可以看出，各组血清谷酰转肽酶活性显著高于B组(P<0.05)；C、D、E组总抗氧化能力显著高于B组(P<0.05)，但与A组差异不显著(P>0.05)。
| 表6 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡血清酶活性的影响 Table 6 Effects of dietary probiotics and AFB1 degrading enzyme on serum enzyme activities of broilers (n=5) |
霉菌毒素的污染给粮食生产业、养殖业以及饲料和食品加工企业带来了巨大的经济损失[ 11 ]。动物生产中，威胁家禽生产的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素和烟曲霉毒素等。王若军等[ 12 ]对中国的饲料原料和配合饲料中霉菌毒素的调查结果显示，有88%、84%、77%和60%的玉米中含有T-2毒素、黄曲霉毒素、烟曲霉毒素和赭曲霉毒素，且所有的玉米中均含有呕吐霉素和玉米赤霉烯酮，90%以上的配合饲料中均含有6种以上的霉菌毒素。
对于家禽来说，黄曲霉毒素能抑制家禽的生长、降低饲料转化率、增加死亡率和降低产蛋量等，造成严重后果。王慧荣等[ 13 ]在肉鸡饲料中添加450.6 μg/kg AFB1后，肉鸡的平均日采食量和平均日增重与对照组相比均有显著降低。曹红等[ 14 ]报道，在1~3周龄饲粮中添加100 μg/kg的AFB1对肉仔鸡的平均日采食量、平均日增重和末重均无显著影响，但从饲喂全期看，AFB1可引起肉仔鸡的平均日采食量、末重和平均日增重的下降。齐德生等[ 15 ]报道，肉仔鸡采食含有80 μg/kg AFB1的饲料7 d后料重比显著下降。本试验的基础饲粮中AFB1含量高达178.79 μg/kg，因此肉鸡的生长受到了严重的抑制，21日龄时最大体重仅为152.39 g。这说明在幼龄动物饲粮中，如果含有 高剂量的AFB1，即便加入益生菌和AFB1降解酶 也不能缓解黄曲霉毒素的危害。但是，本研究结果表明，益生菌和AFB1降解酶可显著地降低肉仔鸡的死亡率和腹泻率，并提高饲粮中营养物质的消化率，特别是高剂量添加益生菌和AFB1降解酶，可使肉仔鸡的平均日增重明显提高，这充分说明益生菌和AFB1降解酶起到了明显的解毒作用。 3.2 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡肠道微生物数量的影响
微生态制剂进入动物机体后通过调节消化道菌群平衡、增加有益菌的数目、抑制病原菌的生长对动物产生益生作用，如提高机体的抗病能力和消化吸收能力及抑制有害菌的增殖等。周健等[ 16 ]报道，饲粮中添加乳酸菌和地衣芽孢杆菌可以抑制肉鸡肠道中大肠杆菌的数量。Mohan等[ 17 ]研究表明，肉鸡饲粮中添加益生菌显著增加了乳酸菌的数量，降低了大肠杆菌的数量。本研究取得了与前人一致的结论，证明了益生菌在维持动物胃肠道微生物区系平衡和降低腹泻率方面的作用。
3.3 饲粮中添加益生菌和AFB1降解酶对肉鸡血清生化指标和酶活性的影响动物血清生化指标的变化反映了机体的代谢状况，本研究结果表明，除添加高添加量霉益生菌和AFB1降解酶可降低肉鸡血清中低密度脂蛋白和提高间接胆红素外，对整个肉鸡群的其他血清生化指标无明显影响，说明益生菌和AFB1降解酶可维持机体代谢的正常水平。一般而言，血清中低含量的低密度脂蛋白表明血清中胆固醇的转运通畅，有利于机体健康；而高含量的间接胆红素则预示着红细胞的破损和肝功能异常，不过总胆红素含量无明显差异，说明胆红素的代谢处于正常水平，有待于进一步研究。
另外，黄曲霉毒素能够改变血清中各种酶类的活性，当肝脏等组织器官受到损伤时，许多种酶类会释放出来进入血液中，使血清中多种酶的活性升高，因此血清中酶活性变化是评估动物组织和器官损伤程度的可靠依据。据报道，畜禽摄食含有黄曲霉毒素的饲料后，血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、总胆红素含量明显升高[ 18,19 ]，这就是由于黄曲霉毒素在家禽肝脏中蓄积造成了家禽肝脏机能的紊乱和肝细胞受损所致。在本试验中，尽管各组肉鸡血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶等酶的活性没有明显的改变，但谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性要高于前人所报道的122.25和6.25 U/L[ 20 ]。这主要是由于长期大量摄入AFB1，导致肝脏代谢机能紊乱，使血清中相关酶的活性升高。在正常范围内，谷酰转肽酶具有重要的生理功能，参与谷胱甘肽的代谢，对于氨基酸和蛋白质的吸收、分布和合成是必不可少的。益生菌和AFB1降解酶可提高肉鸡血清中谷酰转肽酶活性，说明该解毒剂可缓解霉菌毒素对肝脏等器官的损伤作用，提高蛋白质的合成能力。
在动物体内，抗氧化剂和助氧化剂之间存在微妙的平衡，尤其是在细胞层面，这种平衡负责协调多种新陈代谢途径，以维持免疫竞争、生长发育以及抗应激反应。机体抗氧化能力的强弱与健康程度存在密切联系，抗氧化能力是机体抵抗肿瘤的重要机制之一。生物细胞内有一套抗氧化的防御系统，该防御系统有酶促与非酶促2个体系。酶促体系主要包括，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶和还原酶等；非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属硫蛋白等。防御系统的氧化防护作用主要通过清除自由基和活性氧、分解过氧化物和除去起催化作用的金属离子3条途径来实现[ 21 ]。
霉菌毒素对动物机体的危害之一就是对动物体内抗氧化酶的影响。Choi等[ 22 ]发现老鼠血液中谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低主要是因为AFB1在体内的代谢。Rastogi等[ 23 ]以2 mg/kg体重向大鼠腹腔内注射AFB1，结果显示大鼠肝脏中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶以及谷胱甘肽还原酶的活性显著下降。本研究中，与B组相比，添加益生菌和AFB1降解酶的各组总抗氧化能力皆有显著的提高，这可能是由于益生菌和AFB1降解酶提高了动物机体防御系统的氧化保护作用，同时部分降解了饲料的AFB1，消除或减弱了AFB1对动物机体的危害。
4 结 论肉鸡饲粮中添加0.05%～0.15%益生菌和AFB1降解酶的复合物可以显著降低肉鸡的腹泻率和死亡率，并在一定程度上缓解AFB1对肉鸡生长性能的不良影响。
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