豆粕是主要的植物蛋白质原料，在配合饲料中占有较高的比例。但近年的研究发现，在部分鱼类饲料中，较高含量的豆粕会引起鱼体肝胰脏的损伤，并引发鱼体一些功能性障碍^[1]。现有的研究表明，饲料中过量的豆粕会导致军曹鱼(Rachycentron canadum)^[2]、褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)^[3]、吉富罗非鱼(genetic improvement of farmed tilapia，GIFT)^[4]、齐口裂腹鱼(Schizorhorax prenanti)^[5]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)^[6]肝胰脏指数和内脏指数显著上升；显著降低草鱼(Ctenopharyngodon idellus)^[7]、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)^[8]肝胰脏蛋白酶的活性；增加草鱼^[9]肝胰脏脂肪的含量；导致大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)^[10]肝胰脏严重空泡化；影响牙鲆^[6]的脂类代谢。

草鱼是典型的草食性鱼类，也是我国养殖鱼类的主要品种之一。本试验拟在配合饲料中使用不同比例(0、20%、40%、60%)的豆粕，与酪蛋白一起提供氮源，设计并制作成等氮的半纯化饲料，经过池塘网箱养殖6周后，通过肝胰脏功能指标、肝胰脏脂肪含量、肝胰脏的组织学切片及透射电镜观察，探讨饲料中豆粕含量对草鱼肝胰脏组织结构和功能的影响。

试验草鱼为当年池塘培育鱼种，饲喂浙江一星饲料厂混养一号料，平均体重为(15.5±1.4) g。

采用等氮方案，以酪蛋白和粗蛋白质含量 为43%的豆粕为蛋白质原料，设计豆粕含量分别为0(对照组)、20%、40%和60%，共配制4种半纯化试验饲料，试验饲料组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎过60目筛，用绞肉机制成直径1.5 mm、长度3～4 mm的颗粒料，风干后置于-20 ℃冰柜保存。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experiment diets (DM basis) % 项目 Items 饲料中豆粕含量 Dietary soybean meal content/% 0 20 40 60 原料 Ingredients 酪蛋白 Casein 34.0 24.3 14.6 4.9 豆粕 Soybean meal 20.0 40.0 60.0 一水合磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2·H2O 2.0 2.0 2.0 2.0 豆油 Soybean oil 3.0 3.0 3.0 3.0 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 1.0 1.0 1.0 1.0 氯化胆碱 Choline chloride 0.2 0.2 0.2 0.2 预混料 Premix1) 1.0 1.0 1.0 1.0 α-淀粉 α-starch 30.0 30.0 30.0 27.9 微晶纤维素 Microcrystalline cellulose 13.8 3.5 羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose 15.0 15.0 8.2 合计 Total 100.0 100.0 100.0 100.0 营养水平 Nutrient levels2) 粗蛋白质 Crude protein 30.16 30.15 30.15 30.15 粗脂肪 Crude lipid 3.15 3.45 3.76 4.06 钙 Calcium/(g/kg) 0.55 0.56 0.56 0.56 磷 Phosphorus/(g/kg) 0.78 0.81 0.83 0.86 1)预混料为每千克饲料提供The premix provided the following per kg of diets：Cu 5 mg，Fe 180 mg，Mn 35 mg，Zn 120 mg，I 0.65 mg，Se 0.5 mg，Co 0.07 mg，Mg 300 mg，K 80 mg，VA 10 mg，VB18 mg，VB28 mg，VB620 mg，VB120.1 mg，VC 250 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 20 mg，烟酸 niacin 25 mg，VD34 mg，VK36 mg，叶酸 folic acid 5 mg，肌醇 inositol 100 mg。 2)实测值Measured values。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experiment diets (DM basis) %

养殖试验在浙江一星饲料集团试验基地进行。在池塘中设置网箱，网箱规格为1.0 m×1.5 m×2.0 m，试验分为4组，每组设置3个重复(网箱)，每个网箱20尾鱼，共12个试验网箱。每天08:00和15:00定时投喂，日投饵量为鱼体重的5%。每周测1次水质，整个养殖试验期间，溶解氧浓度＞7.0 mg/L，pH 7.0～7.4，氨氮浓度＜0.2 mg/L，亚硝酸盐浓度＜0.01 mg/L，硫化物浓度＜0.05 mg/L。

养殖试验结束时，随机从每个网箱内取10尾鱼，以无菌的1 mL注射器自尾柄静脉采血，置于Eppenddorf离心管中室温自然凝固0.5 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上层血清分装，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存待测。

血清碱性磷酸酶(ALP)活性及胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和球蛋白(GLB)含量采用雅培C800全自动生化分析仪测定。

每组随机取6尾鱼，单独测定其体重和肝胰脏重，用于计算肝胰脏指数，并收集肝胰脏用于肝胰脏脂肪含量的测定。每组随机另取3尾鱼，在肝胰脏左叶取1 mm³左右肝胰脏3～4块，立即将其投入3％戊二醛溶液中固定，用于透射电镜分析。取1 cm³左右肝胰脏3～4块，置于Bouin氏液中固定，用于组织学切片分析。

鱼体肝胰脏脂肪含量采用AOAC(1995)^[11]的方法，即索氏抽提法测定。

组织学切片分析：采取本实验室设计的冰冻切片快速切片方法进行组织切片，采用苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝胰脏组织结构并采用尼康COOLPIX4500型相机进行拍照。

透射电镜分析：采用锇酸固定、丙酮脱水，最后放入胶囊内包埋切片染色，并采用日立H-600透射式电子显微镜观察肝胰脏组织结构并拍照。

试验结果用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用平均值±标准差(mean±SD)表示，在单因素方差分析的基础上，采用Tukey氏法多重比较检验组间差异显著性，P<0.05表示差异显著。

由表2可知，20%和40%组血清碱性磷酸酶活性及球蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和胆固醇含量与对照组相比差异不显著(P>0.05)，而60%组的上述指标均显著高于其他各组(P<0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中豆粕含量对草鱼血清生化指标的影响 Table 2 Effects of dietary soybean meal content on serum biochemical indexes of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) 饲料中豆粕含量 Dietary soybean meal content/% 球蛋白 GLB/(g/L) 碱性磷酸酶 ALP/(U/L) 甘油三酯 TG/(mmol/L) 高密度脂蛋白 HDL/(mmol/L) 胆固醇 TC/(mmol/L) 0 19.95±0.55a 191.0±80.0a 3.80±0.40a 1.95±0.02a 5.52±0.43a 20 20.20±1.15a 209.0±38.3a 3.93±0.06a 2.13±0.14a 6.28±0.60a 40 20.33±0.95a 194.3±46.2a 4.43±0.15a 2.05±0.08a 6.53±0.34a 60 28.36±3.24b 441.3±103.7b 8.17±0.67b 2.41±0.12b 10.45±1.00b 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same column, values with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05). The same as below.

表2 饲料中豆粕含量对草鱼血清生化指标的影响 Table 2 Effects of dietary soybean meal content on serum biochemical indexes of grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

由表3可知，草鱼肝胰脏脂肪含量在对照组及20%、40%组之间差异不显著(P>0.05)，60%组则显著高于前3组(P<0.05)。对照组草鱼肝胰脏指数显著高于20%组(P<0.05)，显著低于60%组 (P<0.05)，与40%组差异不显著(P>0.05)；此外，60%组草鱼肝胰脏指数显著高于其他各组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中豆粕含量对草鱼肝胰脏脂肪含量(干物质基础)和肝胰脏指数的影响Table 3 Effects of dietary soybean meal content on hepatopancreas lipid content (DM basis) and hepatopancreas index of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) % 饲料中豆粕含量 Dietary soybean meal content/% 肝胰脏指数 Hepatopancreas index 肝胰脏脂肪含量 Hepatopancreas lipid content 0 3.07±0.14a 23.1±12.4a 20 2.67±0.12b 21.1±4.5a 40 2.77±0.10ab 21.2±4.0a 60 3.45±0.18c 39.7±2.3b

表3 饲料中豆粕含量对草鱼肝胰脏脂肪含量(干物质基础)和肝胰脏指数的影响Table 3 Effects of dietary soybean meal content on hepatopancreas lipid content (DM basis) and epatopancreas index of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) %

由图1可知，对照组和60%组细胞内脂肪滴 的数量明显多于20%和40%组，这与表3中肝 胰脏脂肪含量趋势相一致。各组肝胰脏细胞膜结构较完整，但60%组部分细胞核呈异常形态(图1中箭头所示)，并位于细胞边缘。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 草鱼肝胰脏组织结构的透射电镜观察 Fig.1 Transmission electron microscopic observation of hepatopancreas tissue structure of grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

由图2可知，60%组肝胰脏细胞面积较其他各 组大(图2中箭头所示)，这与表3中肝胰脏指 数结果相一致。

图2(Figure 2)

Fig. 2

图2 肝胰脏组织结构的组织学切片观察Fig.2 Histological section observation of hepatopancreas tissue structure of grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

由表4可知，在10 000 μm²视野内，各组肝胰脏细胞核数量差异不显著(P>0.05)，但以60%组的数量最少。肝胰脏细胞核面积表现为对照组及20%、60%组之间差异不显著(P>0.05)，40%组显著小于其他组(P<0.05)，最大值出现在60%组。肝胰脏细胞核体积与细胞体积比值(Vn/Vc)各组间没有显著差异(P>0.05)，最小值出现在40%组，60%组次之。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料中豆粕含量对草鱼肝胰脏细胞核数量、面积及细胞核体积与细胞体积比值的影响Table 4 Effects of dietary soybean meal content on hepatopancreas nucleus number and area, and Vn/Vc of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) 饲料中豆粕含量 Dietary soybean meal content/% 细胞核数量 Nucleus number/10 000 μm-2 细胞核面积 Nucleus area/μm2 Vn／Vc/％ 0 17.2±2.6 151±12a 16.2±2.9 20 18.5±2.6 145±8a 15.8±1.4 40 18.8±3.7 126±3b 14.3±1.2 60 16.8±1.4 158±6a 15.3±1.8 Vn：细胞核体积nucleus volume；Vc：细胞体积cell volume。

表4 饲料中豆粕含量对草鱼肝胰脏细胞核数量、面积及细胞核体积与细胞体积比值的影响 Table 4 Effects of dietary soybean meal content on hepatopancreas nucleus number and area, and Vn/Vc of grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

血清生化指标可以反映动物体营养物质代谢和机体器官病变的情况。血清中球蛋白含量和碱性磷酸酶活性是临床医学上评价肝脏疾病的重要指标。血清球蛋白含量随肝脏炎症和纤维化加重而升高^[12]。当机体患上阻塞性黄疸和胆汁淤积性肝炎等疾病时，肝细胞会大量分泌碱性磷酸酶，由于肝内胆道胆汁排泄障碍，碱性磷酸酶会逆流入血液中进而引起血清中碱性磷酸酶活性上升^[13]。本试验中，血清中球蛋白含量和碱性磷酸酶活性最大值均出现在60%组，并显著高于其他各组，由此可知，饲料中高含量豆粕会对草鱼的肝胰脏功能造成一定影响，增加其发生炎症的可能性。

血脂有2种来源，即外源性(从饲料中摄取)和内源性(肝脏等组织合成)，高血脂是引发动物各种疾病的潜在因素^[14]。鱼类血液中70%～80%的胆固醇来自肝脏，如果肝细胞功能障碍，则血液中胆固醇含量迅速升高^[15]。血清甘油三酯、胆固醇含量可反映脂类的吸收状况，本试验中，血清中甘油三酯和胆固醇含量最高的组都是60%组，且显著高于其他各组，这与Kikuchi^[16]、Zhou等^[17]和Lim等^[18]的研究结果一致。Forsythe^[19]认为这可能是由于饲料中氨基酸组成通过内分泌系统直接或间接改变了胆固醇的代谢过程。高密度脂蛋白的作用是结合外周细胞或血液中胆固醇，并随血液循环将其转运到肝脏，这也是传统胆固醇逆转运的一个途径^[20]。因此，血清高密度脂蛋白的含量可以作为机体胆固醇代谢是否正常的指标之一，虽然本试验中血清高密度脂蛋白含量最高值出现在60%组，且与其他组差异具有显著性，但胆固醇含量最高值亦出现在60%组，说明草鱼食入过量的豆粕后会在一定程度上影响其脂类代谢，干扰脂类在草鱼体内的消化、吸收和沉积。

刘襄河等^[6]在豆粕代替鱼粉饲喂牙鲆的试验中认为，幼鱼消化系统尚不完善，对各种环境因子尤其是食物因子变化的反应较为敏感，当饲料中植物蛋白质比例增加时，可能会对消化系统的发育造成一定影响，肝胰脏指数会发生较大变化。本试验中，随着饲料中豆粕含量的增加，草鱼肝胰脏指数呈先下降后上升的趋势，且60%组显著大于其他各组，这与军曹鱼^[2]、褐点石斑鱼^[3]、吉富罗非鱼^[4]、齐口裂腹鱼^[5]的研究结果相一致。这可能是由于饲料中植物蛋白质源中的某些热稳定抗营养因子(如植酸、皂甙、低聚糖类)引起动物消化酶分泌的增加^[21]，加重肝脏的代谢负荷，引起肝脏的代偿性增大，并导致其脂肪代谢异常，影响鱼类的健康。草鱼肝胰脏脂肪含量随着饲料中豆粕含量的增加也呈现先下降后上升的趋势，最高值出现在60%组，且显著高于其他各组，这与叶元土等^[7]得出的豆粕组草鱼肝胰脏脂肪含量高于鱼粉、菜籽粕组的结果相一致。这可能是由于少量的豆粕能改善消化道功能、促进脂肪酶分泌，但过多的豆粕中的某些抗营养因子会降低肝胰脏中脂肪酶活性，关于这一点，还需进一步研究。

上述结果显示，草鱼饲料中豆粕含量增加，会导致血清碱性磷酸酶活性及球蛋白、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白含量上升，肝胰脏指数上升，肝胰脏脂肪含量增加，这可能是因为豆粕中的抗营养因子对草鱼体内各种酶的活性产生影响所致。由于草鱼血脂和肝胰脏脂肪含量都增加，因此认为饲料中高含量豆粕会增加草鱼肝胰脏发生炎症性脂肪肝的几率。

Ostaszewska等^[1]对虹鳟的研究发现，饲喂豆粕含量为44%的饲料的虹鳟其肝细胞中脂肪较多，且细胞核形态异常，认为这可能是因为豆粕中含有的不能消化的碳水化合物引起了肠道细胞内消化紊乱、胰腺分泌上皮细胞酶活性降低和新陈代谢紊乱的肝胰脏病理变化。肝细胞的细胞核大小直接关系到肝细胞的代谢活性^[22]。在本试验中，肝胰脏细胞核面积最大值出现在60%组，虽然细胞核体积与细胞体积的比值各组间没有显著差异，但是以40%组最小，60%组次之，说明60%组肝细胞中较大细胞核的数量相对较小。这与肝胰脏指数中肝胰脏可能出现代偿性增大相一致。张帆等^[10]研究发现，饲料中高含量豆粕会造成大黄鱼肝胰脏严重空泡化，这可能是由于豆粕中的皂甙和非淀粉多糖等营养拮抗因子对肝胰脏组织结构造成了破坏所致。在10 000 μm²的视野中，各组间细胞核数量没有显著差异，但是最小值出现在60%组，通过组织学切片和透射电镜观察均未发现60%组肝胰脏有明显的空泡化，这可能与本试验养殖周期较短有关。

上述结果显示，饲料中含60%的豆粕会使草鱼肝胰脏细胞体积增大，但是细胞核体积与细胞体积比值下降，从而导致肝胰脏代偿性增大，致使肝胰脏组织结构损伤。

饲料中含60%的豆粕会导致草鱼血脂和肝胰脏脂肪含量上升，增加草鱼发生炎症性脂肪肝的几率，影响草鱼肝胰脏的正常功能。同时，饲料中含60%的豆粕还可能导致草鱼肝胰脏代偿性增大，使细胞核形态异常，致使肝胰脏组织结构损伤。