甘氨酸(Gly)又称α-氨基乙酸，其结构式中含有1个羧基和1个氨基，是不带电荷的极性氨基酸，属于最简单的非必需氨基酸。它的主要生理作用是参与免疫细胞的增殖以及用于合成参与炎症和免疫反应的蛋白质，是构成动物机体免疫系统的基本物质。有研究发现，Gly能够减少细胞中促炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)的分泌量，增加抗炎症因子白细胞介素10(IL-10)的分泌量，从而来调节机体的免疫功能^[1,2,3]。Gly对肝脏也具有一定的保护作用，Mikalauskas等^[4]发现，给小鼠饲喂含有5% Gly的饲粮可以减少化学疗法治疗后肝脏中转氨酶的产生量和诱生型一氧化氮合酶的基因表达量，进而减少化学疗法引起的肝脏损伤；Pabitra等^[5]向经过汞处理后的小鼠肝细胞中添加45 mmol/L的Gly，发现Gly可能通过本身的抗氧化活性来调节肝细胞的氧化应激和凋亡功能。还有大量试验表明，Gly可以修复机体细胞的氧化损伤和缺血再灌注损伤^[6,7]、增强细胞抗炎作用^[8,9]、抑制非酒精性脂肪肝的形成^[10]。由于Gly具有以上特点，所以将Gly作为添加剂或以它为主要成分的药剂应用到病畜和患者上，治疗及预防相关疾病已引起人们的关注。但目前对Gly的研究主要集中在试验鼠和人类上，对奶牛乳腺上皮细胞影响的研究很少。本课题组在前期研究中发现，泌乳奶牛乳静脉血中Gly浓度与乳中体细胞数呈现出极显著的负相关。这是否说明Gly对乳腺上皮细胞的增殖和凋亡有影响，尚需进一步研究证实。因此，本试验以体外培养的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为模型，旨在探索Gly对乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响，从而验证Gly对奶牛乳腺是否有免疫调节作用。

Gly采用L-甘氨酸，购自美国Sigma公司；DMEM/F12培养基(Gly 18.75 mg/L)、双抗、两性霉素B、胎牛血清、胰岛素转铁蛋白、0.25%的胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；平衡盐缓冲溶液(DPBS)购自美国Hyclone公司；细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司。

乳腺上皮细胞培养方法参照文献^[11]，将采自于健康的泌乳中期中国荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室，在无菌条件选取腺泡较多的深层组织，采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞，置于37 ℃、CO₂浓度为5%的培养箱中进行原代培养。根据成纤维细胞和乳腺上皮细胞对0.25%胰蛋白酶感受灵敏度的不同，通过调整消化时间来去除成纤维细胞，从而进一步纯化乳腺上皮细胞。纯化后的细胞冻存于-80 ℃冰柜备用。本试验所用的细胞是经过复苏的第2代细胞。

试验采用单因子设计，设置6个处理，分别在DMEM/F12培养基中添加0、1、2、5、10和20 mmol/L的Gly，即培养液Gly浓度分别为18.75、88.82、158.89、319.10、718.82和1 418.89 mg/L{1 mmol/L Gly=70.07 mg/L Gly，Gly浓度设置参考文献^{[12, 13, 14]}}。每个处理6个重复。分别在培养24、48和72 h时，用MTT法检测细胞增殖情况。试验重复3次。每个处理3个重复，培养24 h，用流式细胞仪检测细胞凋亡率和处于不同细胞周期的细胞比率。

将冻存的第2代乳腺上皮细胞用含有10%胎牛血清、2%双抗、0.5%转铁蛋白的DMEM/F12培养基复苏后，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。待细胞生长到90%左右收集细胞，并将细胞用上述培养基悬浮，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL后接种于96孔板，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中贴壁24 h。细胞贴壁后，用DPBS清洗细胞2遍，向每个孔中加入200 μL含Gly的培养基(DMEM/F12培养基中添加0.5%转铁蛋白，Gly添加水平为试验设计的6个水平)继续培养。每板均设置调零孔，以0 mmol/L组为对照组。

细胞换含Gly培养基培养后24、48和72 h，不倒掉培养基，直接向各孔中加入20 μL 5 mg/mL的MTT工作液，再置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。4 h后取出细胞，吸出液体，加入150 μL二甲基亚砜，在多功能酶标仪上测定490 nm处各孔的吸光度值。

将冻存的第2代乳腺上皮细胞用含有10%胎牛血清、2%双抗、0.5%转铁蛋白的DMEM/F12培养基复苏后，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。待细胞生长到90%左右收集细胞，并将细胞用上述培养基悬浮，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL,置于37 ℃、5% CO₂培养箱中贴壁24 h。细胞贴壁后，用DPBS清洗细胞2遍，再向每孔中加入2 mL只含5%转铁蛋白的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中饥饿细胞24 h。饥饿完毕，每孔换入2 mL含Gly的培养基(DMEM/F12培养基中添加0.5%转铁蛋白，Gly水平为试验设计的6个水平)继续培养，以0 mmol/L组为对照组。

取出换含Gly培养基培养后24 h的细胞，吸出培养基，用DPBS清洗细胞2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞用1×结合缓冲液(1×binding buffer)调整细胞密度至1×10⁶个/mL。转移此细胞悬液100 μL于1.5 mL离心管中，加入5 μL异硫氰酸荧光素膜联蛋白V(FITC annexin V)和碘化吡啶(PI)染液，轻微涡旋细胞并在室温避光条件下染色15 min。最后加入400 μL 1×结合缓冲液，轻微吹匀，并在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

方法同1.4.2.1。

取换含Gly培养基培养后24 h的细胞，吸出培养基，用DPBS清洗细胞2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，并收集细胞，用1 mL染色液[10 mg/mL的RNA酶100 μL，1 mg/mL的PI 500 μL，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)25 μL，磷酸盐缓冲溶液(PBS)9.4 mL]重悬细胞，染色15 min后，立即用流式细胞仪检测处于不同细胞周期的细胞比率。

试验原始数据应用Excel进行整理和计算，得到整理后的试验数据使用SAS 9.0软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

由表1可知，与0 mmol/L组比较，培养基中添加1~5 mmol/L的Gly对24和72 h的细胞增 殖能力、添加1~2 mmol/L的Gly对48 h的细胞 增殖能力均无显著影响(P>0.05)；添加5~20 mmol/L的Gly显著降低了48 h的细胞增殖能力(P<0.05),且20 mmol/L组显著低于其他各组(P<0.05)；同时，添加10~20 mmol/L Gly显著降低了24和72 h的细胞增殖能力(P<0.05)，且20 mmol/L组低于其他各组。由此可以说明，培养基中添加高水平的Gly能够抑制乳腺上皮细胞的增殖，且添加水平为20 mmol/L时抑制作用最强，5 mmol/L Gly仅在48 h产生显著抑制作用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 Gly添加水平对乳腺上皮细胞增殖能力的影响 Table 1 Effects of Gly supplemental level on proliferation ability of mammary epithelial cells OD490 nm 培养时间 Incubation time/h Gly添加水平 Gly supplemental level/(mmol/L) 0 1 2 5 10 20 24 0.54±0.05a 0.56±0.04a 0.52±0.02ab 0.53±0.02a 0.49±0.02b 0.48±0.02b 48 0.73±0.04a 0.74±0.04a 0.73±0.05a 0.69±0.04b 0.67±0.02b 0.63±0.02c 72 0.83±0.05ab 0.85±0.07a 0.82±0.03ab 0.79±0.05bc 0.75±0.04c 0.73±0.04c 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表1 Gly添加水平对乳腺上皮细胞增殖能力的影响 Table 1 Effects of Gly supplemental level on proliferation ability of mammary epithelial cells

由表2可知，与0 mmol/L组比较，培养基中添加2~20 mmol/L Gly均显著提高了细胞凋亡率(P<0.05)；1 mmol/L组的细胞凋亡率有所提高，但差异不显著(P>0.05)；20 mmol/L组显著高于其余各组(P<0.05)。以上结果说明，Gly刺激乳腺上皮细胞24 h后，能够促进其凋亡，添加水平为20 mmol/L时效果最明显。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 Gly添加水平对乳腺上皮细胞凋亡率的影响 Table 2 Effects of Gly supplemental level on apoptosis rate of mammary epithelial cells % % 项目 Item Gly添加水平 Gly supplemental level/(mmol/L) 0 1 2 5 10 20 凋亡率 Apoptosis rate 0.09±0.01c 0.13±0.01c 0.21±0.01b 0.24±0.02b 0.23±0.01b 0.28±0.02a

表2 Gly添加水平对乳腺上皮细胞凋亡率的影响 Table 2 Effects of Gly supplemental level on apoptosis rate of mammary epithelial cells

由表3可知，与0 mmol/L组比较，培养基中添加1~20 mmol/L对G0期/DNA合成前期(G1期)、DNA合成后期(G2期)/细胞分裂期(M期)无显著影响(P>0.05)；20 mmol/L组处于DNA合成期(S期)的细胞比率显著提高(P<0.05)；培养基中添加5~20 mmol/L G2期/M期数值上略有升高(P>0.05)。

氨基酸与维生素、激素等一样，是影响乳腺组织增殖的重要营养物质，它能够调节体外培养的乳腺上皮细胞增殖^[15]。有研究报道，Gly对肾小管上皮细胞的增殖有促进作用，培养基中添加94.65 mg/L(1.26 mmol/L) Gly，培养细胞36 h后，促进细胞增殖作用最强^[16]。Andreas等^[1]和Howard等^[17]也得出相似结论，他们发现低于10 mmol/L的Gly可以增强人全血细胞、Caco-2 和HCT-8细胞的增殖能力。而Rose等^[18,19]研究发现，Gly有抑制肿瘤细胞增殖的作用，其机制为Gly能够阻断核因子κB的行为，并且抑制枯否细胞合成TNF-α，从而抑制肿瘤细胞增殖。本试验中，当培养基中Gly添加水平为1 mmol/L时，在不同时间点，乳腺上皮细胞增殖能力均有所提高。而Gly添加水平增加到2 mmol/L，细胞的增殖能力开始下降，当达到10和20 mmol/L时，3个时间点的增殖能力都显著低于0 mmol/L组，可以看出，Gly在3个不同时间点对乳腺上皮细胞的作用效果的趋势是一致的，1 mmol/L Gly可以促进细胞增殖，但添加水平增加到10～20 mmol/L，即高添加水平Gly时，显著抑制乳腺上皮细胞的增殖，这与前人的试验结果基本一致。Gly影响细胞增殖能力的可能机制有：一是细胞膜上存在Gly受体^[8]，而细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、p38分裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)和蛋白激酶B(ATK)又是此受体发挥细胞保护作用的下游途径^[20]，当Gly与Gly受体结合后，增加了ERK1/2和ATK的磷酸化活性，同时又抑制了p38 MAPK的磷酸化活性，从而促进细胞增殖，达到保护细胞的作用^[21,22]。二是Gly作为一种营养素，属半必需氨基酸，是内源性抗氧化剂还原性谷胱甘肽的组成成分，为细胞的生长和增殖所需要^[23]。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 Gly添加水平对处于不同细胞周期的乳腺上皮细胞比率的影响 Table 3 Effects of Gly supplemental level on the proportion of mammary epithelial cells in different cell cycles % 项目 Items Gly添加水平 Gly supplemental level/(mmol/L) 0 1 2 5 10 20 G0期/G1期 G0 phase/G1 phase 50.94±1.96 51.03±1.93 51.70±2.01 49.74±2.29 48.89±3.95 50.44±2.35 S期 S phase 15.15±1.39bc 15.01±0.24bc 14.58±0.25c 14.09±0.26c 16.70±0.40ab 17.52±0.40a G2期/M期 G2 phase/M phase 22.52±1.76 22.09±0.81 22.84±1.02 25.47±1.02 23.15±1.58 24.21±1.64

表3 Gly添加水平对处于不同细胞周期的乳腺上皮细胞比率的影响 Table 3 Effects of Gly supplemental level on the proportion of mammary epithelial cells in different cell cycles

细胞凋亡又称细胞编程性死亡，是一切生命体生长发育和繁衍后代的基础，属正常生理现象。它与细胞坏死是2个截然不同的细胞学现象，细胞凋亡是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏的过程，而细胞坏死则是极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡^[24]。个体组织需要调节细胞增殖和凋亡达到动态平衡，来实现个体的发展。

周军利等^[25]研究发现，5 mmol/L Gly处理缺氧的心肌细胞，能够极显著减少心肌细胞凋亡。刘万军等^[26]研究Gly对梗阻性黄疸大鼠血清中TNF-α及肝细胞凋亡的影响时也得出类似结论，发现大鼠自由采食5% Gly水溶液后，肝细胞的病理性凋亡显著减少。这可能是因为Gly通过激活肝脏Kupffer细胞上Gly受体，导致氯离子内流，使细胞膜超级化，阻碍了细胞膜上钙离子通道的开启，进而使Kupffer细胞活化受到抑制，抑制Kupffer细胞活性可能是实现Gly保护作用的机制^{[27,28,29,30]}，Gly受体的本质可能是Gly门控氯离子通道^[31,32]。本试验中，随着Gly添加水平的增加，乳腺上皮细胞的凋亡率也增加，即乳腺上皮细胞凋亡与Gly浓度呈现正相关，Gly添加水平范围在2～20mmol/L，乳腺上皮细胞凋亡率对比不添加Gly组显著提高，而1 mmol/L Gly也能促进细胞凋亡，但作用效果不显著。因此该试验结果说明，Gly具有促进乳腺上皮细胞凋亡的作用，并且存在浓度依赖效应，乳腺上皮细胞凋亡与Gly浓度呈正相关。此结果与前人的研究报道不一致，其原因还不明确，有待于进一步的研究。

细胞周期分为有丝分裂期和分裂间期，而标准的细胞周期可划分为4个不同时期，即G1期、S期、G2期和M期。已有研究报道，Gly影响癌变细胞(如肝癌细胞^[33]和前列腺癌细胞^[34])以及正常组织细胞(如唾液腺祖细胞^[35])的周期进展。Nakamura等^[35]研究Gly对鼠唾液腺祖细胞增殖和分化的影响时发现，Gly延迟细胞周期停滞于S期。本试验中流式细胞仪检测细胞周期发现，Gly对G0期/G1期乳腺上皮细胞的数量无影响，表现为培养基中添加1、2、5、10、20 mmol/L Gly和不添加Gly相比G0期/G1期差异不显著，而培养基中添加10和20 mmol/L Gly能够显著提高S期细胞数，添加5、10和20 mmol/L Gly可以显著提高G2期/M期。由此说明，Gly对乳腺上皮细胞周期有影响，可显著促进细胞周期向S期转化，趋于增加G2期/M期，促进细胞分裂。

Gly能够调节奶牛乳腺上皮细胞的增殖和凋亡，对细胞增殖具有低水平(1 mmol/L)促进，高水平(10～20 mmol/L)抑制的作用，对细胞凋亡有促进作用；Gly能够促进乳腺上皮细胞向S期转化，促进细胞分裂。