微生物蛋白质(MCP)是反刍动物的主要蛋白质来源，而氮源是限制瘤胃微生物生长生成MCP的关键因素之一，只有给瘤胃微生物提供充足的氮源和碳源，瘤胃微生物才能正常生长。然而，许多研究结果表明，不同来源的饲料在氨基酸利用率上存在较大的差异^{[ 1 ]}，并且即便动物采食理想氨基酸模式配制的纯化饲粮或氨基酸平衡的低蛋白质饲粮时，也不能得到最佳的生产性能和饲料效率，因而提出了肽的重要性。王梦芝等^{[ 2 ]}研究表明，特定缺省氨基酸对瘤胃混合微生物群系及其发酵有一定的影响作用，得出支链氨基酸是瘤胃混合微生物生长所必需的氨基酸。Russell等^{[ 3 ]}和Wright^{[ 4 ]}发现肽和氨同时作为氮源发酵时，瘤胃细菌利用肽的产量更高；微生物合成MCP时，利用肽的效率比利用氨基酸高。Argyle等^{[ 5 ]}表明，肽比氨作为氮源更能促进微生物的生长，而Maeng等^{[ 6 ]}则表明，肽主要是通过加快细菌的繁殖速度，缩短细胞分裂周期来促进细菌等微生物的生长。前人的研究主要集中在混合肽对瘤胃发酵的影响，而对不同氨基酸组成的三肽对瘤胃发酵的影响还未见报道。本试验挑选前人研究结果得出的对微生物生长影响比较重要的氨基酸进行随机组合，选取4种三肽来研究不同氨基酸组成的三肽对瘤胃发酵的影响，为小肽营养理论积累资料。

赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸(Lys-Lys-Lys)、甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(Gly-Gly-His)、蛋氨酸-丙氨酸-丝氨酸(Met-Ala-Ser)、缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸(Val-Tyr-Val)4种三肽，纯度≥99%，购于美国Sigma公司。

试验动物为四川农业大学动物营养研究所试验场的4只24月龄装有永久性瘤胃瘘管的健康阉割南江黄羊，体重约(25.48±1.51) kg。试验羊单圈饲养，每日08：30和16：30饲喂2次，常规光照，自由饮水。试验前用基础饲粮预试1周。

采用单因素试验设计，设5个组，采用不添加三肽的基础培养底物为对照组，4个试验组分别在基础培养底物中添加2%(干物质基础)的Lys-Lys-Lys、Gly-Gly-His、Met-Ala-Ser、Val-Tyr-Val 4种三肽，每组4个重复，每个重复取200 mg培养底物在体外进行培养发酵24 h。培养底物(即饲粮)组成及营养水平参照我国肉羊饲养标准(NY/T 816—2004)^{[ 7 ]}配制，营养水平满足日增重100 g/d时的需求，保持各组粗蛋白质和能量水平的一致。培养底物组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 培养底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of culture substrates (DM basis) % 项目Items 组别 Groups 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 玉米 Corn 25.00 25.00 25.00 25.00 25.00 玉米淀粉 Corn starch 13.30 17.32 16.82 16.78 16.64 稻草 Rice straw 29.10 30.91 30.19 30.13 29.95 苜蓿干草 Alfalfa hay 30.70 22.87 24.09 24.19 24.51 食盐 NaCl 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 磷酸氢钙 CaHPO4 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸 Lys-Lys-Lys 2.00 甘氨酸-甘氨酸-组氨酸 Gly-Gly-His 2.00 蛋氨酸-丙氨酸-丝氨酸 Met-Ala-Ser 2.00 缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸 Val-Tyr-Val 2.00 预混料 Premix1) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 9.68 9.68 9.68 9.68 9.68 粗蛋白质 CP 9.86 9.86 9.86 9.86 9.86 酸性洗涤纤维 ADF 25.54 25.54 25.54 25.54 25.54 中性洗涤纤维 NDF 40.56 40.56 40.56 40.56 40.56 钙 Ca 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 总磷 TP 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 1)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kilogram of diets：VA 2 200 IU，VD 275 IU，VE 100 IU，Co (CoCl2·6H2O) 0.15 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 10 mg，I (KI) 0.5 mg，Fe (FeSO4·7H2O) 40 mg，Mn (MnSO4·5H2O) 70 mg，Se (Na2SeO3) 0.05 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 60 mg。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 培养底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of culture substrates (DM basis) %

1.4 人工唾液配制及瘤胃液采集

人工唾液参照Menke等^{[ 8 ]}的方法配制。

瘤胃液的采集：通过瘤胃瘘管，利用真空抽滤器在早饲前抽取4只南江黄羊的瘤胃液，混合后经4层纱布过滤至保温瓶中，连续通入CO₂以保持厌氧。

准确称取各组饲粮样品200 mg(干物质基础)，置于100 mL玻璃针筒发酵管底部，加入混合均匀后的培养液(瘤胃液与人工唾液按1 ∶ 2混合)30 mL，于39 ℃水浴振荡器中厌氧培养，分别培养2、4、8、12、24 h。各个时间点每组均设4个平行重复。将每个时间点发酵完的玻璃发酵管取出，立即测定其培养液的pH，然后将剩下的培养液经尼龙袋(孔径为42 μm，袋平面为80 mm×120 mm)过滤后迅速分装于10 mL离心管中，放入冰箱(-25 ℃)冷冻保存，用于测定氨态氮(NH₃-N)、挥发性脂肪酸(VFA)浓度以及MCP产量。

pH采用上海雷磁pHS-3D型pH计进行测定；培养液的NH₃-N浓度测定参照冯宗慈等^{[ 9 ]}改进的方法；VFA浓度的测定参照胡红莲等^{[ 10 ]}的方法；MCP产量的测定参照Zinn等^{[ 11 ]}建立和Makkar等^{[ 12 ]}改进的嘌呤法。

试验数据首先通过Excel 2010进行初步 整理，然后运用SPSS 18.0软件中的one-way ANOVA过程进行方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，显著水平为P<0.05。

由表2可知，各组不同时间点的pH在6.63～7.00范围内变动，在瘤胃液pH正常范围内，且各组pH随培养时间的变化趋势一致，基本趋向于逐渐降低。在整个培养过程中，除了2 h时的Gly-Gly-His组pH与对照组差异不显著(P>0.05)以外，各时间点试验组pH均显著低于对照组(P<0.05)，其中Val-Tyr-Val组pH最低，并且在4、24 h时显著低于其他试验组(P<0.05)，而在8 h时各试验组pH除Gly-Gly-His组与Val-Tyr-Val组间差异显著(P<0.05)外，其他试验组间差异不显著(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同氨基酸组成的三肽对培养液pH的影响 Table 2 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on pH in culture medium 培养时间 Incubation time/h 组别 Groups 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 2 7.00±0.04a 6.94±0.02bc 6.96±0.03ab 6.91±0.02cd 6.88±0.02d 4 6.85±0.03a 6.81±0.02b 6.79±0.02b 6.79±0.02b 6.75±0.01c 8 6.96±0.03a 6.87±0.03bc 6.89±0.04b 6.85±0.03bc 6.84±0.02c 12 6.86±0.02a 6.78±0.03b 6.80±0.02b 6.73±0.02c 6.70±0.02c 24 6.78±0.02a 6.73±0.02b 6.72±0.02b 6.67±0.02c 6.63±0.01d 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 不同氨基酸组成的三肽对培养液pH的影响 Table 2 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on pH in culture medium

由表3可知，在整个培养过程中各组NH₃-N浓度变化规律相似，均为先升高后逐渐降低，培养初期NH₃-N浓度持续升高，在8 h时达到最大值，随后NH₃-N浓度逐渐下降。除24 h时各试验组的NH₃-N浓度与对照组差异不显著(P>0.05)外，其余时间点的各试验组NH₃-N浓度均显著低于对照组(P<0.05)；在2、4、8 h时，Gly-Gly-His组显著高于其余试验组(P<0.05)；在12、24 h时，试验组间差异不显著(P＞0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同氨基酸组成的三肽对培养液NH3-N浓度的影响 Table 3 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on NH3-N concentration in culture medium mg/dL 培养时间 Incubation time/h 组别 Groups 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 2 12.61±0.57a 10.64±0.17c 11.45±0.20b 10.38±0.14cd 10.16±0.08d 4 15.09±0.23a 12.84±0.47c 13.31±0.23b 12.58±0.28cd 12.24±0.05d 8 20.81±0.46a 17.98±0.33c 19.03±0.33b 17.66±0.35c 17.55±0.08c 12 17.64±0.51a 15.69±0.73b 15.82±0.21b 15.30±0.26b 15.52±0.98b 24 14.25±0.95 13.65±0.62 13.42±0.22 13.55±0.48 13.30±0.36

表3 不同氨基酸组成的三肽对培养液NH3-N浓度的影响 Table 3 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on NH3-N concentration in culture medium mg/dL

由表4可知，在整个培养过程中，总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸都呈现出逐渐上升的趋势。各时间点的试验组TVFA、乙酸、丙酸浓度都显著高于对照组(P<0.05)，乙酸/丙酸显著低于对照组(P<0.05)，而丁酸浓度并无显著差异(P>0.05)。各时间点的Val-Tyr-Val组TVFA、乙酸、丙酸浓度显著高于其他试验组(P<0.05)，乙酸/丙酸显著低于其他试验组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同氨基酸组成的三肽对培养液VFA浓度的影响 Table 4 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on VFA concentration in culture medium 项目 Items 培养时间 Incubation time/h 组别 Groups 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 2 17.91±0.64c 21.91±0.35b 21.30±0.47b 22.04±0.73b 25.01±0.68a 4 22.51±0.74c 25.32±0.66b 24.92±1.18b 26.19±0.82b 28.80±0.71a 8 27.94±0.68d 30.13±0.81c 30.06±0.55c 31.45±1.06b 34.80±0.87a 12 32.20±0.40d 36.34±1.00c 36.49±0.78c 38.64±0.81b 40.94±0.51a 24 36.35±0.54c 41.03±0.96b 40.28±0.55b 41.51±1.16b 43.27±1.06a 乙酸 Acetate/(mmol/L) 2 12.06±0.34c 14.34±0.30b 13.87±0.31b 14.25±0.35b 15.64±0.47a 4 14.99±0.53c 16.44±0.32b 16.43±0.84b 17.25±0.42b 18.36±0.51a 8 18.66±0.42d 19.80±0.51c 19.82±0.51c 20.90±0.62b 22.55±0.60a 12 21.36±0.17d 23.69±0.57c 23.71±0.45c 25.49±0.51b 26.27±0.38a 24 24.38±0.23d 26.72±0.73bc 26.36±0.50c 27.19±0.99bc 27.74±0.75a 丙酸 Propionate/(mmol/L) 2 4.46±0.13d 6.25±0.13b 5.96±0.12c 6.27±0.13b 7.45±0.18a 4 5.45±0.18d 6.92±0.20c 6.90±0.40c 7.34±0.20b 8.23±0.13a 8 6.62±0.18d 8.04±0.22c 8.04±0.14c 8.77±0.27b 9.71±0.29a 12 7.47±0.06d 9.49±0.31c 9.46±0.20c 10.40±0.26b 11.07±0.20a 24 8.33±0.06d 10.45±0.23bc 10.24±0.19c 10.82±0.38b 11.44±0.29a 丁酸 Butyrate/(mmol/L) 2 1.39±0.18b 1.32±0.15b 1.48±0.28b 1.52±0.29b 1.92±0.23a 4 2.07±0.10a 1.97±0.22a 1.59±0.16b 1.60±0.31b 2.22±0.19a 8 2.67±0.09a 2.29±0.20b 2.21±0.19b 1.79±0.36c 2.54±0.09ab 12 3.36±0.25ab 3.15±0.29b 3.31±0.21ab 2.75±0.16c 3.60±0.07a 24 3.64±0.35b 3.86±0.30ab 3.68±0.14ab 3.51±0.29b 4.09±0.14a 乙酸/丙酸 Acetate/propionate 2 2.71±0.02a 2.29±0.02bc 2.33±0.01b 2.27±0.03c 2.10±0.04d 4 2.75±0.01a 2.37±0.02b 2.38±0.02b 2.35±0.04b 2.23±0.06c 8 2.82±0.02a 2.46±0.01b 2.47±0.02b 2.38±0.04c 2.32±0.02d 12 2.86±0.01a 2.50±0.02b 2.51±0.02b 2.45±0.03c 2.37±0.04d 24 2.93±0.01a 2.56±0.03b 2.57±0.04b 2.51±0.02c 2.43±0.01d

表4 不同氨基酸组成的三肽对培养液VFA浓度的影响 Table 4 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on VFA concentration in culture medium

由表5可知，在整个培养过程中，各试验组MCP产量的变化趋势基本相同，都是随着培养时间的延长而逐渐增加，到12和24 h时趋于平稳。各时间点的试验组与对照组相比，MCP产量显著升高(P<0.05)。除2和24 h的Val-Tyr-Val组和Met-Ala-Ser组差异不显著(P>0.05)以外，Val-Tyr-Val组在各时间点的MCP产量均显著高于其他试验组(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 不同氨基酸组成的三肽对培养液MCP产量的影响 Table 5 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on MCP yield in culture medium mg/L 培养时间 Incubation time/h 组别 Groups 对照 Control Lys-Lys-Lys Gly-Gly-His Met-Ala-Ser Val-Tyr-Val 2 4.65±0.35c 6.28±0.43b 6.17±0.23b 6.81±0.26a 7.07±0.37a 4 5.22±0.27c 6.95±0.25b 6.62±0.32b 7.02±0.20b 7.61±0.32a 8 6.07±0.23c 7.56±0.32b 7.38±0.17b 7.69±0.21b 8.19±0.25a 12 6.74±0.29d 7.82±0.16bc 7.50±0.17c 8.14±0.27b 8.54±0.22a 24 6.92±0.20d 7.82±0.14b 7.42±0.17c 8.28±0.15a 8.31±0.23a

表5 不同氨基酸组成的三肽对培养液MCP产量的影响 Table 5 Effects of tri-peptides consisting of different amino acids on MCP yield in culture medium mg/L

瘤胃液pH是一项瘤胃发酵状况的重要指标，其大小受很多因素的影响，通常情况下瘤胃内的pH在6～7之间变动。若瘤胃液pH偏小，容易引起瘤胃亚急性酸中毒(SARA)^{[ 13 ]}，使瘤胃内微生物菌群结构发生大的改变，不利于瘤胃微生物的发酵。本试验中，各组各时间点培养液的pH在6.63～7.00之间，说明各组培养液的发酵都在正常进行。各个试验组pH都显著低于对照组，说明三肽的氨基酸能促进瘤胃碳水化合物的发酵，使得酸的生成量增多，这与王梦芝等^{[ 14 ]}对不同分子形式氮源对瘤胃发酵影响的研究结果一致，即与氯化铵相比，寡肽和小肽明显降低瘤胃培养液中的pH。本试验各试验组之间，Val-Tyr-Val组的pH比其他试验组的值更低，显示了这组的三肽组合更能够促进瘤胃微生物对底物的发酵，生成更多的酸。在整个培养过程中，pH都表现为降低的趋势，这与王梦芝等^{[ 2 ]}对特定氨基酸缺省底物体外培养试验以及殷云浩等^{[ 15 ]}二肽对山羊体外瘤胃发酵试验的研究结果一致，其原因可能是由于本试验体外发酵的不连续性，发酵产物VFA不能及时排走所致。

氨是瘤胃中微生物生长的主要氮源，氨氮浓度也是反映饲粮氮降解和微生物氨利用的综合指标。Satter等^{[ 16 ]}的试验研究表明，当瘤胃内氨氮浓度小于5 mg/dL时，由于发酵的“解偶联”作用而导致微生物的生长速率减慢，MCP产量降低。Leng等^{[ 17 ]}提出，微生物生长对NH₃-N浓度耐受的临界范围为6～30 mg/dL。本试验中，各组培养液NH₃-N浓度均在10.17～20.82 mg/dL范围内，在微生物生长所需氨氮适宜浓度范围之内，表明各培养液中的微生物均能正常生长。本研究发现，添加三肽可以降低培养液中NH₃-N浓度，这与殷云浩等^{[ 15 ]}和Jones等^{[ 18 ]}的肽的瘤胃发酵试验研究结果相一致，说明饲粮中添加肽有利于微生物对氨氮的利用。Russell等^{[ 3 ]}试验研究发现肽能促进发酵非结构性碳水化合物(NSC)微生物的生长，提示肽可以通过促进NSC微生物的生长提高碳水化合物发酵速率。因此，饲粮中添加肽促进了NSC微生物对氮的利用效率，且不同的氨基酸组成的三肽对氮的利用效率不同。在本试验中，以Val-Tyr-Val组的NH₃-N浓度最低，说明此组组合更能促进微生物对氨氮的利用，氮利用效果最好，但是其具体的原因还有待于进一步的研究和验证。

VFA是瘤胃微生物发酵碳水化合物的终产物之一,是反刍动物的主要能源，可至少提供50%的总消化能^{[ 19 ]}。饲料发酵的VFA生成量是衡量微生物活力的重要指标^{[ 20 ]}。在本试验中，试验组的乙酸、丙酸、TVFA浓度显著高于对照组，说明不同氨基酸组成的三肽促进了瘤胃微生物对碳水化合物的发酵，其中以Val-Tyr-Val组最佳。本试验的研究还发现三肽还具有降低培养液中乙酸/丙酸的作用，这与王文娟等^{[ 21 ]}和殷云浩等^{[ 15 ]}研究的关于肽在瘤胃体外发酵的结果相一致。综上说明饲粮中添加氨基酸组成的三肽可以改变瘤胃发酵类型，促进碳水化合物的发酵的作用，提高能量利用效率。并且不同的氨基酸组成的三肽试验结果不同，其中以Val-Tyr-Val组最佳，其TVFA浓度显著高于其他组，乙酸/丙酸显著低于其他组，表明Val-Tyr-Val组更能促进微生物发酵以及能量的利用。

瘤胃MCP产量是衡量瘤胃发酵最重要的指标。Chen等^{[ 22 ]}的研究结果表明，奶牛瘤胃液内肽的不足会限制瘤胃微生物的生长，而且程茂基等^{[ 23 ]}的试验研究也表明，肽能促进细菌等微生物的生长。王洪荣等^{[ 24 ]}和王梦芝等^{[ 14 ]}的试验研究结果都发现肽能提高瘤胃MCP的产量。殷云浩等^{[ 15 ]}研究结果也表明不同氨基酸组成的二肽能提高瘤胃MCP的产量。综合前人的研究结果表明，肽能够促进瘤胃微生物的生长，提高MCP的产量。本研究也有同样的结果，各试验组的MCP产量显著高于对照组，并且不同氨基酸组成的三肽对微生物生长的促进作用效果不同，其中以Val-Tyr-Val三肽促进MCP产量的效果最优，可能是由于NH₃-N利用率的增加使得微生物增加了对氮的利用，并且由于微生物利用发酵生成的VFA可作为MCP的碳架，因此，VFA的增加促进了瘤胃MCP的生成。但是造成不同三肽效果不一样的原因可能与其结构和氨基酸组成不同相关，但是其具体原因还有待于进一步的研究和探讨。

反刍动物饲粮中添加三肽可降低瘤胃中pH和NH₃-N浓度，促进瘤胃微生物发酵，增加饲粮的利用率，提高乙酸、丙酸、TVFA浓度和MCP产量。本试验中，以添加2%的Val-Tyr-Val三肽效果最好。