２. 青岛市畜牧兽医研究所, 青岛 266100
2. Qingdao Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Qingdao 266100, China
粗饲料是反刍动物的主要饲料来源，瘤胃微生物通过高效利用粗饲料获取能量维持自身需要。提高瘤胃微生物数量及其对粗饲料中纤维素类物质的利用能力，对充分利用可再生植物资源、提高反刍动物的生产性能有重要意义。寡糖是指2～10个单糖通过糖苷键连接形成的一类糖，存在于多种天然植物中。可改善肠道微生态环境、促进营养物质吸收、增强动物免疫机能。果寡糖(FOS)作为其中的一种，具有提高消化道内食糜的流通量，优化肠道菌群结构及提高饲料消化率的作用[1, 2]。近年来，国内外学者对FOS在动物生产中应用做了诸多研究，饲粮中添加FOS可显著降低仔猪[3]和雏鸡[4]肠道内的大肠杆菌的数量，同时降低料重比。Kanakupt等[5]报道，饲粮中添加0.5% FOS可显著降低成年猫肠道内大肠杆菌的数量。祁茹等[6]指出，饲粮中添加1% FOS可降低奶山羊粪便中大肠杆菌的数量，同时增加双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。凌宝明等[7]通过体外发酵的试验发现，饲粮中添加0.6%以上的FOS后，菌体蛋白(MCP)含量显著升高，中性洗涤纤维(NDF)含量显著降低。但关于FOS对奶山羊瘤胃微生物的研究多为饲粮中添加寡糖组合或多种寡糖之间的对比[2, 8, 9]。基于以上，本试验通过在奶山羊饲粮中单独添加FOS，研究不同添加水平FOS对瘤胃微生物区系及粗饲料瘤胃降解率的影响，为FOS在奶山羊养殖中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料FOS(由山东保龄宝生物股份有限公司提供，纯度为90%)、苜蓿、豆秸、青贮玉米、花生蔓、酒糟。
1.2 试验设计及分组选用体况良好、体重[(36.73±3.92) kg]相近并安装有永久性瘤胃瘘管的8月龄去势崂山奶山羊4只，采用4×4拉丁方试验设计，对照组饲喂基础饲粮；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组，分别饲喂基础饲粮中添加0.8%、1.2%及1.6%(以有效含量计)FOS的试验饲粮。试验共分4期，每期35 d，其中预试期7 d，正试期28 d。试验奶山羊分组见表1。
 | 表1 试验奶山羊分组 Table 1 The grouping of tested dairy goats |
基础饲粮配制参照我国《肉羊饲养标准》NY/T 816—2004[10]，其组成及营养水平见表2。
| 表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
试验期间奶山羊单笼饲养，每日06:30、11：30及17:30分3次等量饲喂，精饲料330 g/d，粗饲料(青贮玉米 ∶ 花生秧为2 ∶ 1)900 g/d，自由饮水，各组间饲养管理完全一致。
1.5 试验方法 1.5.1 常用粗饲料瘤胃降解率的测定采集苜蓿、豆秸、青贮玉米、花生秧、酒糟共5种粗饲料，过2 mm筛，制成风干样。
尼龙袋大小为10 cm×7 cm，孔径为400目。分别称取各样品4 g(精确至0.000 1 g)装入尼龙袋中，每3袋(即3个重复)系在1根长50 cm的半软的塑料管上，于正试期晨饲前放入瘤胃内，处理48 h后取出。取出的尼龙袋立即在自来水下冲洗，然后放入水中浸泡55 min，再在中等流速的自来水下漂洗后将尼龙袋置于65 ℃烘箱中烘至恒重。用常规分析方法分析粗饲料干物质和NDF瘤胃降解率[12]。
1.5.2 瘤胃液的采集每正试期的第28天,在试验羊晨饲前0 h(06:00)和饲喂后2(08:00)、4(10:00)、6(12：00)、10 h(晚饲前，16：00)从瘤胃不同位点采集瘤胃内容物，立即用4层纱布过滤，取5 mL放入充满二氧化碳的离心管，用于接种微生物。另取滤液1 mL，加入4 mL甲基绿染色液(MFS)轻轻摇匀，室温下保存备用原虫计数。
1.5.2.1 厌氧培养基的制备厌氧培养基的配制参照文献[13, 14]，制备好的培养基分装到亨氏管中，每支5 mL，高压灭菌后置4 ℃冰箱备用。
1.5.2.2 纤维素分解菌、真菌、细菌培养及计数纤维素分解菌计数样品稀释倍数为106～108，真菌为103～105，总细菌为107～109。
将配好的培养基在沸水中熔化，挑盖、放气。待培养基温度降低至40 ℃左右时，吸取0.5 mL稀释好的样品在无菌厌氧条件下接种到亨氏管，迅速摇匀后于冰水中滚管，使培养基均匀的涂布于亨氏管管壁上。细菌、纤维素分解菌立即在39 ℃恒温培养箱中培养48 h，真菌在39 ℃厌氧培养箱中培养48 h，按管中生长的菌落数和稀释倍数计算得到细菌、真菌、纤维素分解菌的数量[15]。 1.5.2.3 原虫的计数[16]
原虫计数样品稀释倍数为103～105，经MFS固定染色后，用刻度吸管吸取0.1 mL稀释液滴于血球计数板，静置5 min后，100倍光学显微镜计数5个中方格。同一样品计数3次，结果取平均值。
1.6 计算公式 1.6.1 待测粗饲料48 h瘤胃降解率 瘤胃降解率(%)=[(a-b)/a]×100。式中：a为降解前尼龙袋内的营养物质含量;b为降解48 h后尼龙袋内的营养物质含量。
1.6.2 原虫数量 原虫数量(个/mL)=A/5×25×104×B= 50 000×A×B。式中：A为计数的5个中方格的原虫总数;B为样品稀释倍数。
1.7 数据统计方法试验数据采用Excel软件整理，SPSS 17.0软件的one-way ANOVA程序进行方差分析，LSD法进行组间差异显著性检验，试验数据以“平均值±标准差”表示。
2 结 果 2.1 FOS对奶山羊常用粗饲料瘤胃降解率的影响由表3可知，干物质瘤胃降解率：试验组苜蓿、花生秧显著低于对照组(P<0.05)；试验Ⅰ和Ⅲ组青贮玉米比对照组提高38.51%(P<0.01)和17.91%(P<0.01)；试验Ⅲ组豆秸比对照组提高9.30%(P<0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组酒糟分别比对照组提高17.08%(P<0.01)、12.77%(P<0.01)和11.39%(P<0.01)。
| 表3 果寡糖对奶山羊常用粗饲料瘤胃降解率的影响 Table 3 Effects of FOS on degradation rate of common roughages in rumen of dairy goats % |
NDF瘤胃降解率：试验Ⅲ组青贮玉米、花生秧高于对照组5.51%(P<0.05)和12.95%(P<0.05)；试验Ⅱ和Ⅲ组豆秸显著高于对照组(P<0.05)，其中试验Ⅲ组最高，且与试验Ⅰ组差异显著(P<0.05)；试验Ⅱ组酒糟比对照组提高15.68%(P<0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组苜蓿分别比对照组提高了9.55%(P<0.05)、19.55%(P<0.01)、19.01%(P<0.01)。
2.2 FOS对奶山羊瘤胃微生物区系的影响 2.2.1 纤维素分解菌由表4可知，0 h时，各试验组纤维素分解菌的数量均显著高于对照组(P<0.05)；2 h时，试验Ⅲ组显著高于其他各组(P<0.05)，试验Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)；4 h时，试验Ⅱ组极显著高于其他各组(P<0.01)，试验Ⅲ极显著高于对照组和试验Ⅰ组(P<0.01)。就全期来看，各组均呈现先升高后下降的趋势，纤维素分解菌数量均在晨饲后4 h达到最高水平，然后逐渐下降。与其他组相比，试验Ⅱ组纤维素分解菌数量处于较优水平。
| 表4 果寡糖对奶山羊瘤胃微生物区系的影响
Table 4 Effects of FOS on ruminal microflora of dairy goats lg(CFU/mL)
|
0 h时，各试验组真菌数量均显著高于对照组(P<0.05)；2和6 h时，试验Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)，试验Ⅲ组在2 h时真菌数量也显著高于对照组(P<0.05)；4 h时，各组真菌数量均达到最高水平，试验组极显著高于对照组(P<0.01)，其中试验Ⅱ组最高；6和10 h各组真菌数量逐渐降低，在10 h趋于稳定，各组差异不显著(P>0.05)。
2.2.3 总细菌数除晨饲后4 h试验Ⅱ和Ⅲ组总细菌数显著高于对照组(P<0.05)外，其余时间点各组间均无显著差异(P>0.05)。就全期来看，各组总细菌数呈先上升后下降的趋势，在4 h达到峰值。与其他各组相比，试验Ⅱ组的单位体积内瘤胃液总细菌数处于较优水平。
2.2.4 原虫数量奶山羊饲粮中添加FOS未对瘤胃液原虫数量产生显著影响(P>0.05)，整体呈现先下降后上升的趋势，晨饲后4 h达到最低水平，并在晚饲前(10 h)恢复到晨饲前(0 h)的水平。 3 讨 论 3.1 FOS对奶山羊常用粗饲料瘤胃降解率的影响
干物质瘤胃降解率是评定饲料营养价值的重要指标，主要包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素和矿物质等物质的降解。饲料干物质瘤胃降解率高表明其在瘤胃中可利用程度高。郭勇庆[17]报道，绵羊饲粮中添加牛蒡FOS可以提高干物质的表观消化率。Barry等[2]指出，饲粮中添加短链FOS可显著提高狗回肠养分降解率与总消化道内粗蛋白质的降解率，这均与本试验结果相似，说明FOS可提高粗饲料48 h瘤胃降解率。NDF瘤胃降解率可反映反刍动物对饲料纤维成分的消化程度，凌宝明等[7]通过体外发酵的试验发现，FOS可以显著降低培养残渣中的NDF含量，即提高培养底物NDF瘤胃降解率。祁茹[18]指出，奶山羊饲粮中添加1% FOS可显著或极显著的提高苜蓿、青贮玉米等常用粗饲料的NDF和酸性洗涤纤维的瘤胃降解率。Mountzouris等[19]报道，饲粮添加FOS可以显著提高育肥猪消化道内NDF降解率。本试验结果也表明，山羊饲粮中添加FOS可以显著提高常用粗饲料48 h NDF瘤胃降解率，与上述研究结果一致。分析原因可能如下：1)FOS加速了瘤胃液相食糜外流速率和瘤胃中纤维素分解菌等微生物的增殖速度，调节了食糜在消化道内的流通量和改善了瘤胃发酵功能的功能，进而提高了饲料物质的瘤胃降解率[20]；2)瘤胃微生物在适宜的碳水化合物和蛋白质条件下分解作用增强，增殖所需的骨架原料及能源增加，除了需要氮营养外，同时还需要能量、碳架等，因此促进了干物质、NDF的消化与利用[21]。
3.2 FOS对奶山羊瘤胃液纤维素分解菌数量的影响瘤胃作为一个动态的微生态系统，其微生物区系主要包括细菌、原虫及厌氧真菌。反刍动物对粗饲料的消化利用能力与瘤胃内微生物的组成与数量有密切联系。粗饲料中纤维类物质在瘤胃微生物与瘤胃共同作用下快速降解转化为供反刍动物自身利用的营养物质[22]。研究表明，FOS对维持单胃动物消化道内有益菌群的数量有显著效果。祁茹等[8]通过采用亨氏滚管法发现，山羊饲粮中添加1% FOS可显著提高山羊单位体积瘤胃液中真菌和纤维素分解菌的数量。王新峰等[23]在羔羊饲粮中添加低聚糖指出，FOS可显著提高羔羊瘤胃内总细菌、黄化瘤胃球菌和琥珀酸丝状杆菌的数量。邰秀林等[24]对断奶犊牛的试验表明，FOS可促进瘤胃内有益微生物的增殖，促进动物生长。这与本文结果一致。本试验中，各试验组瘤胃微生物数量都高于对照组，除试验Ⅲ组纤维素分解菌在晨饲后2 h达到峰值，显著高于对照组及其他试验组外，试验Ⅱ组微生物数量最高，出现明显的剂量效应。试验Ⅲ组纤维素分解菌数量在晨饲后2 h达到峰值，时间比其他各组提前，使饲料中NDF降解速度加快，这一结论与本文中FOS可提高粗饲料NDF瘤胃降解率的结论相互印证，同时也与Mwenya等[9]和张学峰等[25]的报道一致。结果说明FOS能够促进纤维素分解菌的生长，提高粗饲料在瘤胃中的利用率，为动物提供更多的营养物质。但闵力等[26]指出，饲粮中添加功能性寡糖组合(FOS+大豆寡糖+甘露寡糖)未对锦江黄牛瘤胃固相微生物产生影响。这与本试验结论不一致，分析可能原因是本试验中分析样为液相样品，闵力等[26]分析的样品为固相样品，寡糖进入瘤胃后，对附着在食糜上的微生物作用不明显；另外，不同饲粮精粗比也可能是造成差异的原因，Demeyer[27]和Dehority等[28]指出，饲喂高粗饲料饲粮，瘤胃内纤维素分解菌等微生物数量显著高于饲喂低粗饲料饲粮。
3.3 FOS对奶山羊瘤胃液真菌数量的影响瘤胃真菌可通过分泌纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等纤维素酶利用结构性碳水化合物。本试验条件下，饲喂FOS可显著提高单位体积内瘤胃液真菌数量，分析可能原因是：真菌生长所需氮源为铵根离子(NH+4)和氨基酸形式的氮，FOS改善了瘤胃内环境，降低了瘤胃内氨态氮(NH3-N)浓度和pH，从而使真菌增殖速度加快，数量增多。肖宇等[29]和凌宝明等[7]均指出，山羊和绵羊饲粮中添加1% FOS可显著降低瘤胃内NH3-N浓度，提高挥发性脂肪酸(VFA)含量。本试验中，从整期来看，瘤胃液厌氧真菌数量自晨饲前开始上升，饲喂后4 h达最大值，然后逐渐下降，这与祁茹等[18]的研究一致。原因可能是，随着饲喂时间的延长瘤胃内原虫数量增加，导致MCP产量减少，瘤胃内NH3-N浓度升高，抑制了真菌的增殖。
3.4 FOS对奶山羊瘤胃液总细菌数的影响本试验条件下，饲粮中添加FOS并未对山羊单位体积瘤胃液内总细菌数产生显著影响，且各试验组总细菌数都处在109~1010 CFU/mL的正常范围内[15]。各组总细菌数均在晨饲后4 h达到峰值，然后缓慢下降并在晚饲前趋于平衡，分析可能原因是：动物进食后，大量饮水和饲料进入到瘤胃内，使单位体积内总细菌数下降，同时瘤胃内食糜改变了瘤胃内环境，使细菌的增殖在短时间内受到抑制；随着进食后时间的延长，瘤胃微生物因利用饲料中的营养物质而迅速增殖继而达到峰值，之后随营养物质的消耗瘤胃细菌浓度又逐渐下降，直至趋于平衡，这可能是由于晚饲前原虫数量的增加使得被吞噬的细菌数量增加，因而造成饲喂后10 h瘤胃总细菌数的减少。
3.5 FOS对奶山羊瘤胃液原虫数量的影响关于原虫在瘤胃中的作用，Storm等[30]指出，瘤胃原虫可作为反刍动物主要的蛋白质来源，为宿主提供氨基酸。Coleman[31]认为，纤毛虫死亡所释放出来的酶是瘤胃纤维降解的主要酶源；同时他还指出，瘤胃去纤毛虫后，绵羊瘤胃纤维素降解率降低50%。但赵广永等[32]则通过体外试验指出，瘤胃液中原虫数量增加是MCP产量降低的主要原因。本试验条件下，饲粮中添加FOS未对瘤胃原虫数量产生显著影响。这与张学峰等[25]和祁茹等[8]的报道结果相一致，说明饲粮中添加FOS未打破瘤胃微生物区系的平衡状态。同时，各组原虫数量均在饲喂前出现高峰，其原因可能与瘤胃内贮存性多糖水平以及纤毛虫对瘤胃内容物的趋化性有关[28]，但具体原因还有待进一步研究。
4 结 论本试验条件下，饲粮中添加FOS可提高瘤胃内纤维素分解菌及真菌的数量，提高粗饲料的瘤胃降解率，其中以1.2%的添加量为最佳。
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