紫花苜蓿是世界上重要的牧草之一，素有“牧草之王”的美称。它不仅产量高，而且草质优良，被各种畜禽所喜食。美国、加拿大等奶业发达的国家通过大量的科学研究已经肯定了苜蓿干草的高营养价值以及对奶牛的优良饲养效果，并确立了以苜蓿干草为基础饲粮的奶业生产体系和更深入的奶牛营养研究。但是我国对苜蓿干草作为肉羊的饲粮组分的科学研究和生产实践是在近几年才开始的。苜蓿干草可以替代部分谷物饲料，按能量计算其替代率为1.6 ∶ 1.0，按能量和蛋白质综合效能计算其替代率为1.2 ∶ 1.0。饲养试验是评定饲料营养价值最准确、最直观的方法，它可以根据畜产品产量和质量的变化来评定该饲料的营养价值以及该饲料对其他饲料的相对营养价值。苜蓿中的碳水化合物在瘤胃中发酵产生挥发性脂肪酸，是反刍动物能量的主要来源。同时苜蓿又是高蛋白质饲料，可以使绵羊的生产性能获得更理想的效果。孙亚波等[ 1 ]研究表明，成年母羊对苜蓿的纤维类和脂肪的消化率均高于育成公母羊，而育成公母羊对苜蓿能量的表观代谢率和利用率均高于成年公母羊。靳晓霞等[ 2 ]指出使用苜蓿干草提高饲粮粗蛋白质含量并保持适宜的能量和蛋白质比[消化能(MJ) ∶ 粗蛋白质(g)为(1.06~1.08) ∶ 10.00]，可使越冬母羊不掉膘，降低饲粮成本。近年来反刍动物蛋白质新体系的研究重点已经转向小肠可吸收氨基酸的配比及平衡上。苜蓿中含有20多种必需氨基酸，但是苜蓿鲜草的供应受季节和苜蓿生长发育状况的限制，将苜蓿鲜草晒制成青干草可以缓解苜蓿青饲放牧与生长季节的矛盾。本试验旨在研究粗饲料中苜蓿干草水平对杜寒杂交羊瘤胃发酵参数及十二指肠食糜氨基酸含量的影响，为肉羊的生产实践提供理论依据，加速养羊业在我国的发展。
1 材料与方法 1.1 试验设计选用5只安装永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘 管的杜寒杂交羊(F1代)，采用5×5的拉丁方设计，设计5个水平的苜蓿干草，其在粗饲料中的比例(干物质基础)分别为0(对照组)、10%(试验Ⅰ组)、20%(试验Ⅱ组)、30%(试验Ⅲ组)和40%(试验Ⅳ组)。粗饲料是由豆腐渣、玉米青贮、花生秧混合制成的。基础饲粮精粗比为28 ∶ 72。试验饲粮参照中我国《肉羊营养标准》(NY/T 816—2004)配制，并结合生产进行适当的调整，其组成及营养水平见表1。共5期试验，每期包括7 d预试期和10 d正试期。
 | 表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrition levels of test diets (DM basis) |
试验在河南省封丘县应举循环农业公司进行。试验前对所有羊舍进行清扫、消毒，然后将羊称重、分组并进行驱虫和防疫。在预试期给所有羊饲喂相同的基础饲粮，同时认真观察羊的行为和健康状况，以便及时调整。正试期开始，饲喂对应的试验饲粮。每天06:00和18:00共饲喂2次，自由采食粗饲料，先粗后精，粗饲料计量不限量，饲喂后1 h再饲喂精饲料，每天每只羊饲喂0.28 kg精饲料。自由饮水。羊舍每天清扫2次，保持清洁卫生，定期消毒。
1.3 样品采集及测定方法瘤胃液的采集：在每期试验正试期第5天进行瘤胃液的采集，如Whelan等[ 3 ]所述分别在采食前1 h(计作采食后-1 h)，采食后1、3、5、7、9 h取样，立即用PHB-5笔式pH测定仪测定pH。然后用4层纱布过滤，并加入1%的饱和氯化汞(HgCl2)溶液，然后在-20 ℃冰箱中保存，备用于测定瘤胃液中氨态氮、尿素氮、挥发性脂肪酸的含量。氨态氮含量的测定参照冯宗慈等[ 4 ]所述的方法；尿素氮含量采用脲酶法测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所；挥发性脂肪酸含量用气相色谱法进行分析，色谱仪：Dionex ICS-3000离子色谱仪，分析柱：IonPac AS-HC分离柱(4 mm×250 mm)与IonPac AG 11-HC保护柱(4 mm×50 mm)，淋洗液：1 mmol/L氢氧化钠(NaOH)，流速：0.6 mL/min，柱箱温度：30 ℃，进样体积：25 μL,检测方式：抑制型电导，ASRS 300 4 mm,自循环模式。
十二指肠食糜的采集：从正试期的第8天开始采集十二指肠食糜，每天采4次，每次约30 mL，连续采3 d。每天采样时间点交替变化使3 d的采样点均匀分布于不同的时间点，具体策略为：第1天的01:00、07:00、13:00、19:00；第2天的03:00、09:00、15: 00、21:00；第3天的05: 00、11:00、17:00、23:00。上述采样时间点组合后代表全天24 h每2 h采样1次，将每天各时间点采集的食糜样品等量混合制成混合样品，在冷冻干燥机中-158 ℃低温冷冻干燥后粉碎，然后用 高效液相色谱仪(Waters 2695XE,检测器Waters 2996)进行各氨基酸含量的测定。
1.4 数据处理及统计分析试验数据用Excel进行初步统计，以重复作为统计单位，数据用平均值±标准误表示，采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析进行显著性分析。
2 结果与分析 2.1 苜蓿干草对杜寒杂交羊的瘤胃发酵参数的影响 2.1.1 pH由表2可以看出，随着采食后时间的延长，对照组和试验Ⅰ、Ⅱ组瘤胃液pH是呈现升高后降低，然后再逐渐升高的趋势，总体上为采食后3 h达到最低值；试验Ⅲ、Ⅳ组呈现的是稍微降低，然后急剧降低后逐渐升高的趋势，采食后3 h达到最低值，变化趋势基本一致。
| 表2 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液pH的影响 Table 2 Effects of dried alfalfa hay on pH in rumen fluid of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep |
由表3可以看出，随着采食时间的变化对照组和试验Ⅰ组瘤胃液氨态氮含量均是先降低然后升高，采食后3 h达到峰值，然后下降；试验Ⅱ组是稍微降低后升高，采食后3 h达到峰值，然后逐渐降低；试验Ⅲ、Ⅳ组都是先升高然后降低，试验Ⅲ组在采食后3 h达到峰值，试验Ⅳ组在采食后1 h达到峰值。
| 表3 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液氨态氮含量的影响 Table 3 Effects of dried alfalfa hay on ammonia nitrogen content in rumen fluid of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep mg/dL |
由表4中可以看出，瘤胃液尿素氮含量在采食前后呈现先降低后升高而后逐渐降低的趋势，仅试验Ⅲ组尿素氮含量是先稍微升高然后降低，试验Ⅰ组在采食后5 h达到采食后的最高值，其他组都是在采食后3 h达到采食后的最高值。整体来讲，除了采食后5 h试验Ⅰ组显著高于其他各组(P＜0.05)外，各时间点试验组之间及试验组和对照组之间差异均不显著(P>0.05)。
| 表4 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液尿毒氮含量的影响 Table 4 Effects of dried alfalfa hay on urinary nitrogen content in rumen fluid of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep mmol/L |
由表5可以看出，与对照组相比，各试验组的丙酸含量在采食前后无显著差异(P>0.05)；与对照组相比，各试验组的乙酸和丁酸含量在采食前1 h至采食后7 h均无显著差异(P>0.05)；采食后1 h乙酸和丁酸含量均为试验Ⅱ最低，显著低于试验Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),而与对照组和试验Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，试验Ⅱ组和试验Ⅲ、Ⅳ组差异显著(P<0.05)；采食后9 h的乙酸和丁酸含量均为试验Ⅲ组最高，显著高于对照组和试验Ⅳ组(P<0.05)，试验Ⅰ和Ⅱ组与其他各组差异均不显著(P>0.05)。
| 表5 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响 Table 5 Effects of dried alfalfa hay on volatile fatty acid contents in rumen fluid of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep % |
由表6可以看出，在采食前后各时间点，试验Ⅰ组的乙酸/丙酸都比较低，试验Ⅱ、Ⅲ组的乙酸/丙酸较对照组有上升的趋势，试验Ⅳ组的乙酸/丙酸和对照组接近。
| 表6 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液乙酸/丙酸的影响 Table 6 Effects of dried alfalfa hay on acetic acid/propionic acid in rumen fluid of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep |
由表7可以看出，十二指肠食糜必需氨基酸中的苏氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的含量，各组间差 异均不显著(P>0.05)，试验Ⅰ、Ⅳ组缬氨酸、蛋氨 酸和亮氨酸含量显著高于对照组(P<0.05)，试验组之间差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组的异亮氨酸含量显著高于试验Ⅲ组(P<0.05)，和对照组及其他试验组差异不显著(P>0.05)。
| 表7 苜蓿干草对杜寒杂交羊十二指肠食糜氨基酸含量的影响 Table 7 Effects of dried alfalfa hay on amino acid contents in duodenal chyme of Dorper×thin-tailed Han crossbred sheep % |
pH反应了瘤胃中微生物的发酵状况，是评价瘤胃发酵的一项综合性指标[ 5 ]。王庆丽等[ 6 ]指出，牛正常瘤胃液的pH在5.50~6.80变化，最佳pH在6.00~6.30。韩正康等[ 7 ]和Murphy等[ 8 ]指出，瘤胃液pH的变化范围是5.00~7.50，一般于饲喂后2~6 h达到最低值。瘤胃液pH受到很多因素的影响，如：饲粮精粗比、饲料加工方式、采食量、饲粮干物质含量等。本试验的各组瘤胃液pH的变化范围为5.92~6.34，基本保持在最佳范围内，采食后3 h，瘤胃液pH达到最低状态。有报道称真菌生长的最适pH是6.50~6.80，靠发酵提供能量[ 9 ]。也有研究表明，纤维素分解菌适宜的pH一般大于6.30，当pH下降到6.00以下时，就能完全抑制纤维素分解菌的活力[ 10 ]。魏德泳等[ 11 ]研究表明，随着非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维的提高，瘤胃液pH显著降低，且均在采食后2~4 h达到最低值。李勇等[ 12 ]研究表明，在饲粮中消化能、粗蛋白质一致的条件下，瘤胃液pH达最低值的时间不同。本试验中瘤胃液pH达到最低值的时间为采食后3 h。综上所述，本试验的饲粮中粗蛋白质含量一致，但是消化能不同，非纤维性碳水化合物含量也不同，这都可能影响瘤胃液pH的高低，具体的影响因素还有待于进一步的探索。
蛋白质在瘤胃内被水解成多肽、二肽或三肽后继续被水解成氨基酸，最终被发酵成氨态氮。氨态氮是微生物生长和蛋白质合成的重要氮源[ 13 ]。瘤胃液氨态氮含量的最适范围较宽(8.50～30.00 mg/dL)，这与瘤胃内微生物种群、能量和碳架的供给有关。张昌吉等[ 5 ]比较了2组饲粮，即对照组(玉米秸和苜蓿为粗饲料，精粗比为50 ∶ 50)和试验组(小麦秸和苜蓿为粗饲料，精粗比为53 ∶ 47)，结果表明，对照组氨态氮含量呈现先升高后降低的趋势，试验组则是先降低后升高，达到峰值后又降低。瘤胃微生物利用氨态氮合成蛋白质需要由碳水化合物提供能量。当瘤胃中蛋白质含量降低或者不足时，瘤胃中产生的氨态氮的含量就会减少，瘤胃微生物合成蛋白质的量就会受到影响，进而影响碳水化合物的消化吸收，因此随着苜蓿干草水平的增加，对照组和试验Ⅰ、Ⅱ组氨态氮含量的整体水平有所升高，试验Ⅲ、Ⅳ组氨态氮的含量逐渐升高，有此可见，试验Ⅲ、Ⅳ组的瘤胃发酵状况较好。
3.2 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液尿素氮含量的影响氮是组成蛋白质的重要元素，反刍动物的含氮营养物质主要包括瘤胃微生物蛋白、过瘤胃蛋白、瘤胃氨基酸、非蛋白氮等。非蛋白氮包括尿素及其衍生物、氨及铵盐、酰胺化合物等，主要的是尿素。非蛋白氮对动物不能提供能量，只要是供给瘤胃微生物合成蛋白质所需的氮源，以节省饲粮蛋白质[ 14 ]。冯宗慈等[ 15 ]在细毛羯羊饲粮中添加尿素，结果表明，尿素氮转化为微生物氮的效率范围是-1.03%~88.80%，转化率既与饲粮中总降解氮和总代谢能的比值有关，又与尿素氮占总降解氮的比例相关。史清河等[ 16 ]在青年羊中就发现尿素氮与蛋白质采食量密切相关。瘤胃液尿素氮含量受到很多因素的影响，比如采食速度、饲粮中尿素氮含量、唾液分泌速度以及氨态氮的含量等。瘤胃中尿素酶活性很高，对尿素的降解能力是微生物利用氨态氮能力的4倍，其含量应该很低，但是王雅倩等[ 17 ]的研究结果指出，瘤胃液尿素氮含量在13.81~17.51 mg/dL变动。本试验中对照组和试验组的尿素氮在采食前后的变化趋势相似，差异也不显著(P>0.05)，只是试验Ⅰ组的尿素氮在采食前后的各个时间整体上相对高于其他组，具体的影响因素和原因还有待于进一步的试验和研究。
3.3 苜蓿干草对杜寒杂交羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响饲料中碳水化合物在瘤胃中经微生物降解产生挥发性脂肪酸，挥发性脂肪酸可以提供机体可消化能为70%~80%[ 18 ]。乙酸、丙酸和丁酸是机体代谢的重要的几种挥发性脂肪酸，约占瘤胃发酵挥发性脂肪酸总量的95%。瘤胃消化吸收所需要的能量很大一部分来源于挥发性脂肪酸的代谢[ 19 ]。挥发性脂肪酸和反刍动物的营养以及瘤胃微生物有着密切的关系[ 20 ]，并且也受很多饲粮因素的影响，主要因素有精粗比、中性洗涤纤维/非中性洗涤纤维。Corley等[ 21 ]指出高精饲料饲粮的养分消化速度较低精饲料饲粮慢，但前者比后者挥发性脂肪酸发酵更快；挥发性脂肪酸的比例也受饲粮影响，高精饲料饲粮挥发性脂肪酸中丙酸比例高，高粗饲料饲粮中乙酸比例高。而郑琛等[ 22 ]研究表明，营养水平对绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸的含量没有产生显著影响，却对各种酸含量产生了显著影响，较高营养水平饲粮的绵羊瘤胃液丙酸和其他酸的含量显著较高而乙酸含量和乙酸/丙酸显著较低。乙酸/丙酸可以反映瘤胃的发酵模式，而且还影响微生物蛋白的合成以及不同区系瘤胃微生物(细菌、原虫等)的群体结构，进而影响整个机体的消化和营养代谢[ 23 ]。丙酸是反刍动物重要的葡萄糖前体，丙酸型发酵能为机体提供更多的能量，因而乙酸/丙酸影响能量的利用率[ 24 ]。苜蓿中含有苜蓿皂苷能影响瘤胃细菌的发酵活力。
本试验中，粗饲料中部分采用苜蓿干草，各组间挥发性脂肪酸含量在采食后1和9 h时存在差异，但在采食前后整体趋势一致。从乙酸/丙酸来讲，粗饲料中苜蓿干草比例为10%时，乙酸/丙酸低于对照组；随苜蓿干草比例的增加，乙酸/丙酸升高，当比例达到40%时，乙酸/丙酸与对照组相近。即随着苜蓿干草比例的增加，乙酸含量升高，瘤胃内由以丙酸为主的发酵转化为以乙酸为主的发酵模式，并且挥发性脂肪酸整体含量先升后降。王雅倩等[ 25 ]报道饲粮添加1％～4％的苜蓿皂苷可改善瘤胃发酵模式，提高反刍动物对发酵终产物的利用率，且添加1％的苜蓿皂苷效果最佳，这可能是苜蓿皂苷含量的增加影响了瘤胃细菌的发酵。在苜蓿干草比例为10%时，挥发性脂肪酸整体水平较高，效果比较好。
3.4 苜蓿干草对杜寒杂交羊十二指肠食糜氨基酸含量的影响小肠内氨基酸的流量及组成是影响反刍动物氨基酸吸收和利用的重要因素,如果小肠内氨基酸供应充足且平衡,不但可提高生产性能,而且能降低饲粮蛋白质水平和排泄物中氮含量,既可缓解蛋白质饲料资源的缺乏,又能保护环境。赵发盛等[ 26 ]研究指出，饲粮组成对奶牛十二指肠食糜中氨基酸的含量的影响因氨基酸的种类而异，影响最大的是蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸,其次是缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸，而精氨酸、异亮氨酸基本不受饲粮组成的影响。林英庭等[ 27 ]指出，绵羊十二指肠食糜中的氨基酸含量较为稳定，精粗比仅对十二指肠食糜中的蛋氨酸、精氨酸、苯丙氨酸含量有一定的影响，而粗饲料的种类对各种氨基酸含量均无显著影响。小肠是反刍动物吸收氨基酸的主要部位，其吸收的氨基酸主要来源于瘤胃微生物蛋白质、过瘤胃蛋白质和内源性蛋白质3部分。研究发现，当饲粮中蛋白质降解率较高或者只是饲喂青贮、干草、非蛋白氮和少量的过瘤胃蛋白时，十二指肠内的微生物蛋白占有很大的比例，所以氨基酸的组成就取决于微生物蛋白的氨基酸组成，当动物补饲过瘤胃蛋白时，进入十二指肠的氨基酸组成模式就会发生变化。吕贞龙等[ 28 ]研究不同植物性蛋白质源饲粮对淮白山羊十二指肠内氨基酸的影响结果表明，不同蛋白质来源的饲粮对十二指肠内氨基酸的组成影响显著。苜蓿的必需氨基酸含量占总氨基酸含量的40.86%~55.75%，高于FAO规定的40%的标准，说明苜蓿中氨基酸的含量丰富[ 29 ]。刘玉英等[ 30 ]在豁鹅饲粮中添加不同比例的苜蓿草粉，结果发现蛋黄中的17种氨基酸的含量随着饲粮的蛋白质水平的增加而呈现增加趋势，但差异不显著。苜蓿虽然是高蛋白质牧草，但是可能与动物的消化代谢方式有关，豁鹅是单胃动物，苜蓿应用于反刍动物，效果可能会明显些。从本试验中可以看出，试验Ⅰ组(粗饲料中苜蓿干草比例为10%)的十二指肠食糜中氨基酸的含量都高于对照组和其他试验组；其中必需氨基酸苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和亮氨酸含量与其他试验组相比差异显著；随着苜蓿干草比例的增加，十二指肠食糜氨基酸含量呈现下降的趋势，但是都高于对照组，可能是由苜蓿干草在瘤胃中降解率高，过瘤胃蛋白含量降低造成的，影响十二指肠食糜氨基酸含量的因素还比较多，还有待于进一步的研究和探讨。
4 结 论① 苜蓿干草可以改善杜寒杂交羊的瘤胃发酵，提高氮利用效率及十二指肠中部分氨基酸含量。
② 本试验条件下，粗饲料中适宜的苜蓿干草比例为10%。
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