蛋白质不仅为动物机体发育提供氨基酸，还为其代谢提供所需能量等[1]，所以饲料中蛋白质的供应对动物具有重要意义，且饲料中蛋白质的质量亦十分重要[2]。在加工和贮藏过程中，饲料中的蛋白质在高温、剪切、挤压、辐射等作用下会发生氧化[3]，导致其营养价值降低。目前关于氧化蛋白质对动物机体生理状态的影响主要集中于体内氧化应激引起的蛋白质修饰及其生理反应[4,5]，而关于饲料氧化蛋白质的摄入对动物机体的影响研究甚少。胰腺是消化系统中重要的腺体之一，其内外分泌功能对体内营养物质的消化吸收和代谢以及对机体各种生理过程的调节至关重要[6]。热处理是应用广泛的氧化修饰蛋白质的方法之一。因此，本试验以加热氧化1、4及8 h的大豆蛋白质饲喂肉鸡，研究摄取氧化蛋白质对肉鸡胰腺功能的影响，以期为探讨饲料源蛋白质氧化后对动物的影响提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与处理方法大豆分离蛋白质(soy protein isolate,SPI)购自南通光合生物科技有限公司，水分、粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分含量分别为5.6%、86.2%、0.4%和4.9%。参照Tang等[7]的方法分别将大豆分离蛋白质经100 ℃烘箱加热处理1、4及8 h。本实验室前期研究[8]表明，热处理会引起大豆分离蛋白质的氧化修饰，正常大豆分离蛋白质及经1、4、8 h热处理后大豆分离蛋白质羰基含量分别为15.13、15.79、17.85、22.35 nmol/mg prot，巯基含量分别为9.19、7.91、8.16、8.27 nmol/mg prot，总巯基基团含量分别为108.06、98.07、84.44、86.48 nmol/mg prot，游离氨含量分别为0.79、0.74、0.70、0.69 μmol/mg prot。
1.2 试验设计与饲养管理选用1日龄爱拔益加(AA)肉鸡320只，随机分为4个组，每组8个重复，每个重复10只，分别 饲喂4种饲粮：正常大豆分离蛋白质饲粮(对照 组)，热处理1、4及8 h的大豆分离蛋白质饲粮。试验在江苏省南京市康欣禽业有限公司进行，试验前对鸡舍进行彻底清洗、消毒。试验鸡采用笼养， 24 h光照(白天自然光照，夜间白炽灯光照)，自由采食和饮水，免疫程序按常规进行。鸡舍1~7 d温度控制在32 ℃左右，以后温度逐渐下调至室温，试验期为21 d。基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) g/kg |
于试验第14和21天，每重复选取与平均体重相近的肉鸡1只，称重后颈动脉采血于10 mL离心管中，倾斜室温放置，待析出血清后于4 ℃下3 000×g离心15 min，血清分装后于-20 ℃保存待测。鸡只放血致死后，剖开腹腔，分离出胰腺，剔除周围脂肪组织，用滤纸吸干血水后将胰腺装入自封袋于-20 ℃保存，并计算胰腺相对重量。
取0.3 g左右的胰腺组织于10 mL离心管中，加入9倍体积4 ℃下预冷的0.86%生理盐水，在冰水浴中匀浆后，于4 ℃下4 000×g离心15 min，上清液分装后于-20 ℃保存用于测定各种消化酶活性。上清液中的蛋白质含量用二喹啉甲酸(BCA)法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 胰腺消化酶活性淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定，蛋白酶活性用奚刚等[9]的方法进行测定。
1.4.2 血清和胰腺中胰岛素水平血清和胰腺中胰岛素水平均采用放射性免疫分析方法(试剂盒购自北京北方生物技术研究所)测定，均以125I标记，采用双抗法进行测定。
1.4.3 胰腺抗氧化指标胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)及丙二醛(MDA)含量均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定，试剂配制和操作步骤均按说明书进行，其中T-AOC采用化学比色法，T-SOD采用邻苯三酚自氧化法，CAT采用紫外吸收法，GPx采用二硫代二硝基苯甲酸比色法，GSH和GSSG采用比色法，MDA采用硫代巴比妥酸法(TBA)。
1.5 统计分析试验数据用Excel 2003初步整理后，采用SPSS 16.0软件进行统计，用单因子方差分析(one-way ANOVA)检验组间差异显著性，以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺相对重量的影响如图1所示，与对照组相比，饲喂热处理大豆 分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺相对重量无 显著影响(P>0.05)，但各热处理大豆分离蛋白质饲粮均显著提高了21日龄肉鸡胰腺相对重量(P<0.05)。
 | 图1 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺相对重量的影响
Fig.1 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic relative weight of broilers |
由表2可知，与对照组相比，各热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺消化酶活性均无显著影响(P>0.05)；热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺蛋白酶和胰蛋白酶活性显著降低(P<0.05)。
| 表2 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺消化酶活性的影响 Table 2 Effects of heat treatment of soy protein isolate on pancreatic digestive enzyme activities of broilers |
由表3可知，与对照组相比，各热处理大豆分离蛋白质饲粮对14和21日龄肉鸡血清和胰腺胰岛素水平均无显著影响(P>0.05)。
| 表3 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡血清和胰腺胰岛素水平的影响 Table 3 Effects of heat treatment of soy protein isolate on serum and pancreatic insulin level of broilers |
由表4可知，与对照组相比，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺T-AOC、T-SOD、CAT活性及MDA含量均无显著影响(P>0.05)；热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺T-AOC(P=0.058)和CAT(P=0.064)活性有所降低，但显著增加了MDA含量(P<0.05)。
| 表4 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic antioxidant indices of broilers |
由表5可知，与对照组相比，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺GSH和GSSG含量、GSH/GSSG及GR、GPx活性均无显著影响(P>0.05)；热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺GSH/GSSG和GPx活性显著下降(P<0.05)，GR活性有所降低(P=0.061)，但GSSG含量有升高趋势(P=0.065)。
| 表5 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺谷胱甘肽系统指标的影响 Table 5 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic glutathione redox system parameters of broilers |
胰腺相对重量是胰腺主要的功能性指标之一，大小决定其代谢率高低[10]。李竹青等[11]研究发现，饲喂氧化酪蛋白质显著增加了小鼠胰腺的脏器指数。本试验中，饲喂热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺相对重量无显著影响，但热处理大豆分离蛋白质饲粮显著提高了21日龄肉鸡胰腺相对重量，这与上述报道的结果相似，说明摄食氧化蛋白质可能会引起肉鸡胰腺代偿性增大，这可能与氧化蛋白质的难以消化有关[12]。此外，Mahmood等[13]研究发现，肉鸡相对较低的采食量也会诱导其胰腺相对重量的增加，因此热处理组肉鸡胰腺的肥大也可能与其较低的采食量有关。
3.2 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺消化酶活性及血清和胰腺胰岛素水平的影响胰腺为混合性分泌腺体，由外分泌腺体和内分泌腺体2部分组成，因此主要有外分泌和内分泌2大功能。胰腺外分泌物胰液中所含的营养物质降解酶如胰淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰脂肪酶等，是动物消化食物最主要、消化力最强的酶系[14]，因此胰液分泌紊乱会导致营养物质消化、吸收异常，降低动物的生产性能。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺消化酶活性无显著影响，但21日龄时肉鸡胰腺中蛋白酶和胰蛋白酶活性降低，说明肉鸡采食热处理大豆分离蛋白质饲粮会引起胰腺外分泌功能障碍。胰岛素是由胰腺胰岛B细胞分泌的调节糖代谢的重要激素，是胰腺内分泌主要成分之一。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14和21日龄肉鸡血清和胰腺胰岛素水平均无显著影响，这说明肉鸡采食氧化蛋白质饲粮不影响胰腺内分泌功能。
3.3 热处理大豆分离蛋白质对胰腺抗氧化指标的影响机体的氧化损伤程度可以通过对抗氧化防御系统的能力测得。T-AOC是反映机体整体抗氧化状态的重要指标，与机体健康程度密切相关[15]。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺T-AOC无显著影响，但热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺T-AOC低于对照组，提示摄食氧化蛋白质会削弱肉鸡胰腺组织的总抗氧化防御能力。CAT能将组织中的过氧化氢分解为氧和水[16]。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄试验肉鸡胰腺CAT活性无显著影响，但热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺CAT活性有所降低，说明肉鸡摄食氧化蛋白质会导致其胰腺组织清除活性氧(ROS)的能力下降，细胞受自由基的攻击程度加重。MDA是脂质过氧化反应的终产物，其含量可以间接反映自由基的产生状况和机体组织细胞的脂质过氧化程度[17]。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺MDA含量无显著影响，但热处理8 h大豆蛋白质分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺MDA含量显著升高，说明肉鸡摄食氧化蛋白质会引起其胰腺细胞膜的脂质过氧化程度增强。研究表明，饲喂加热氧化大豆蛋白质提高了小鼠胰腺自由基水平，降低了小鼠胰腺抗氧化能力，造成小鼠胰腺氧化还原状态的失衡[18]，这与本试验结果基本一致。
3.4 热处理大豆分离蛋白质对肉鸡胰腺谷胱甘肽系统指标的影响GPx是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化物分解酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应。一般认为它在细胞内能消除有害的过氧化物代谢产物，防止脂质过氧化物对机体生物膜和组织的损伤，并防止脂质过氧化物进一步水解为有害物质MDA。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄肉鸡胰腺GPx活性无显著影响，但热处理8 h大豆分离蛋白质饲粮使21日龄肉鸡胰腺GPx活性显著降低，相对较低的GPx活性可能会导致胰腺组织ROS的蓄积，增强细胞膜的脂质过氧化反应，这与胰腺组织MDA含量的分析一致。谷胱甘肽是一种含巯基的小分子肽类物质，包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)[19]。GSH能清除体内的ROS，当机体发生氧化应激时，在GPx作用下，GSH被氧化成GSSG，而GSSG则可在GR的催化并在还原氢的参与下重新合成GSH[20]。GSH含量的降低及GSSG在机体组织内的蓄积常被作为组织发生氧化应激的标志[21]，而GSH/GSSG是最能反映机体氧化应激状态的指标[22]。本试验中，热处理大豆分离蛋白质饲粮对14日龄试验肉鸡胰腺GSH/GSSG无显著影响，但热处理8 h组胰腺GSH/GSSG显著降低，说明摄食氧化蛋白质会引起肉鸡胰腺组织氧化还原状态失衡，导致其发生氧化损伤，GSH/GSSG的降低主要是GSSG含量的升高引起，而GSSG含量的升高可能与GR的活性下降有关。值得注意的是，本试验中GSH含量并未受热处理大豆分离蛋白质饲粮的影响，这可能是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、GPx及GR综合作用的结果[23]。
4 结 论摄食热处理大豆分离蛋白质饲粮对肉鸡早期(14日龄)胰腺功能相关指标无显著影响，但随着摄食热处理大豆分离蛋白质饲粮时间延长(21日龄)，肉鸡胰腺代偿性增大，胰腺胰蛋白酶和蛋白酶活性降低，并伴随胰腺抗氧化防御能力的降低，说明摄食热处理大豆分离蛋白质饲粮一定时间后会对肉鸡胰腺功能产生负面作用。
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