2. 广东省农业科学院动物科学研究所, 广州 510640;
3. 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所, 广州 510610
, HUANG Yanhua2
, CAO Junming2, KUANG Zheshi3 , WANG Guoxia2, HUANG Wenqing2, LIU Xiaoling2
2. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;
3. Sericulture & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China
近年来，随着高密度养殖规模的不断扩大，养殖环境不断恶化，应激因子增加，鱼体抗病力下降，导致罗非鱼疾病频发，给罗非鱼养殖业带来了巨大的经济损失。因此，研究和开发具有促进生长、增强免疫力及提高抗病力等功效的添加剂已成为当前研究的热点[1]。乳酸菌作为一种益生菌，已广泛用于改善人体消化机能，促进畜禽生长以及提高其抗病力。乳酸菌在水产动物如石斑鱼(Epinephelus coioides)[2]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[3, 4]、黑鲷(Sparus aurata L.)[5]、草鱼(Ctenopharynodon idellus)[6]和鲫鱼(Carassius auratus)[7]中的研究均有报道，结果表明乳酸菌可以改善水体水质，提高养殖动物的生长性能和存活率以及增加肠道菌群数量。曾地刚等[8]研究发现乳酸杆菌能促进罗非鱼生长及提高抗病力，但也有报道认为嗜酸乳杆菌对罗非鱼的生长性能没有显著影响[9]，这可能是乳酸菌菌种不同所致。目前还没有关于多种乳酸菌应用于罗非鱼养殖的比较研究。因此，本试验拟通过比较5种乳酸菌对罗非鱼生长性能、体成分、血清生化指标及肠道菌群的影响，筛选出适宜于罗非鱼养殖的乳酸菌，为实际生产中乳酸菌的合理应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验选用5种乳酸菌，其中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)由广东省农科院蚕业鱼农产品加工研究所提供，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)购自北京北纳创联生物技术研究院，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)由华中农业大学提供。
1.2 试验饲料基础饲料组成及营养水平见表1。以基础饲料为对照，在基础饲料中分别添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌，配制乳酸菌数量不小于108 CFU/g[9, 10]的5种试验饲料。制粒后测得基础饲料及添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌的5种试验饲料中乳酸菌数量分别为1.30×103、5.10×108、2.97×108、3.03×108、2.30×108和3.47×108 CFU/g。饲料原料经粉碎过40目筛，混合均匀后用F-75型双螺杆挤条机(华南理工大学科技实业总厂生产)制成直径为2.0 mm的颗粒饲料，在空调房阴干，冷却后放入密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存待用。
 | 表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %
|
养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统(水体容积150 L)中进行。试验开始时，选择平均体重(3.49±0.01) g的健康奥尼罗非鱼480尾，随机分成6组，每组设4个重复，每个重复20尾鱼。其中，对照组(G0组)饲喂基础饲料；另外5组分别饲喂在基础饲料中添加嗜酸乳杆菌(G1组)、植物乳杆菌(G2组)、戊糖乳杆菌(G3组)、鼠李糖乳杆菌(G4组)、粪肠球菌(G5组)的试验饲料。每天在09:00和16:30各投喂1次，控制投喂量为体重的4%～6%，并收集残饵，试验期为8周。每2周称重1次，并相应调整投喂量。试验期间自然光照，水温为25～28 ℃，溶氧浓度>5 mg/L，pH 7.8～8.2，氨氮浓度≤0.02 mg/L，亚硝酸盐浓度≤0.2 mg/L。 1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 样品采集
养殖试验结束后禁食24 h，称重，统计存活率。每个重复随机取5尾鱼，用于体成分分析。每个重复另随机取5尾鱼，尾静脉取血，合并置于无菌离心管中，于4 ℃下放置2 h，然后经5 000 r/min离心10 min，取血清分装后于-80 ℃冰箱保存备用；采血后解剖取内脏、肝胰脏、肠道，内脏、肝胰脏称重，用乙醇擦拭肠道外部后用剪刀剪下后肠，再用无菌生理盐水冲洗2～3次后放入无菌离心管中，备用。
1.4.2 生长性能指标计算公式 增重率(weight gain rate，WGR，％)=100×(第2、4、6或8周时鱼重-初始鱼重)／初始鱼重； 饲料系数(feed conversion ratio,FCR)=摄食量／(第2、4、6或8周时鱼重+对应阶段内死亡鱼重-初始鱼重)； 蛋白质沉积率(protein deposition ratio,PDR，%)=100×(终末鱼体蛋白质含量－初始鱼体蛋白质含量)／摄入蛋白质量； 存活率(survival rate,SR，％)=100×终末鱼尾数／初始鱼尾数； 肝胰指数(hepatosomatic index,HSI，％)=100×肝胰脏重／体重； 内脏指数(viscerasomatic index，VSI，%)=100×内脏重／体重； 肥满度(condition factor,CF，g/cm3)=100×体重／体长3。 1.4.3 体成分分析粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分含量分别采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)、索氏抽提法(GB/T 6433—1994)、550 ℃灼烧法(GB/T 6438—1992)、105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)进行测定。
1.4.4 血清生化指标测定血清中胆固醇(cholesterol,CH)、甘油三酯(triglyceride,TG)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、葡萄糖(glucose,GLU)含量委托广州市金域医学检验中心进行检测。血清中谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,GOT)活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。
1.4.5 肠道菌群的测定在无菌超净工作台上称取肠道0.5 g左右，按1 ∶ 9(质量体积比)加入到无菌生理盐水中，冰浴中匀浆制成浓度为10-1的原液，再依次进行10倍系列稀释，根据预试验选择适宜稀释度的匀浆液测定乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌的数量及细菌总数，具体测定方法如下：取100 μL匀浆液涂布接种于所需培养基[肠道细菌总数测定采用TTC营养琼脂培养基，大肠杆菌数量测定采用山梨醇麦康凯琼脂基础(SMAC)培养基，双歧杆菌数量测定采用双歧杆菌(BBL)琼脂培养基，乳酸菌数量测定采用MRS乳酸菌琼脂培养基)中，置于培养箱培养(肠道大肠杆菌在37 ℃培养箱中培养 24 h，总细菌、双歧杆菌和乳酸菌在37 ℃培养箱中培养48 h)，培养结束后，选取平均菌落数为30～300的稀释度进行菌落计数，计算方法为每克肠道菌落形成单位，即CFU/g(平均菌落数×稀释倍数×10)，结果采用其对数值，即lg(CFU/g)表示。每个稀释度在每种培养基上做3个重复，取其平均值。
1.5 数据处理与分析试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，先对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组间有显著差异，再用Duncan氏法进行多重比较。显著性水平为P<0.05。
2 结 果 2.1 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能的影响由表2可知，第2周时，相较于G0组，各乳酸菌添加组的增重率均升高，饲料系数均降低，但差异不显著(P>0.05)。第4周时，G1组的增重率显著低于G0组(P<0.05)；G2、G3、G4和G5组的饲料系数均低于G0组，其中G2和G5组的差异达显著水平(P<0.05)，而G1组的饲料系数则显著高于G0组(P<0.05)。第6周时，除G1组外，各乳酸菌添加组的增重率均显著高于G0组(P<0.05)；G2、G3、G4和G5组的饲料系数显著低于G0组(P<0.05)。第8周时，与G0组相比，G2、G3、G5组的增重率显著升高(P<0.05)，G1组的增重率显著降低(P<0.05)；G2、G3、G4和G5组的饲料系数均低于G0组，其中G3和G5组的差异达显著水平(P<0.05)，而G1组的饲料系数则显著高于G0组(P<0.05)。试验结束(第8周)时，G2、G3、G4和G5组的蛋白质沉积率显著高于G0和G1组(P<0.05)；与G0组相比，各乳酸菌添加组的内脏指数均有不同程度下降，其中G4组显著降低(P<0.05)；与G0组相比，各乳酸菌添加组的肥满度无显著变化(P>0.05)，但5个乳酸菌添加组间表现为G1、G2和G3组显著高于G4和G5组(P<0.05)；各组间肝胰指数和存活率差异不显著(P>0.05)。
| 表2 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能的影响
Table 2 Effects of 5 kinds of Lactobacillus on growth performance of tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus)
|
由表3可知，饲料中添加不同乳酸菌均可降低鱼体的水分含量，其中G3组鱼体的水分含量显著低于G0组(P<0.05)。饲料中添加不同乳酸菌均能增加鱼体的粗蛋白质含量，其中G3和G4组显著高于G0组(P<0.05)。与G0组相比，各乳酸菌添加组鱼体的粗脂肪和粗灰分含量无显著变化(P>0.05)，但5个乳酸菌添加组间存在一些差异，其中粗脂肪含量表现为G4组显著低于G1和G3组(P<0.05)，粗灰分含量表现为G4组显著高于G2组(P<0.05)。
| 表3 5种乳酸菌对罗非鱼体成分的影响(湿重基础) Table 3 Effects of 5 kinds of Lactobacillus on body composition of tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus) (wet weight basis) % |
由表4可知，G1、G2、G4和G5组血清胆固醇含量均显著低于G0组(P<0.05)。与G0组相比，各乳酸菌添加组血清甘油三酯、尿素氮含量及谷丙转氨酶活性均有不同程度降低，其中G2组尿素氮含量显著低于G0组(P<0.05)，G4和G5组甘油三酯含量和谷丙转氨酶活性显著低于G0组(P<0.05)。G4组血清葡萄糖含量显著低于G0、G1和G2组(P<0.05)。各组血清谷草转氨酶活性无显著差异(P>0.05)。
| 表4 5种乳酸菌对罗非鱼血清生化指标的影响 Table 4 Effects of 5 kinds of Lactobacillus on serum biochemical indices of tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus) |
由表5可知，饲料中添加不同乳酸菌后肠道乳酸菌和双歧杆菌数量均有所增加，其中G1、G2和G5组乳酸菌数量显著高于G0组(P<0.05)，G1组双歧杆菌数量显著高于G0组(P<0.05)。饲料中添加不同乳酸菌对罗非鱼肠道细菌总数和大肠杆菌数量的影响不显著(P>0.05)，但均能够不同程度降低大肠杆菌的数量。
| 表5 5种乳酸菌对罗非鱼肠道菌群的影响 Table 5 Effects of 5 kinds of Lactobacillus on intestinal microflora of tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus) lg(CFU/g) |
微生物制剂作为活菌类饲料添加剂，可改善肠道菌群组成［11, 12]，调节营养物质的代谢平衡[13, 14]，改善鱼体成分[9, 15]，促进动物的生长[16, 17, 18, 19, 20]。刘玉林等[21]在对草鱼的研究中发现，粪肠球菌能显著提高草鱼存活率、增重率及特定生长率，并显著降低饲料系数。Son等[2]在对石斑鱼的研究中发现，植物乳杆菌可显著提高石斑鱼的增重率并降低饲料系数。本试验结果表明，饲料中添加植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、粪肠球菌均能促进罗非鱼的生长，降低饲料系数，与以上研究结果一致。本试验还发现，嗜酸乳杆菌组在试验前期的生长效果优于对照组，而在中后期的生长效果则要低于对照组及其他乳酸菌添加组；鼠李糖乳杆菌组在试验前中期的生长效果优于对照组，而在后期的生长效果则要低于对照组。吴志宏等[22]研究发现，在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)饲料中添加嗜酸乳杆菌(嗜酸乳杆菌饲料添加剂的活菌数为2.0×109 CFU/g)，其试验初期效果优于对照组，试验中后期生长效果差于对照组，本试验结果与其类似。这可能是由于饲料中乳酸菌长时间投喂，致使其在肠道代谢过程中产生过量的酶，抑制鱼体内内源酶的活性，降低内源酶对营养物质的分解，从而降低了生长性能[23]，该组罗非鱼肠道消化酶活性较对照组降低(数据未列出)也验证了这一点。目前，关于乳酸菌对水产动物生长性能影响的结果不一致[9]，大多数研究认为这是由于菌种不同造成的，其中菌种的来源、活菌数量、生物活性、作用方式的不同都可能产生不同的结果[24]。因此，关于不同乳酸菌在罗非鱼饲料中的适宜添加量及其投喂方式等问题有待进一步研究。
3.2 5种乳酸菌对罗非鱼体成分的影响目前，关于乳酸菌对水产动物体成分影响的报道较少。一般认为，乳酸菌在进入消化道后，能够分解产生动物生长过程中所必需的营养物质。也有报道称，益生菌(芽孢杆菌)能够提高肠道消化酶活性，促进水产动物对营养物质的消化吸收，增强机体对蛋白质的沉积[25]。本试验结果显示，饲料中添加乳酸菌能够增加奥尼罗非鱼鱼体粗蛋白质含量以及降低鱼体水分含量，其中戊糖乳杆菌和鼠李糖乳杆菌能显著提高鱼体粗蛋白质含量，前者还可显著降低鱼体水分含量，且其蛋白质沉积率的增加与鱼体粗蛋白质含量的增加趋势一致，这与杨奇慧等[26]在奥尼罗非鱼研究中所得结果一致。艾炎军等[27]在泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和华雪铭等[28]在暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)的研究中也有类似报道。
3.3 5种乳酸菌对罗非鱼血清生化指标的影响鱼类的血清生化指标能够反映出鱼类营养状况的好坏，被广泛的用来评价鱼体的新陈代谢水平和生理状况[29, 30]。袁丰华等[31]在尖吻鲈(Lates calcarifer)的研究中发现，摄食地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniforrmis)的尖吻鲈，其血液中的葡萄糖和尿素氮含量显著降低。血清尿素氮含量可以较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，氨基酸平衡良好时血清尿素氮含量下降[32]。本试验结果表明，植物乳杆菌能够显著降低血清尿素氮含量，说明其能够改善蛋白质的代谢，提高蛋白质的利用率，与鱼体粗蛋白质含量增加相吻合。葡萄糖是机体主要的能量物质，也是细胞的重要组成成分。在正常情况下，机体内合成代谢增强时，血清葡萄糖含量下降[33]。李亚杰等[34]研究益生菌·黄芪多糖微胶囊制剂对肉仔鸡的作用时发现，同一时间内各添加组肉仔鸡的增长幅度与血清葡萄糖含量的降低程度保持一致。而本试验中各乳酸菌添加组血清中葡萄糖含量均有不同程度下降，说明添加乳酸菌能够增强罗非鱼的合成代谢活动，有利于营养物质的积累。这与本试验中鱼体干物质含量增加的结果相吻合。血清中胆固醇和甘油三酯含量的变化情况是反映机体脂质代谢功能正常与否的主要指标[35]。本试验中，各乳酸菌添加组血清中胆固醇和甘油三酯含量均有不同程度的降低，其中嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌组血清胆固醇含量显著降低，后二者的血清甘油三酯含量也显著降低。外源乳酸菌可能是通过调控机体的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶及胆固醇7α-水解酶(CYP7A1)的合成和表达、降低胆固醇的重吸收等方式达到降低机体胆固醇含量的[36]，也有体外试验结果表明乳酸菌菌体细胞通过吸收、共沉淀、酶解转化等途径降低介质中胆固醇的含量[37]，具体机制需要进一步验证。
谷丙转氨酶和谷草转氨酶是广泛存在于动物线粒体中的重要氨基酸转移酶，在机体蛋白质代谢中起着重要的作用[38]。机体在正常状态下血液中谷丙转氨酶活性极低，但鱼体肝脏受损时血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性会升高[39]。本试验中，各乳酸菌添加组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性均低于对照组，其中鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌组血清谷丙转氨酶活性与对照组的差异达到显著水平，表明乳酸菌能够在一定程度上对肝脏起到保护作用，这与朱学芝等[40]在凡纳滨对虾上取得的结果一致。
3.4 5种乳酸菌对罗非鱼肠道菌群的影响益生菌可以通过生物夺氧、黏附、竞争排斥和产生抑菌代谢产物等方式调节肠道菌群的组成，抑制致病菌的过度生长，维持肠道的微生态平衡[41]。许禔森[42]在对草鱼的研究中发现，投喂乳酸菌活菌制剂后，草鱼肠道中乳酸菌数量增加，养殖水体和消化道中弧菌数量降低，表明乳酸菌具有调节养殖水体和肠道菌群构成的作用。研究发现，在凡纳滨对虾的饲料中添加益生菌能够降低肠道细菌总数，并显著降低肠道弧菌总数[12]。本试验结果显示，饲料中添加乳酸菌后肠道双歧杆菌和乳酸菌的数量增加，大肠杆菌的数量减少，说明在罗非鱼饲料中添加乳酸菌可以促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌的生长，调节肠道菌群的平衡，从而改善肠道微环境。
4 结 论综合分析认为，本试验条件下，粪肠球菌在罗非鱼中的应用效果最好。饲料中添加一定量的粪肠球菌能够提高罗非鱼的增重率和饲料利用率，降低血清胆固醇和甘油三酯含量及谷丙转氨酶活性，同时增加肠道乳酸菌数量，改善肠道微环境。
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