2. 国家饲料工程技术研究中心, 北京 100193;
3. 北京中农颖泰生物技术有限公司, 北京 100193
2. National Feed Engineering Technology Research Center, Beijing 100193, China;
3. Beijing Sinagri YinThai Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100193, China
近年来,伴随着水产养殖业的迅猛发展,由细菌、病毒引起的水产动物病害也呈现上升趋势,造成了严重的经济损失,因而水产动物的病害防治已经成为制约养殖业发展的主要问题[1]。我们一贯的做法就是使用抗生素,虽然使用抗生素可以部分地解决这一问题,但抗生素药物的滥用、细菌耐药性和药物残留等问题日渐严重,进而对人类的健康构成了潜在性的威胁,越来越多的国家开始呼吁禁用抗生素[2]。抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理,作为一种理想的抗生素替代品,已引起人们极大的研究兴趣,成为分子生物学和生物化学研究领域的热点之一[3]。抗菌肽是在诱导条件下由机体细胞产生能够抵抗病原微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽,是生物天然免疫防御系统的重要组成部分[4]。至今,已发现的抗菌肽种类已达上千种,但作为饲料添加剂应用的研究报道较少。天蚕素是抗菌肽众多族类中重要的一种,早在20世纪70年代就由瑞典科学家Boman从惜古比天蚕(Hyatop hora cecropia)中分离得到,并将其命名为Cecropin,是目前应用效果最显著的抗菌肽[5]。天蚕素抗菌肽有广谱的抗菌能力和抗病毒活性。此外,天蚕素还具有无残留毒性及病原体难以产生抗药性等优点而成为一类极具潜力的新型抗菌药,具有广阔的应用前景[6]。研究表明,在肉鸡[7]、肉鸭[8]、断奶仔猪[9]等饲粮中添加天蚕素抗菌肽对家畜家禽有促生长的作用。鱼类生存环境和生理结构与陆生动物存在较大差异,抗菌肽对水生动物是否具有相似作用效果不得而知,此方面的研究到目前为止非常有限,而且现有的结果也存在很大差异。姜珊等[10]研究发现,在饲料中添加适量的重组抗菌肽能显著提高罗非鱼幼鱼生长性能和部分免疫指标以及攻毒后存活率;但高剂量抗菌肽在一定程度上对罗非鱼幼鱼的生长性能和部分酶指标有抑制作用。黄沧海等[11]用枯草芽孢杆菌中表达的基因工程产物饲喂罗非鱼发现其对生长性能并无显著影响,但能提高罗非鱼的肥满度。虽然目前有不少研究提及抗菌肽作为饲料添加剂对动物的作用,但有关抗菌肽在湘云鲫中的应用却鲜有研究。湘云鲫是湖南师范大学以刘筠院士为首的科研协作组于20世纪90年代培育的三倍体鱼新品种,是目前国内生长速度快、个体最大的优质鲫鱼。本试验以湘云鲫为研究对象,探讨饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫生长、免疫与抗病力的影响,旨在为天蚕素抗菌肽在实际生产中合理利用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验饲料湘云鲫基础饲料组成及主要营养水平见表1。饲料原料经粉碎过40目筛,混合均匀后,加工成2 mm颗粒备用。试验分为6个组,第1组为基础饲料中添加了4 mg/kg金霉素的正对照组;第2组为饲喂基础饲料的空白对照组(不添加天蚕素抗菌肽);第3~6组为分别饲喂在基础饲料中添加了100、150、200和250 mg/kg天蚕素抗菌肽饲料的试验组。基础饲料按照我国《鲫鱼饲养标准》(2004)推荐的营养水平配制。本试验用天蚕素抗菌肽是由北京中农颖泰生物技术有限公司提供,是经过人工设计合成并在枯草芽孢杆菌中成功表达的基因工程产物,具有独特的抗菌性能及一定的营养作用。
![]() | 表1 湘云鲫基础饲料组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for triploid crucian carp (as fed-basis) % |
试验在江西农业大学动物科技学院水产基地进行。湘云鲫鱼苗购自江西省南昌市麻丘镇。鱼苗运回后用2%食盐水消毒,暂养3周。试验开始前禁食24 h,选用规格整齐、体格健壮、体重相近的鱼体1 242尾,随机分到18个养殖箱(120 cm×80 cm×80 cm)。试验共分6个处理,每个处理3个重复。每天08:00、18:00左右各投喂饲料1次,每次投食均做到细撒、慢投,投喂时间不少于30 min。日投饵量一般根据试验鱼总重量与投饲率的乘积所决定,也受天气变化、试验鱼食欲强弱的影响,酌情增减日投饵量,以免造成浪费。日投喂率约为体重的2%,视摄食情况进行调整,每天换水1/5~1/3,保证每天水质清新。日夜连续充气增氧、控温。以保持溶氧在4 mg/L以上,水体循环过滤,水温控制在25 ℃左右。饲养周期为56 d。
1.3 样品采集和指标测定 1.3.1 生长指标测定在试验开始时,对湘云鲫进行称重,并记录鱼的尾数。试验结束时,禁食24 h,对鱼体进行称重,计算增重率、特定生长率、饲料系数。
特定生长率(SGR,%/d)=100×(ln末均重-ln初均重)/饲养天数;
增重率(WGR,%)=100×[末均重(g)-初均重(g)]/初均重(g);
饲料系数(FCR)=摄食量(g)/[末均重(g)-初均重(g)];
成活率(SR,%)=100×终末尾数/初始尾数。
1.3.2 形体指数试验结束后饥饿24 h,从每个重复中随机选取6尾,详细记录鱼的体重、体长、内脏重、肾脏重、脾重、肝胰脏重,计算各器官占体重的百分比,以指数计。
肥满度(condition factor,CF,%)=100×体重(g)/[体长(cm)]3;
内脏指数(visceral index,VI,%)=(内脏重/体重)×100;
肾脏指数(renal index,RI,%)=(肾脏重/体重)×100;
肝胰脏指数(hepatopancreas index,HI,%)=(肝胰脏重/体重)×100;
脾脏指数(spleen index,SI,%)=(脾脏重/体重)×100。
1.3.3 肌肉成分
试验结束后饥饿24 h,每重复选取3尾鱼用于鱼体肌肉成分分析。水分含量采用105 ℃烘箱干燥恒重法测定;粗灰分含量采用550 ℃灰化法测定;粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(总氮×6.25)测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法(以乙醚为抽提液)测定。
1.3.4 血清非特异性免疫指标分别从每个重复随机取湘云鲫10尾,纱布擦干尾部,以无菌的2 mL一次性注射器自尾静脉取血,置于Eppenddorf离心管中,室温4 ℃下放置过夜,于3 000 r/min 4 ℃离心15 min以制备血清,置于1.5 mL离心管中,于-20 ℃保存备用。超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛含量(MDA)和溶菌酶(LZM)活性采用酶联免疫吸附法测定。
1.3.5 攻毒试验嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)普遍存在于淡水、污水、淤泥及土壤中,是危害鱼类、两栖、爬行类和哺乳类动物的致病菌。试验用嗜水气单胞菌的菌种用营养肉汤琼脂培养基在37 ℃培养箱中培养 24 h,复壮2次,用灭菌生理盐水清洗,集菌,4 000 r/min离心15 min,收集沉淀细菌体,进行梯度稀释,使终浓度为5×108 CFU/mL,置4 ℃冰箱中保存备用。试验结束后,分别从各组取试验鱼10尾,每组3个重复,进行人工感染试验。每尾鱼经胸鳍基部注射0.5 mL嗜水气单胞菌活菌液进行攻毒,然后分别放养于室内养殖箱(60 cm×40 cm×40 cm),保证充足的氧气。连续2周观察试验鱼的死亡情况,随时记录试验鱼的死亡数目和发病症状,计算死亡率(MR)和免疫保护力(RPS)。
死亡率(%)=100×死亡数/初始鱼总数;
免疫保护力(%)=100×(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率。
1.4 数据处理试验结果采用“平均值±标准误”表示,基本数据处理采用Excel 2003,试验结果统计分析采用SPSS 17.0统计软件,先对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA),若处理间差异显著,再用Duncan氏法多重比较,显著水平为P<0.05。
2 结 果 2.1 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫生长性能的 影响各组湘云鲫的始末体重、增重率、特定生长率、饲料系数及成活率见表2。饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫饲料系数未产生显著影响(P>0.05)。饲料中添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽组末均重、增重率和特定生长率均显著高于空白对照组(P<0.05),分别提高了15.0%、37.4%和27.5%。天蚕素抗菌肽其他添加水平组及金霉素添加组与空白对照组相比,末均重、增重率和特定 生长率差异均不显著(P>0.05)。
![]() | 表2 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫生长性能的影响 Table 2 Effects of cecropin supplementation on growth performance of triploid crucian carp |
表3所示为饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫肥满度、肾脏指数、肝胰脏指数、内脏指数和脾脏指数的影响。经过8周的饲养试验发现,添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽组肥满度显著高于空白对照组(P<0.05),与金霉素添加组和200 mg/kg天蚕素抗菌肽组差异不显著(P>0.05),但是显著高于250 mg/kg天蚕素抗菌肽组(P<0.05)。饲料中添加天蚕素抗菌肽对肾脏指数、肝胰脏指数、内脏指数和脾脏指数没有显著影响(P>0.05),但150 mg/kg天蚕素抗菌肽组内脏指数、脾脏指数和肾脏指数相比空白对照组都有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。
![]() | 表3 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫形体指数的影响 Table 3 Effects of cecropin supplementation on body index of triploid crucian carp % |
由表4可知,相比空白对照组,饲料中添加200和250 mg/kg天蚕素抗菌肽能显著提高湘云鲫的血清SOD活性(P<0.05),饲料中添加150和200 mg/kg天蚕素抗菌肽显著降低了血清MDA的活性(P<0.05)。与空白对照组相比,添加各水平天蚕素抗菌肽均显著提高了血清LZM活性(P<0.05),各添加组之间差异不显著(P>0.05)。
![]() | 表4 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和溶菌酶活性的影响 Table 4 Effects of cecropin supplementation on SOD activity, MDA content and LZM activity in serum of triploid crucian carp |
饲养56 d后,湘云鲫肌肉成分见表5。由表可知,各组湘云鲫的肌肉水分含量之间差异不显著(P>0.05);各组肌肉粗蛋白质占干物质含量较高,达76.69%~79.72%。相比空白对照组和正对照组,各试验组肌肉粗蛋白质含量有不同程度的提高,但各组间差异未达到显著水平(P>0.05);饲料中添加250 mg/kg天蚕素抗菌肽组的湘云鲫鱼肌肉粗脂肪含量显著低于空白对照组(P<0.05),而肌肉粗灰分含量则显著高于150 mg/kg天蚕素抗菌肽组(P<0.05)。
![]() | 表5 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫肌肉成分的影响 Table 5 Effects of cecropin supplementation on muscle composition of triploid crucian carp |
经嗜水气单胞菌急性感染后,死亡湘云鲫表现为鳍基部、口部出血,腹部肿大,肛门红肿等症状。由表6可知,攻毒48 h内死亡率极低,排除因 攻毒时机械损伤造成的死亡个体,攻毒48~72 h是死亡的高峰期,其中对照组成活率最低。天蚕素抗菌肽组成活率明显高于对照组,成活率在攻毒120 h后基本稳定下来。
![]() | 表6 饲料中添加天蚕素抗菌肽对攻毒后湘云鲫存活率和免疫保护率的影响 Table 6 Effects of cecropin supplementation on survival rate and immune protection rate of triploid crucian carp |
抗菌肽作为一种新型饲料添加剂已在畜牧业中得到应用,研究表明,抗菌肽可使肉鸡饲料转化率提高3.64%,成活率提高10%[7]。陈冰等[12]在凡纳滨对虾的研究中发现,在一定添加水平范围内,家蝇抗菌肽能显著提高凡纳滨对虾存活率、增重率、特定生长率等。王四新等[13]研究发现,饲料中添凡纳滨对虾加100~150 mg/kg的抗菌肽能显著提高草鱼的生长速度和相对增重率,而添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽对草鱼成活率和肥满度提高效果不明显。黄沧海等[11]研究表明,抗菌肽和黄霉素均能显著提高罗非鱼幼鱼生长性能和抑菌作用。本试验结果显示,饲料中添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽对湘云鲫的促生长效果最佳。且添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽对湘云鲫肥满度也有显著提高,但是对肾脏指数、肝胰指数、内脏指数和脾脏指数没有显著影响。当添加量增加至250 mg/kg时,肥满度显著降低。这与在罗非鱼[10]、鲤鱼[14]上得出的适宜添加量有较大差异,但与在锦鲤[15]上得出的适宜添加量是一致的,说明动物品种以及抗菌肽的种类也会影响抗菌肽的适宜添加量,关于抗菌肽对湘云鲫的促生长作用机理还有待进一步探讨。
3.2 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫肌肉成分的 影响鱼的肌肉成分组成受多种因素影响,包括品种、环境、饲料、年龄及鱼体尺寸等,其中生长环境和所饲喂的饲料是外部影响因素。饲料蛋白质水平显著影响鱼肉中所含的蛋白质和脂肪含量,饲喂高蛋白质水平饲料的鱼往往肌肉中脂肪含量较低,过多的脂肪沉积将使得鱼肉产生“油腻感”,降低了鱼肉的可接受度[16]。对蛙鱼肉质的研究结果表明,过多的脂肪沉积在肌隔中会破坏肌肉的结构,降低鱼肉的结实度,使得鱼肉肉质松软,口感不好[17]。本研究发现,饲料中添加250 mg/kg天蚕素抗菌肽可显著降低湘云鲫鱼肌肉粗脂肪含量,提示鱼肉口感得到改善。与添加250 mg/kg天蚕素抗菌肽相比,添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽显著增加了湘云鲫鱼肌肉粗灰分含量,有可能增加了矿物质元素的含量,有待进一步的检测。
3.2 饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫非特异性免疫功能的影响鱼类属于较低等的变温脊椎动物,其非特异性免疫防御系统在抵抗病原生物入侵中起到非常重要的作用[18]。SOD是酶促抗氧化系统的重要成员。且SOD与生物的免疫水平密切相关,对于增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能具有重要作用[19]。本研究表明,饲料中添加200和250 mg/kg天蚕素抗菌肽能显著提高湘云鲫的血清SOD活性。该结论与王一娟等[20]、陈冰等[12]和姜珊等[10]的研究结果相似。王一娟等[20]认为,在河蟹基础饲料中添加0.4%的抗菌肽后,河蟹肝脏、肌肉和性腺中总抗氧化能力均显著升高,提高了机体的抗氧化能力。而姜珊等[10]试验结果表明,饲料中添加5与10 mg/kg抗菌肽时,血清过氧化氢酶(CAT)活性显著提高,SOD活性显著提高了28.1%,但是当添加量为50 mg/kg时,对血清SOD与LZM的活性有显著的负面影响。MDA是脂质过氧化物的主要分解产物,具有很强的生物毒性,能引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,导致细胞死亡,MDA含量升高与氧自由基产生过多密切相关。本试验结果表明,饲料中添加150和200 mg/kg天蚕素抗菌肽显著降低了湘云鲫血清MDA的含量。LZM是非特异性免疫系统的主要成分,在鱼类免疫中起重要的作用,是吞噬细胞杀菌的物质基础,可清除其他抗菌因子作用后所残余的细菌细胞壁并增强其他免疫因子的抗菌敏感性,协同其他免疫因子共同抵制外来病原的入侵[21]。目前,许多研究水生动物的非特异性免疫功能时常用血清LZM活性表示,LZM活性提高,其免疫能力也相应提高[22]。本研究试验结果表明,饲料中添加天蚕素抗菌肽显著提高了湘云鲫血清中LZM的活性。已有的研究也证实了这一点,王一娟等[20]在基础饲料中添加0.4%抗菌肽饲喂河蟹60 d后,血清LZM活性有增加的趋势。在饲料中添加抗菌肽同样能增强罗非鱼[10]、凡纳滨对虾[12]、鲤鱼[14]和锦鲤[15]血清LZM活性,这些研究表明抗菌肽能提高水产动物机体的非特异性免疫力。由此可推测,饲料中添加抗菌肽能改善湘云鲫的生长性能可能与增强鱼非特异性免疫力有关。
3.3 饲料中添加天蚕素抗菌肽对攻毒试验的影响攻毒后的成活率是机体免疫功能的综合反映,在研究营养物质对水生动物免疫作用时常用攻毒成活率和死亡率进行表示[23]。鱼类试验中,常用感染致病菌后的死亡率高低反映鱼类的抗病力及免疫力,评价鱼体免疫机制[24]。大量研究表明,抗菌肽能有效提高动物对病原菌的抵抗力[8,15,25]。本试验对饲喂天蚕素抗菌肽后的湘云鲫采用嗜水气单胞菌进行攻毒,攻毒48 h内死亡率极低,攻毒48~72 h是死亡的高峰期,天蚕素抗菌肽组的成活率明显高于对照组,其中对照组成活率最低。这表明在饲料中添加天蚕素抗菌肽提高了湘云鲫的抗病力,因而降低了湘云鲫感染疾病的风险。研究表明,抗菌肽的摄入能提高湘云鲫注射嗜水气单胞菌后的存活率,可能是进入体内的抗菌肽发挥了直接杀菌的作用,也可能是由于抗菌肽提高了机体血液中的抗氧化能力和免疫功能,从而增强了机体的整体抗病能力,最终提高了机体的存活率[15]。已有研究指出,抗菌肽在体内除了能直接杀死病原菌,更多的时候是作为免疫效应因子来启动宿主的免疫防御体系,从而促进免疫功能来消除感染,保护宿主免受病原微生物的侵害[26, 27]。饲料中添加天蚕素抗菌肽能够显著增强湘云鲫的抗病力,这可能与抗菌肽提高血清LZM和抗氧化酶活性,继而增强湘云鲫的非特异性免疫力有关。有关抗菌肽对鱼类的抗病作用机制有待进一步研究。
4 结 论本试验条件下,在湘云鲫饲料中添加天蚕素抗菌肽比未添加天蚕素抗菌肽的空白对照组有促生长效果,且150和200 mg/kg添加组效果较佳,并且提高了鱼体的非特异性免疫力和抗病力。
[1] | 黄玉玲.我国海水养殖鱼类病害研究概况[J]. 福建水产,2002(4):50-54. (![]() |
[2] | 黎观红,洪智敏,贾永杰,等.抗菌肽的抗菌作用及其机制[J]. 动物营养学报,2011,23(4):546-555. (![]() |
[3] | 岳昌武,莫宁萍,刘坤祥,等.抗菌肽的结构特点、作用机理及其应用前景[J]. 安徽农业科学,2008,36(5):1736-1739. (![]() |
[4] | 李冠楠,夏雪娟,隆耀航,等.抗菌肽的研究进展及其应用[J]. 动物营养学报,2014,26(1):17-25. (![]() |
[5] | BOMAN H G,NILSSON I,RASMUSON B.Inducible antibacterial defence system in Drosophila[J]. Nature,1972,237(5352):232-235. (![]() |
[6] | 李希,关静姝,李波,等.天蚕素抗菌肽CAD研究进展及其在畜牧生产中的应用[J]. 饲料与畜牧,2012(2):56-59. (![]() |
[7] | 黄永彤,黄自然,黄建清,等.抗菌肽与抗生素饲喂肉鸡的效果比较[J]. 广东饲料,2004,13(2):24-25. (![]() |
[8] | 陈晓生,温刘发,张辉华,等.饲粮中添加抗菌肽对肉鸭生产性能及免疫器官、内脏器官的影响[J]. 畜禽业,2005(2):12-13. (![]() |
[9] | 陈香,谯仕彦,李波,等.添加天蚕素抗菌肽对断奶仔猪生长性能的影响[J]. 中国饲料,2011(12):25-30. (![]() |
[10] | 姜珊,王宝杰,刘梅,等.饲料中添加重组抗菌肽对吉富罗非鱼生长性能及免疫力的影响[J]. 中国水产科学,2011,18(6):1308-1314. (![]() |
[11] | 黄沧海,李波,王冬冬,等.抗菌肽对罗非鱼幼鱼生长性能的影响[J]. 中国畜牧杂志,2009,45(23):53-56. (![]() |
[12] | 陈冰,曹俊明,陈平洁,等.家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾生长性能及免疫相关指标的影响[J]. 中国水产科学,2010,17(2):258-266. (![]() |
[13] | 王四新,季海峰,刘辉,等.抗菌肽对草鱼生长性能的影响[J]. 饲料研究,2011(4):29-31. (![]() |
[14] | ZHOU X X,WANG Y B,LI W F.Effect of feeding apidaecin on common carp (Cyprinus carpio) growth performances and immune function[J]. Aquaculture,2008,279(1/2/3/4):108-112. (![]() |
[15] | 林鑫,毛述宏,杨阳,等.饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长、非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 动物营养学报,2013,25(8):1860-1865. (![]() |
[16] | 王吉桥,程爱香,闫有利,等.饲料中蛋白质含量对花(鱼骨)生长和消化的影响[J]. 大连水产学院学报,2008,23(2):116-122. (![]() |
[17] | TERPSTRA A H,BEYNEN A C,EVERTS H,et al.The decrease in body fat in mice fed conjugated linoleic acid is due to increases in energy expenditure and energy loss in the excreta[J]. The Journal of Nutrition,2002,132(5):940-945. (![]() |
[18] | RENGPIPAT S,PHIANPHAK W,PIYATIRATITIVORAKUL S,et al.Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth[J]. Aquaculture,1998,167(3/4):301-313. (![]() |
[19] | 刘存歧,王伟伟,张亚娟.水生生物超氧化物歧化酶的酶学研究进展[J]. 水产科学,2005,24(11):49-52. (![]() |
[20] | 王一娟,何义进,谢骏,等.抗菌肽对河蟹生长、免疫及抗氧化能力的影响[J]. 江苏农业科学,2011,39(2):340-343. (![]() |
[21] | 林亲录,马美湖,金阳海,等.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J]. 食品科学,2002,23(2):43-46. (![]() |
[22] | 杨奇慧.不同水平维生素A对幼建鲤免疫功能的影响 .硕士学位论文.雅安:四川农业大学,2003:1-10. (![]() |
[23] | 陈昌福.鲤对不同免疫原的免疫应答的比较研究[J]. 华中农业大学学报,1998,17(5):493-498. (![]() |
[24] | 闫琳,梅景良,黄一帆.加味玉屏风散对试验性免疫抑制黄鳝非特异性免疫功能的影响[J]. 中国农学通报,2010,26(8):345-350. (![]() |
[25] | WU S D,ZHANG F R,HUANG Z M,et al.Effects of the antimicrobial peptide cecropin AD on performance and intestinal health in weaned piglets challenged with Escherichia coli[J]. Peptides,2012,35(2):225-230. (![]() |
[26] | 宋理平,胡斌,王爱英,等.抗菌肽对凡纳滨对虾生长和机体免疫的影响[J]. 广东海洋大学学报,2010,30(3):28-32. (![]() |
[27] | 周洪波,皮灿辉,彭永鹤,等.抗菌肽在调节动物免疫力方面的研究进展[J]. 中国畜牧兽医,2009,36(7):44-47,48. (![]() |