饲料投喂方法是决定鱼类养殖成败和效益的关键因素之一，适宜的投喂频率可以促进鱼类的生长，提高存活率和饲料利用率，降低鱼类个体分化，减少残饵和代谢废物排放对养殖环境的污染^{[ 1,2 ]}。有关投喂频率对鱼类生长的影响已有大量报道^{[ 3,4,5,6 ]}，研究报道多为设定不同组别的投喂频率，未固定日投喂率，每次投喂至鱼饱食，最后以生长性能最佳组的投喂频率为最适投喂频率，试验结果是以增加饲料投喂量和鱼类摄食量获得的，对试验鱼的代谢负荷及相关的生理生化指标研究较少。

糖和脂肪是饲料三大能源物质中较易得的组分，在满足鱼类正常生长的前提下，适当提高饲料糖或脂肪水平并相应降低蛋白质水平，是节约饲料蛋白质的重要途径。然而，摄食过量的脂肪^{[ 7,8 ]}或糖^{[ 9,10 ]}会阻滞鱼类正常代谢，影响鱼类生长和鱼肉品质。有关投喂频率对鱼类利用饲料中糖、脂肪能力的影响还少有报道，蔡春芳等^{[ 6 ]}研究发现，当日投喂率固定时，增加投喂频率(由2次/d增至6次/d)可以提高彭泽鲫(Carassius auratus pengzesis)的生长性能，改善彭泽鲫对饲料糖、脂肪的利用效率，且投喂频率为6次/d时试验鱼对饲料糖和脂肪的利用效率没有差异。本研究以异育银鲫(Carassius auratus gibelio)为研究对象，从利用非蛋白质能源物质节约蛋白质的理论角度出发，限定日投喂率，旨在研究增加投喂频率后异育银鲫利用高糖、高脂饲料的效果及其生理生化指标的变化，以探讨增加投喂频率是否能进一步提高异育银鲫利用非蛋白质能源物质的效率，从而为改进异育银鲫饲料配方和投饲策略提供参考。

试验鱼为异育银鲫“中科3号”1龄鱼种，由安徽省农业科学院水产研究所试验基地提供，试验鱼用质量浓度为5%的食盐水消毒后，驯养于2个规格为3.60 m×1.50 m×0.52 m的长方形玻璃钢水槽中，驯养10 d，驯养期间投喂商品饲料。

在蔡春芳等^{[ 11 ]}、王爱民等^{[ 12 ]}、缪凌鸿等^{[ 13 ]}研究的基础上，以豆油为脂肪源，玉米淀粉为糖源，由微晶纤维素调节至100%，设计3组等能饲料，即对照饲料(高蛋白质饲料，蛋白质水平33.5%)、高糖饲料(可消化糖水平40.5%)、高脂肪饲料(脂肪水平10.0%)，试验饲料组成及营养水平见表1。饲料原料均过60目筛，按配比称重，经逐级充分混合后，用小型饲料成型机挤压成型，自然条件下晾干后于-20 ℃冰箱储藏，投喂时将其剪切成粒长1.0～1.5 mm、粒径约1 mm的颗粒。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目Items 饲料 Diets 对照 Control 高糖 High carbohydrate 高脂 High lipid 原料 Ingredients 进口鱼粉 Imported fish meal 48.5 37.0 38.0 玉米淀粉 Corn starch 26.5 41.5 28.0 豆油 Soybean oil 1.5 2.5 7.5 微晶纤维素 Microcellulose 19.0 14.5 22.0 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.5 1.5 1.5 预混料 Premix1) 1.0 1.0 1.0 羧甲基纤维素 CMC 2.0 2.0 2.0 合计 Total 100.0 100.0 100.0 营养水平 Nutrient levels2) 水分 Moisture 6.86 6.95 7.08 粗蛋白质 CP 33.30 26.17 25.85 粗脂肪 EE 5.42 5.58 9.84 粗纤维 CF 17.05 13.30 20.20 粗灰分 Ash 7.55 7.80 7.16 无氮浸出物 NFE 29.82 40.20 29.87 总能GE/(MJ/kg DM) 16.24 16.43 16.28 1)预混料为每千克饲料提供Premix provided the following per kg of diets：Cu 4 mg，Fe 150 mg，Zn 80 mg，Mg 100 mg，Mn 20 mg，I 0.4 mg，Co 0.1 mg，Se 0.1 mg，VA 6 000 IU，VD 2 000 IU，VC 100 mg，VE 50 mg，VK 5 mg，VB1 15 mg，VB2 15 mg，VB3 25 mg，VB5 30 mg，VB6 10 mg，VB7 0.2 mg，VB11 3 mg，VB12 0.03 mg，肌醇 inositol 100 mg。 2)无氮浸出物、总能为计算值，其他为实测值。其中，无氮浸出物=100－(水分＋粗蛋白质＋粗脂肪＋粗纤维＋粗灰分)[ 14 ]；总能按蛋白质、脂肪、可消化糖的能量当量分别为23.64、39.54、17.15 MJ/kg计算。NFE and GE were calculated values,while the others were measured values. Where,NFE=100-(moisture＋CP＋EE＋CF＋ash)[ 14 ]; GE was calculated using energy equivalents 23.64,39.54 and 17.15 MJ/kg for protein,lipid and digestible carbohydrate,respectively.

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

试验共分5组，其中C组为对照组，饲喂对照饲料，每日投喂2次；HC2、HC4组均为高糖组，饲喂高糖饲料，每日分别投喂2、4次；HL2、HL4组均为高脂组，饲喂高脂饲料，每日分别投喂2、4次。每组设3个重复，每个重复放养12尾初始体重为(13.18±0.24) g的健康异育银鲫。
1.4 饲养管理

试验鱼以重复为单位饲养于15个220 L的玻璃钢养殖桶中。投喂频率为2次/d时，投喂时间为08:30、16:00；投喂频率为4次/d时，投喂时间为08:30、11:00、13:30、16:00。日投喂率为3%～4%，按不同投喂频率设定的投喂时间等量投喂试验鱼，每次投喂持续30 min左右，以尽量减少饲料溶失，根据摄食情况每周调整1次投喂量。试验采用静水连续充气养殖，换水前采用虹吸法吸出各桶内残饵及粪便，然后通过独立的进排水管道换水，日换水量约为3/5。试验用水为经曝气调温的地下井水，试验期间水温为(26.0±2.5) ℃，水中溶解氧浓度大于6.8 mg/L，pH 7.5～8.0。正式试验持续7周，期间无鱼死亡。

正式试验结束后，试验鱼饥饿24 h，测定各桶鱼总重和尾数，计算增重率(weight gain rate,WGR)、特定生长率(special growth rate,SGR)、饲料系数(feed conversion ratio,FCR)。从每个重复内随机取6尾鱼，用纱布擦干鱼体表水分，依次测定体长、体重，计算肥满度(condition factor,CF)；解剖后取肝胰脏，测定肝胰脏重，计算肝体指数(hepatosomatic index,HSI)。相关指标计算公式如下：

式中：Wt为终末体重(g)；W₀为初始体重(g)；F为投饲量(g)；W_L为终末肝胰脏湿重(g)；t为试验天数(d)；L为体长(cm)。

从每个重复内随机取3尾鱼，于冰盘上解剖，快速分离出肠道(剔除内含物和脂肪)、肝胰脏，用4 ℃预冷的0.85%生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干水分，-20 ℃冷冻保存，备用。测定时，按1 ∶ 9(质量体积比)加入预冷的0.85%生理盐水，以FLUKE高速组织匀浆机匀浆(10 000 r/min，2 min)，4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

蛋白酶活性采用福林-酚法^{[ 15 ]}测定。蛋白酶活性单位定义为：每克组织在pH 7.2的条件下，与1.0 mg/mL的酪蛋白底物在37 ℃水浴中保温15 min，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活性单位。脂肪酶、淀粉酶活性和粗酶液蛋白质含量均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。脂肪酶活性单位定义为：在37 ℃、最适pH条件下，每克组织蛋白质在其反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个酶活性单位。淀粉酶活性单位定义为：每克组织蛋白质在37 ℃、最适pH条件下，与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个酶活性单位。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定，测定步骤参照说明书。SOD活性定义为：每毫克组织蛋白质在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个酶活性单位。

每个重复随机取3尾鱼作为1个混合样测定全鱼营养成分。其中：粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定；粗灰分含量采用550 ℃马福炉灼烧法测定；水分含量采用105 ℃恒温干燥法测定；粗纤维含量按照GB/T 6434—2006中方法测定。用同样方法测定饲料样品中的营养成分，每种饲料测3个重复，取平均值。

试验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用Excel 2007和SAS 9.1.4统计软件进行分析，差异显著水平为P＜0.05，差异显著时，采用Duncan氏法进行组间差异的多重比较。

由表2可知，HC2、HL2和HC4组的WGR、SGR、FCR与对照组均无显著差异(P＞0.05)，而HL4组的WGR、SGR则较对照组显著下降(P＜0.05)，FCR显著升高(P＜0.05)。各组间CF无显著差异(P＞0.05)。HC4、HL4组的HSI显著高于对照组(P＜0.05)，HC2、HL2组与对照组无显著差异(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 异育银鲫的生长性能 Table 2 Growth performance of Carassius auratus gibelio 项目Items 组别 Groups C HC2 HC4 HL2 HL4 初始体重 IBW/g 13.23±0.33 13.22±0.27 13.08±0.16 13.20±0.28 13.19±0.31 终末体重 FBW/g 30.06±1.05a 27.96±0.97ab 28.64±0.91ab 28.76±0.82ab 27.35±0.67b 增重率 WGR/% 127.31±9.96a 111.53±7.44ab 118.99±9.16ab 117.85±4.94ab 107.45±9.04b 特定生长率 SGR/(%/d) 1.67±0.10a 1.53±0.07ab 1.60±0.09ab 1.59±0.05ab 1.49±0.09b 饲料系数 FCR 1.63±0.11b 1.86±0.11ab 1.77±0.12ab 1.76±0.08ab 1.94±0.12a 肥满度 CF/(g/cm3) 2.78±0.06 2.89±0.10 2.92±0.14 2.86±0.07 2.95±0.14 肝体指数 HSI/% 5.16±0.58b 5.84±0.82ab 6.07±0.79a 5.72±0.52ab 6.11±0.76a 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below.

表2 异育银鲫的生长性能 Table 2 Growth performance of Carassius auratus gibelio

由表3可知，各试验组蛋白酶活性均显著低于对照组(P＜0.05)，同时HC4组显著低于HC2组(P＜0.05)，HL4组则略低于HL2组，但差异不显著(P＞0.05)。各试验组脂肪酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，同时HL4组较HL2组显著下降(P＜0.05)，而HC4与HC2组则无显著差异(P＞0.05)。HC2、HL2组淀粉酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)，但HC4组显著高于HC2组(P＜0.05)，HL4组显著低于HL2组(P＜0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 异育银鲫的肠道消化酶活性 Table 3 The activities of intestinal digestive enzymes of Carassius auratus gibelio 项目Items 组别 Groups C HC2 HC4 HL2 HL4 蛋白酶 Protease/(U/g) 170.79±8.27a 148.62±9.20b 113.86±9.47d 131.19±13.01c 122.04±12.40cd 脂肪酶 Lipase/(U/g prot) 21.95±4.13d 34.08±3.65c 36.33±2.98c 54.93±4.90a 43.55±3.77b 淀粉酶 Amylase/(U/g prot) 327.79±20.87b 346.23±23.10b 412.35±20.40a 337.69±26.91b 231.86±18.27c

表3 异育银鲫的肠道消化酶活性 Table 3 The activities of intestinal digestive enzymes of Carassius auratus gibelio

由表4可知，各试验组GSH含量、SOD活性均显著低于对照组(P＜0.05)。GSH含量在HC4 和HC2组之间、HL4和HL2组之间差异不显著 (P＞0.05)；SOD活性在HC4和HC2组之间差异不显著(P＞0.05)，但HL4组显著低于HL2组(P＜0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 异育银鲫的肝胰脏抗氧化指标 Table 4 Hepatopancreas antioxidant indices of Carassius auratus gibelio 项目Items 组别 Groups C HC2 HC4 HL2 HL4 谷胱甘肽 GSH/(mg/g prot) 4.62±0.73a 3.36±0.48b 2.96±0.40b 1.52±0.22c 1.47±0.27c 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) 206.26±21.01a 166.72±9.08bc 173.04±14.98b 160.81±8.53c 141.94±9.42d

表4 异育银鲫的肝胰脏抗氧化指标 Table 4 Hepatopancreas antioxidant indices of Carassius auratus gibelio

由表5可知，HL2组鱼体水分含量显著低于对照组(P＜0.05)，各试验组间差异不显著(P＞0.05)。各试验组鱼体粗脂肪含量显著高于对照组(P＜0.05)，随着投喂频率增加，HC4和HC2组无显著差异(P＞0.05)，HL4组较HL2组显著下降(P＜0.05)。鱼体粗蛋白质、粗灰分含量各组间无显著差异(P＞0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 异育银鲫的体成分(湿重基础) Table 5 Body composition of Carassius auratus gibelio (wet weight basis) % 项目Items 组别 Groups C HC2 HC4 HL2 HL4 水分 Moisture 75.11±0.80a 74.66±0.57ab 74.62±0.59ab 73.74±0.61b 74.04±0.63ab 粗蛋白质 CP 15.06±0.51 14.68±0.49 14.50±0.66 14.59±0.58 14.76±0.72 粗脂肪 EE 5.71±0.15d 6.34±0.18c 6.57±0.13bc 7.62±0.20a 7.08±0.17b 粗灰分 Ash 3.80±0.10 4.09±0.09 4.18±0.13 3.94±0.06 3.85±0.12

表5 异育银鲫的体成分(湿重基础) Table 5 Body composition of Carassius auratus gibelio (wet weight basis) %

本试验中，HC2、HL2组WGR、SGR、FCR与对照组差异不显著，说明HC2组饲料糖、HL2组饲料脂肪发挥了节约蛋白质的作用。增加投喂频率后，HC4组WGR、SGR较HC2组升高，FCR下降，HL4和HL2组间的变化趋势相反，且HL4组生长性能较对照组显著下降，FCR显著升高，提示在日投喂率一定的前提下，与对照组相比，增加投喂频率降低了异育银鲫对高脂饲料的利用，对高糖饲料的利用无显著影响。这与蔡春芳等^{[ 6 ]}的研究结果存在差异，其原因可能与投喂频率设置、试验鱼种类、饲料组成、养殖环境等不同有关。研究表明，高能量低蛋白质饲料会导致牙鲆(Paralichthys olivaceus)^{[ 16 ]}、许氏平鲉(Sebastes schlegeli)^{[ 7 ]}、红姑鱼(Sciaenops ocellatus)^{[ 17 ]}肝脏脂肪积累，HSI增大。本试验中，各试验组HSI均高于对照组，与上述结果一致；此外，HC4、HL4组HSI显著增大，推测是增加投喂频率后，试验鱼的摄食量增加^{[ 6 ]}，加之饲料能量蛋白质比较高，从而导致肝脏代谢负荷增大所致。

消化酶活性是反映水产动物消化机能的重要指标，饲料成分、投喂频率差异会引起水产动物消化酶活性变化^{[ 18,19 ]}。研究表明，饲料中的蛋白质可以诱导蛋白酶的分泌，在一定范围内，蛋白酶活性与饲料蛋白质水平间具有正相关关系^{[ 20 ]}。本试验中，对照组肠道蛋白酶活性最高，与上述结论一致。当投喂频率由2次/d增至4次/d，HC4、HL4组蛋白酶活性均呈下降趋势，推测是因试验组饲料中蛋白质水平较低，投喂频率增加后，异育银鲫单次摄入的蛋白质量进一步减少，从而导致蛋白酶活性下降，这在对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)^{[ 21 ]}、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)^{[ 22 ]}的相关研究中也有报道。各试验组肠道脂肪酶活性均显著高于对照组，可能是异育银鲫通过调节脂肪酶的分泌，提高了对饲料脂肪的消化和吸收，以减少饲料中蛋白质用于能量消耗所致。HL4组脂肪酶活性较HL2组显著下降，推测是投喂频率增加后，试验鱼摄入的脂肪总量超过了其适宜的需求水平，反而对脂肪酶的分泌产生了抑制作用，致使饲料转化率下降，生长受阻，类似的结果见于席寅峰等^{[ 23 ]}对灰海马(Hippocampus erectus)和王朝明等^{[ 24 ]}对胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)的研究。肠道淀粉酶活性表现为HC4组显著高于HC2组，HL4组显著低于HL2组，提示在本试验条件下，投喂频率增加后，HC4组异育银鲫摄食的淀粉总量虽然增加，但仍在其适宜的耐受范围内^{[ 13 ]}，淀粉酶活性与底物水平间呈正相关，而HL4组由于摄入的脂肪量过高，抑制了淀粉酶的分泌^{[ 25 ]}。

机体对外源物质进行生物转化时往往伴有大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生，若不及时清除，就会对机体造成氧化损伤^{[ 26 ]}。GSH、SOD是细胞对自由基引起氧化损伤的敏感性早期标示物，对氧化损伤具有保护作用，GSH含量、SOD活性的下降，说明机体清除自由基的能力减弱^{[ 27 ]}。现有的研究中有关投喂频率对养殖水产动物非特异性免疫力影响的结果存在差异。孙瑞健等^{[ 28 ]}研究得出，投喂频率(1和2次/d)对大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)肝胰脏和血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活性的影响不显著；而迟淑艳等^{[ 29 ]}以添加晶体蛋氨酸的饲料投喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，结果发现投喂频率为4次/d的组肝胰脏ALT、AST活性显著低于投喂频率为2和6次/d的组。本试验中，HL4组肝胰脏SOD活性较HL2组显著下降，HC4和HC2组肝胰脏GSH含量、SOD活性无显著差异，表明投喂频率对肝胰脏抗氧化能力的影响与饲料组成具有一定的关系。随着投喂频率增加，高脂组试验鱼在代谢过程中ROS释放量增加，造成了明显的氧化应激；高糖组试验鱼肝胰脏抗氧化能力未受投喂频率的显著影响，可能与淀粉水解产物具有一定的还原性和抗氧化性有关^{[ 30 ]}。本试验结果显示，对照组、高糖组、高脂组试验鱼肝胰脏的GSH含量、SOD活性依次呈下降趋势，推测其原因：一方面是试验组饲料中较低的蛋白质水平影响了免疫蛋白的合成^{[ 11 ]}，另一方面是饲料淀粉水平对肝胰脏的非特异性免疫力影响不明显^{[ 31,32 ]}，低于同能值水平的脂肪产生的氧化应激。

研究表明，鱼体体脂含量反映了饲料糖和脂肪的转化积累状况，在饲料总能相同时，饲料中糖、脂肪水平越高，鱼体脂肪沉积越高；鱼体吸收的饲料糖除了参与合成脂肪外，还要参与氧化供能和合成糖原等，饲料脂肪水平的高低对体脂含量的影响大于饲料糖水平的影响^{[ 33 ]}。本试验中，对照组、高糖组、高脂组鱼体粗脂肪含量依次升高，与上述研究结果一致。大量研究表明，在饱食投喂前提下，鱼体粗脂肪含量随着投喂频率的增加而升高^{[ 4, 16, 34 ]}。本试验中，HC4和HC2组鱼体粗脂肪含量无显著差异，而HL4组则较HL2组显著下降，其原因可能与投喂方式及能源物质转化利用形式不同有关。在限定日投喂率时，增加投喂频率(由2次/d增至4次/d)后，试验鱼单次摄入的食物量下降，饱食度降低，鱼体用于竞争摄食和觅食活动的耗能增多，HC4组鱼体由于其贮积的糖原水平较高，摄食能耗增加导致了糖原水平的下降，并未影响脂肪的贮积水平；HL4组鱼体粗脂肪含量下降一方面可能是因摄入的脂肪总量过高致使转化率下降，另一方面可能是部分脂肪直接被用于能量消耗所致。鱼体营养成分分析显示，对照组鱼体水分含量较各试验组升高，这可能是对照组饲料蛋白质水平较高所致，类似的结果见于对春鲤(Cyprinus longipectoralis)^{[ 35 ]}、建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)^{[ 14 ]}的研究。

在日投喂率一定的前提下，投喂频率由2次/d增至4次/d降低了异育银鲫对高脂饲料的利用，对高糖饲料的利用无显著影响。