钼是一种动植物生长所必需的微量元素，主要是通过参与含钼酶(亚硫酸盐氧化酶、醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶等)的合成来发挥其生物学功能。镉元素是一种毒性强且具有累积性的重金属污染物，联合国环境规划署将镉列为最有全球性意义的危险化学物质^{[ 1,2 ]}。镉能导致动物和人类的急慢性中毒，引发骨骼病变、贫血和肝肾功能障碍等症状^{[ 3,4 ]}；进入机体的镉会与金属硫蛋白结合，进而蓄积在肝、肾等组织，可长期滞留于体内^{[ 5 ]}。目前国内外学者对钼、镉中毒进行了大量研究，但2种元素在联合中毒过程中究竟是起协同还是拮抗作用仍未得出结论。据樊璞^{[ 6 ]}报道，钼与镉在中毒过程中有一定的协同作用；然而也有文献表明^{[ 7 ]}，钼可促进肾脏对镉的排泄。本文研究了钼对镉胁迫下山羊血清抗氧化指标及肝脏凋亡相关基因表达的影响，以期为确定钼和镉的作用机制提供参考。

本试验所选的36只波尔山羊均采购自江西省南昌市昌北郊区的某山羊养殖基地，随机分成4 组，每组9只。四水合钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O]和氯化镉(CdCl₂)分别配制成10%溶液，每天灌服。试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组灌服1 mg/kg BW镉，再分别灌服15、30和45 mg/kg BW钼，试验Ⅰ组口服其他3组平均剂量的去离子水。试验期50 d。试验山羊基础饲粮参照NRC(2007)山羊营养需要量配制，其组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(鲜重基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (fresh weight basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 52.5 米糠 Deoiled rice 19.0 豆粕 Soybean meal 10.0 菜籽粕 Rapeseed meal 7.0 棉籽粕 Cottonseed meal 7.0 磷酸氢钙 CaHPO4 1.0 石粉 Limestone 1.5 食盐 NaCl 1.0 预混料 Premix1) 1.0 总和 Total 100.0 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 13.12 粗蛋白质 CP 16.57 钙 Ca 0.90 有效磷 AP 0.78 1)每千克预混料中含有 One kg of premix contained the following：烟酸2 000 mg，VA 1 000 000 IU，VD3 250 000 IU，VE 2 400 mg，Fe (FeSO4·H2O) 2 000 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 140 000 mg，Mn (MnSO4·H2O) 3 000 mg，I (KI,3%) 180 mg；Se (NaSe3O4·H2O) 100 mg。 2)实测值 Measured values。

表1 基础饲粮组成及营养水平(鲜重基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (fresh weight basis) %

血清样品：试验开始当天(第0天)、第10天、第20天、第30天、第40天、第50天早晨饲喂前于山羊颈静脉采血10 mL，分装于1.5 mL离心管，用于分离血清进行相关血清抗氧化指标的检测。

分子生物学样品：试验开始的第0天、第25天、第50天每组剖杀3头山羊，迅速取肝脏组织约10 g，分装于10 mL离心管，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于肝脏凋亡相关基因检测。

严格按照试验盒说明书测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性、丙二醛(MDA)含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

总RNA提取按北京全式金生物技术有限公司的TransZol试剂盒进行。用核酸蛋白仪测定总RNA浓度和纯度。取1~2 uL总RNA，用1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色后用凝胶成像系统照相，观察RNA条带。如果条带清晰，无拖尾现象，且28S与18S条带灰度之比大约为2.0，表明RNA无降解，质量可靠。

从GenBank中检索获得羊B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)和β肌动蛋白(β-actin)基因序列。用Primer Express 3.0软件自行设计，分别在相对保守的区域设计引物和探针，其中探针5'端和3'端分别标记FAM和TEMRA荧光素。引物和探针委托上海英骏生物技术有限公司合成，其序列及参数见表2。

反转录PCR按北京全式金生物技术有限公司的试剂盒操作进行。

采用TaqMan探针法进行RT-qPCR，按宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRa Premix Ex Taq^TM (Probe qPCR)试剂盒操作进行。

使用Excel 2003对试验数据进行初步整理，然后应用SPSS 17.0统计分析软件对整理后的数据进行单因素方差分析(ANOVA)，记录各组间的差异显著性并进行多重比较。结果以平均值±标准差( ±SD)表示。

由表3可见，不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清T-AOC分别于第30和50天、第40和50天、第30~50天显著下降(P<0.05)，其中在第50天时，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别下降了56.50%、53.45%和58.59%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清T-AOC 呈下降趋势，其中试验Ⅱ组和试验Ⅳ组均在第30天开始达差异显著水平(P<0.05)，试验Ⅲ组在第40天开始达差异显著水平(P<0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 引物和探针序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers and probes 基因 Genes GenBank登录号 GenBank accession No. 序列 Sequences (5′—3′) 长度 Length/bp B细胞淋巴瘤-2 相关X蛋白 Bax DQ323116.1 上游：GAGAGGTCTTTTTCCGAGTGG 下游：AAGTAGAAAAGGGCGACAACC 探针：TGAAATGTTTTCCGACGGCAACTTCA 82 B细胞淋巴瘤-2 Bcl-2 DQ152929.1 上游：GGCTGGGATGCCTTTGTG 下游：GAGCAGTGCCTTCAGAGACAGC 探针：CATGCGGCCCCTGTTT 84 β肌动蛋白 β-actin U39357.1.1 上游：TCACGGAGCGTGGCTACAG 下游：CCTTGATGTCACGGACGATTT 探针：TCACCACCACGGCCGA 63

表2 引物和探针序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers and probes

不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清SOD活性分别于第10~50天、第20~50天和第10~50天显著降低(P<0.05)，其中第50天，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清SOD活性分别下降了40.11%、45.27%和46.14%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清SOD活性呈下降趋势，其中试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组分别在第10天、第20天和第20天开始达差异显著水平(P<0.05)，试验Ⅳ组第50天血清SOD活性为各组各时间点的最低值。

不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组血清MDA含量分别于试验第30~50天、第20~50天、第20~50天显著升高(P<0.05)，其中在第50天时，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别提高了273.13%、285.21%和308.21%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清MDA含量呈上升趋势，分别在第10天、第20天和第20天开始达差异显著水平(P<0.05)，试验Ⅳ组第50天血清MDA含量为各时间点各组最高值。

不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清NO含量均在第30~50天显著升高(P<0.05)，其中在第50天时，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别提高了61.89%、83.18%和93.83%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，各组无一致性变化规律，试验Ⅳ组第50天血清NO含量为各时间点各组最高值。

不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清NOS活性均在试验第20~50天显著升高(P<0.05)，其中在第50天时，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别提高了135.36%、159.90%和149.92%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组血清NOS活性呈上升趋势，分别在第20天、第10天和第20天开始达差异显著水平(P<0.05)，试验Ⅲ组第50天血清NOS活性为各组各时间点最高值。

由表4可见，不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组肝脏Bax基因表达量分别于试验第50天、第50天、第25和50天显著上升(P<0.05)，其中试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别提高了52.13%、77.66%和90.43%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组肝脏Bax基因表达量呈上升趋势，分别在第50天、第50天和第25天开始达差异显著水平(P<0.05)，其中第50天试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别提高了52.50%、81.52%和103.41%。

不同组间比较：与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组肝脏Bcl-2基因表达量均于 第25和50天显著下降(P<0.05)，其中试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别降低了41.12%、54.21%和61.68%。不同时间点间比较：随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组肝脏Bcl-2基因表达量呈下降趋势，均在第25天开始达差异显著水平(P<0.05)，其中第50天试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组分别降低了42.73%、56.64%和61.68%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同水平钼对镉胁迫下山羊血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of different levels of Mo on serum anti-oxidative indices of dairy goats challenged by Cd 项目 Items 时间 Time/d 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 试验Ⅳ组 Test group Ⅳ 总抗氧化能力 T-AOC/(U/g prot) 0 6.17±0.69ab 5.92±0.69a 6.95±0.82b 5.51±0.50a 10 6.08±0.61a 5.71±0.50a 5.43±0.65a 5.88±0.43a 20 5.63±0.38a 5.43±0.25a 5.88±0.19a 6.13±0.75a 30 5.92±0.52a 4.56±0.35b 5.92±1.22a 4.69±0.52b 40 5.92±0.35ae 4.81±1.40be 3.58±0.52c 4.01±1.31bc 50 6.23±0.44a 2.71±0.87c 2.90±0.26d 2.58±0.26d 超氧化物歧化酶 SOD/(U/g prot) 0 55.39±1.16a 57.07±0.47a 56.27±1.11a 53.88±1.41ac 10 55.21±3.51a 52.24±2.49b 53.66±0.74ab 52.73±0.96bc 20 57.29±2.06a 50.38±1.15b 48.88±0.61b 47.81±0.93b 30 55.52±1.31a 45.22±1.41cd 43.56±1.69cd 42.43±1.03d 40 54.32±2.25a 40.64±0.94e 38.71±0.47e 37.45±0.94e 50 54.12±1.22a 32.41±1.31f 29.62±1.69f 29.15±1.03f 丙二醛 MDA/(μmol/L) 0 1.36±0.47a 1.36±0.18a 1.40±0.16a 1.14±0.25a 10 1.80±0.25ae 2.29±0.41be 1.59±0.36a 1.80±0.15ab 20 1.24±0.29ae 1.82±0.52be 2.83±0.44b 2.64±0.57b 30 1.10±0.41a 3.84±0.82c 4.19±0.33c 4.36±0.41c 40 0.99±0.25a 4.65±0.66cd 4.88±0.82c 4.59±0.25c 50 1.34±0.25a 5.00±1.32d 5.17±0.41c 5.47±0.16c 一氧化氮 NO/(μmol/L) 0 55.68±6.43a 54.55±3.21a 57.95±1.96a 57.95±6.43a 10 59.66±2.41ad 66.48±2.41bd 53.41±4.82a 59.85±1.74a 20 54.17±2.86a 52.84±0.80a 72.16±0.80bd 68.18±3.21ad 30 53.98±4.02a 79.55±8.04ce 79.55±1.61be 81.25±8.84be 40 53.98±7.23a 82.39±5.62c 87.50±4.82c 82.39±4.02bc 50 55.11±2.41a 89.20±7.23f 100.95±3.21g 106.82±6.43g 一氧化氮合酶 NOS/(U/g prot) 0 12.18±1.95a 11.28±1.64a 10.90±0.51a 12.79±1.70a 10 11.80±1.42ab 13.69±0.64ab 13.78±0.29b 14.11±0.36ab 20 12.13±1.58a 15.86±0.37bc 16.61±0.22c 17.74±0.87c 30 10.41±1.50a 19.82±4.40d 20.53±0.60d 22.72±1.70d 40 10.76±1.60a 22.44±1.50d 26.83±2.70e 26.26±1.30e 50 11.82±0.50a 27.82±0.50f 30.72±1.60f 28.95±0.70f 同一指标、同行或同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row or column,values of the same index with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 不同水平钼对镉胁迫下山羊血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of different levels of Mo on serum anti-oxidative indices of dairy goats challenged by Cd

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同水平钼对镉胁迫下山羊肝脏凋亡相关基因表达的影响 Table 4 Effects of different levels of Mo on hepatic apoptosis gene expressions of dairy goats challenged by Cd 项目 Items 时间 Time/d 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 试验Ⅳ组 Test group Ⅳ B细胞淋巴瘤-2 相关X蛋白 Bax 0 0.90±0.04a 0.88±0.06a 0.92±0.07a 0.88±0.06a 25 0.84±0.11a 1.06±0.09a 1.16±0.16a 1.30±0.27b 50 0.94±0.03a 1.43±0.13b 1.67±0.36b 1.79±0.36c B细胞淋巴瘤-2 Bcl-2 0 1.00±0.10a 1.10±0.20a 1.13±0.08a 1.07±0.09a 25 1.12±0.09a 0.71±0.03b 0.76±0.18b 0.68±0.10b 50 1.07±0.18a 0.63±0.09bd 0.49±0.10cd 0.41±0.08cd

表4 不同水平钼对镉胁迫下山羊肝脏凋亡相关基因表达的影响 Table 4 Effects of different levels of Mo on hepatic apoptosis gene expressions of dairy goats challenged by Cd

机体的T-AOC包括酶促抗氧化和非酶促抗氧化2大体系，其中酶促抗氧化体系主要依赖于机体的各种抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等)来发挥作用；非酶促抗氧化体系则主要依赖金属蛋白质、维生素等^{[ 8,9 ]}。本试验中，在不同钼水平的试验组中，随着试验时间的增加，山羊血清中T-AOC均随之降低，且随着试验钼水平的增加，T-AOC也下降较明显，其中在第50天试验Ⅳ组血清T-AOC为各时间点各组最低值。机体在摄入高水平钼和镉后，由于细胞损伤导致大量的自由基及过氧化物生成，进而使机体内T-AOC的酶促抗氧化体系大量消耗，抗氧化能力下降；且在高水平钼、镉胁迫下，机体各种金属蛋白质、维生素及矿物质的代谢受到影响，进而导致非酶促抗氧化体系的紊乱，使T-AOC下降。结果提示，血清T-AOC的下降也与钼、镉水平有明显的相关性，且钼水平的升高对血清T-AOC的下降有促进作用。

SOD是机体内重要的超氧阴离子(·O^-₂)自由基清除剂^{[ 10 ]}。而动物体内的SOD包括铜，锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)^{[ 11 ]}。钼与锌、铜均存在一定的拮抗作用^{[ 12 ]}，故在高钼的环境下，锌铜吸收受阻，导致Cu,Zn-SOD合成量也减少或丧失活性^{[ 13 ]}；进入机体的镉首先贮存于肝脏，然后与肝脏的金属硫蛋白结合成镉金属硫蛋白(cadmium-metallothionein，Cd-MT)复合物，向肾脏转移，通过这种方式将具有很强毒性的镉束缚成相对稳定的形式，Cd-MT是镉在体内蓄积的主要形式。而已有研究证明，金属硫蛋白和三硫酸钠能减轻大鼠钼毒性。还有报道称，在血液和组织中，镉能刺激金属硫蛋白的形成^{[ 14 ]}。本试验结果表明，随着试验天数的增加，不同钼水平的试验组山羊血清SOD活性均随之降低，且随着钼水平的增加，SOD活性也下降明显。在试验第50天时试验Ⅳ组血清SOD活性降低最显著；进一步研究发现在试验的中前期，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清中SOD活性较试验Ⅰ组下降，但差异并不显著，这说明在1 mg/kg BW镉胁迫下，血清SOD活性并未发生显著变化，大量镉进入机体后与金属硫蛋白结合在一起，自由基的产量并不多，而由镉诱导的金属硫蛋白的增加也消除了钼元素对机体的影响。然而随着试验天数的增加，体内钼、镉元素的不断累积，机体代偿能力减弱及金属硫蛋白中镉元素的释放，诱导了自由基的产生，并对肝细胞的不饱和脂肪酸进行攻击^{[ 15 ]}，产生一系列连锁反应，镉与钼对SOD活性的影响也逐渐被体现出来，最终导致如在试验后期与试验Ⅰ组相比的显著降低。

MDA是自由基攻击不饱和脂肪酸使脂质过氧化物发生氧化反应所形成的终产物，也是质膜受自由基攻击的终产物，它可以间接反映细胞受伤害的程度^{[ 16,17 ]}。研究表明，随着试验天数的增加，不同钼水平的试验组山羊血清中MDA含量均随之升高；随着钼水平的升高，MDA含量升高也更为明显，试验第50天试验Ⅳ组血清MDA含量最高，由此可以判断钼、镉会对机体的质膜造成一定损伤，且随着钼水平的增加，其损伤程度越发明显；机体抗氧化能力在钼、镉的作用下不断下降，使MDA含量在试验过程中随钼水平升高而增加，由此可以推断，钼水平的升高对血清MDA含量的升高有促进作用。

NO是机体内的一种气体自由基，其在生物体内的主要生物学功能具有两面性：其一，NO在机体正常代谢时，具有一系列重要的生理作用。其二，机体NO代谢失衡时，NO含量升高将通过与机体内核酸、蛋白质及脂肪等生物大分子相互作用及其他途径与方式对组织细胞造成损伤以及影响信息的传递，对机体产生多种病理损害。本试验结果显示，随着试验天数的增加，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅳ组血清中NO含量均随之升高，其中试验第50天试验Ⅳ组血清NO含量升高至所有组最高值，表明钼水平与血清中NO含量存在一定的相关性；本试验对血清T-AOC和MDA含量的检测表明，机体氧化还原系统失衡，低氧化性NO转变为具有较强氧化性和细胞毒性的羟自由基(·OH)和二氧化氮(NO₂)的风险逐渐增加，对机体及细胞造成很大的伤害^{[ 18,19 ]}；与此同时，NO作为机体重要的第2信使，参与细胞多种信息传递，其含量异常预示着细胞信号传导紊乱。NO是由NOS催化生成，NOS的活性很大程度决定NO的含量，而本试验结果NO含量与NOS活性变化呈一致性，这表明钼和镉可诱导机体NOS活性的升高，从而导致NO代谢紊乱，造成机体一系列的损伤。结果提示，钼、镉胁迫对山羊NOS活性和NO含量的影响中呈协同作用。

Bcl-2(又称白血病-2)基因是最早进行研究的一类与凋亡有关的原癌基因，对细胞凋亡具有抑制作用，并参与多种肿瘤的形成^{[ 20,21 ]}。Bax也属于Bcl-2家族的一员，其生理作用与Bcl-2相反，本身具有促进细胞凋亡的作用，研究发现Bax与Bcl-2家族成员形成异源二聚体而发挥特定的生理作用^{[ 21a>,22 ]}。大量的研究发现，当Bax与Bcl-2结合形成异源二聚体时会对Bcl-2起到一定的抑制；而当Bax自身结合形成同源二聚体，则使其促凋亡作用得以加强^{[ 21,23 ]}。本试验结果表明，随着试验天数的增加，不同钼水平的试验组山羊肝脏Bcl-2基因表达量下降，而Bax基因表达量上升，且随着钼水平的升高，Bcl-2和Bax表达量变化幅度增大，在第50天试验Ⅳ组Bcl-2基因表达量低于其他各组，而Bax基因表达量高于其他各组。据张明等^{[ 23 ]}报道，镉能诱导小鼠生精细胞Bax蛋白合成量增高使小鼠生精细胞的凋亡率升高；杨帆等^{[ 24 ]}在研究高水平钼对艾维茵肉鸡法氏囊细胞凋亡的影响时发现，高钼能诱导鸡胸腺细胞的凋亡，并认为这是由于高水平钼使Bcl-2基因的表达受阻所致。本试验结果表明，镉胁迫下，灌服不同水平钼的山羊肝脏Bcl-2基因表达量下降、Bax基因表达量升高，且这一现象对钼、镉灌服水平有明显的依赖性，随着钼水平的升高，Bax/Bcl-2增大；最终导致Bcl-2和Bax所形成的异源二聚体数量下降，而Bax的同源二聚体数量增加，诱导肝脏细胞的凋亡。

钼、镉可导致山羊血清抗氧化能力的下降同时诱导肝脏凋亡相关基因的表达，钼与镉呈协同关系。