酵母菌常生长在含糖量高且偏酸性环境中，营养要求不高，在豆芽汁蔗糖(无水葡萄糖)培养基、玉米粉蔗糖(或不加蔗糖)培养基中即可良好生长^[1]，酵母菌广泛地存在于自然界，并与人们的生活有着十分密切的关系。酵母菌含有大量的蛋白质、脂肪及丰富的维生素，也能耐受较高浓度的糖，被广泛应用于面包、馒头、酿酒、饲料等行业领域。酵母菌的生长受所需碳源、氮源、生长因子和无机盐等营养因素的影响。常用的碳源有无水葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等；常用氮源有蛋白胨、酵母浸提物、(NH₃)2SO₄、KNO₃、尿素、酪蛋白等^[2,3]。此外，无机盐和微量元素也是酵母生长不可缺少的物质。因此，在研究酵母菌培养基组方的过程中必须保证其营养需求。酵母菌的培养通常采用麦氏培养基，实验室中成品或半成品的培养基使用方便且酵母菌生长效果良好，但其价格昂贵，不适于生产实践中大批量的酵母菌培养。在实际生产中也有一些自制的酵母菌培养方法，比如糖蜜加葡糖糖、糖蜜加土豆粉等，这些方法虽然价格低廉却缺少科学的理论支持。基于此，课题组根据酵母细胞养分含量，同时考虑内蒙古当地农副产品现状，选取麸皮、棉籽粕和玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)等量大价廉且能为酵母菌生长提供碳源、氮源的营养物质，采用均匀试验设计液态培养基组方，通过测定液态培养基发酵后酵母活菌数及酵母多糖含量，最终确定最佳碳源、氮源以及无机盐的添加比例，旨在研究一种适合于生产用培养酵母菌且成本较低的液体培养基的组方。 1 材料与方法 1.1 供试菌株

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，SC)XR4，来源于内蒙古农业大学兽医学院反刍动物微生态制剂课题组菌种库。

酵母菌活化培养基、麦芽汁培养基、酵母菌计数培养基和虎红琼脂培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。

基础培养基^[3]：无水葡萄糖4%、酵母浸膏2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.05%、CaCl₂ 0.1%。

碳源选择基础培养基^[3]：备选碳源(无水葡萄糖、糖蜜、麸皮、玉米皮、可溶性淀粉、玉米粉、喷浆玉米皮)4%、酵母浸膏2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.05%、CaCl₂ 0.1%。

氮源选择基础培养基^[3]：备选氮源(酵母浸膏、蛋白胨、豆粕、(NH₃)₂SO₄、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、葵仁粕、玉米DDGS)2%、无水葡萄糖4%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.05%、CaCl₂ 0.1%。

酿酒酵母菌XR4接种到麦芽汁培养基中180 r/min、30 ℃培养48 h，4 ℃保存备用。

将备选氮源(碳源)分别加入到氮源(碳源)选择基础培养基后，装液量300 mL于500 mL三角瓶中，115 ℃高压灭菌20 min，然后接入5%酿酒酵母菌XR4，30 ℃恒温培养48 h后测定活菌数，每组3个重复。

通过试验1.4.1筛选出的3种最佳碳源和4种最佳氮源的添加区间如表1、表2所示。首先使用DPS数据处理系统采用均匀试验设计法优化3种碳源的最佳比例，可得到3因子5水平15处理的碳源组合均匀设计表U₁₅(5³)，分别用C1~C15来表示，见表3，然后将这15种组合分别加入到碳源选择培养基，装液量300 mL于500 mL三角瓶中，115 ℃高压灭菌20 min后接入5%酿酒酵母菌XR4，30 ℃恒温培养48 h后测定活菌数，每组3个重复，最终确定出酵母菌长势最佳的复合碳源及添加比例。同理可得到4因子5水平15处理的氮源组合均匀设计表U₁₅(5⁴)，分别表示为N1~N15，见表4，然后分别加入氮源选择培养基，采用相同方法最终确定最优复合氮源及添加比例。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 3种最佳碳源的添加区间 Table 1 The additive range of three kinds of the best carbon sources 项目 Items 无水葡萄糖 Anhydrous dextrose 麸皮 Wheat bran 糖蜜 Molasses 下限 Lower limit 0.01 0.02 0.05 上限 Upper limit 0.04 0.04 0.10

表1 3种最佳碳源的添加区间 Table 1 The additive range of three kinds of the best carbon sources

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 4种最佳氮源的添加区间 Table 2 The additive range of four kinds of the best nitrogen sources 项目 Items 棉籽粕 Cottonseed meal 酵母浸膏 Yeast extract 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS (NH3)2SO4 下限 Lower limit 0.022 5 0.005 0.02 0.005 上限 Upper limit 0.032 5 0.010 0.03 0.008

表2 4种最佳氮源的添加区间 Table 2 The additive range of four kinds of the best nitrogen sources

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 最佳碳源组合的均匀试验设计方案 Table 3 The uniform experiment design of the best combination of carbon sources 试验号 Experimental No. 无水葡萄糖 Anhydrous dextrose 麸皮 Wheat bran 糖蜜 Molasses C1 0.040 0 0.040 0 0.075 0 C2 0.010 0 0.030 0 0.100 0 C3 0.040 0 0.030 0 0.050 0 C4 0.025 0 0.040 0 0.100 0 C5 0.025 0 0.020 0 0.050 0 C6 0.032 5 0.035 0 0.087 5 C7 0.010 0 0.040 0 0.050 0 C8 0.017 5 0.035 0 0.075 0 C9 0.025 0 0.025 0 0.087 5 C10 0.032 5 0.025 0 0.062 5 C11 0.017 5 0.025 0 0.062 5 C12 0.017 5 0.030 0 0.087 5 C13 0.010 0 0.020 0 0.075 0 C14 0.040 0 0.020 0 0.100 0 C15 0.032 5 0.035 0 0.062 5

表3 最佳碳源组合的均匀试验设计方案 Table 3 The uniform experiment design of the best combination of carbon sources

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 最佳氮源组合的均匀试验设计方案 Table 4 The uniform experiment design of the best combination of nitrogen sources 试验号 Experimental No. 棉籽粕 Cottonseed meal 酵母浸膏 Yeast extract 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS (NH3)2SO4 N1 0.032 5 0.007 5 0.027 5 0.005 0 N2 0.030 0 0.008 8 0.022 5 0.005 8 N3 0.022 5 0.008 8 0.027 5 0.007 3 N4 0.027 5 0.005 0 0.022 5 0.005 0 N5 0.030 0 0.005 0 0.027 5 0.007 3 N6 0.025 0 0.010 0 0.025 0 0.005 0 N7 0.030 0 0.010 0 0.030 0 0.006 5 N8 0.025 0 0.006 3 0.022 5 0.008 0 N9 0.027 5 0.007 5 0.030 0 0.008 0 N10 0.027 5 0.010 0 0.020 0 0.007 3 N11 0.032 5 0.006 3 0.020 0 0.006 5 N12 0.032 5 0.008 8 0.025 0 0.008 0 N13 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 N14 0.022 5 0.007 5 0.020 0 0.005 8 N15 0.022 5 0.005 0 0.025 0 0.006 5

表4 最佳氮源组合的均匀试验设计方案 Table 4 The uniform experiment design of the best combination of nitrogen sources

依据1.4.2可得到5种优化复合碳源和6种优化复合氮源，将上述5种优化复合碳源和6种优化复合氮源进行组合可以得到20个组方，见表5。依据表5中各成分比例分别配制体积为300 mL液体培养基加入500 mL三角瓶，同时分别加入KH₂PO₄ 0.3%、MgSO₄ 0.05%、CaCl₂ 0.1%，115 ℃高压灭菌20 min后接入5%酿酒酵母菌XR4，30 ℃恒温培养48 h后测定培养液中活菌数以及甘露聚糖与β-葡聚糖的含量，每组3个重复。通过上述试验可得到复合碳源和复合氮源的最优组合为C8N13和C7N9，根据这2个组合的碳源和氮源组分体积比不同共形成20种不同碳氮比的组方见表6，测定指标同上，最终确定最佳复合碳氮比。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 最优碳源、氮源组合复合试验方案 Table 5 The compound testing program of the best combination of carbon and nitrogen sources 试验号 Experimental No. 组合 Combination 棉籽粕 Cottonseed meal 酵母浸膏 Yeast extract 玉米干酒 糟及其 可溶物 Corn DDGS (NH3)2SO4 无水葡萄糖 Anhydrous dextrose 麸皮 Wheat bran 糖蜜 Molasses 碳氮比 C/N 1 C5N10 0.025 0 0.020 0 0.050 0 0.027 5 0.010 0 0.020 0 0.007 3 6.78 2 C5N2 0.025 0 0.020 0 0.050 0 0.030 0 0.008 8 0.022 5 0.005 8 7.17 3 C5N13 0.025 0 0.020 0 0.050 0 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 7.56 4 C5N11 0.025 0 0.020 0 0.050 0 0.032 5 0.006 3 0.020 0 0.006 5 7.21 5 C7N13 0.010 0 0.040 0 0.050 0 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 7.51 6 C7N9 0.010 0 0.040 0 0.050 0 0.027 5 0.007 5 0.030 0 0.008 0 6.93 7 C7N14 0.010 0 0.040 0 0.050 0 0.022 5 0.007 5 0.020 0 0.005 8 7.40 8 C7N11 0.010 0 0.040 0 0.050 0 0.032 5 0.006 3 0.020 0 0.006 5 7.18 9 C9N10 0.025 0 0.025 0 0.087 5 0.027 5 0.010 0 0.020 0 0.007 3 7.17 10 C9N2 0.025 0 0.025 0 0.087 5 0.030 0 0.008 8 0.022 5 0.005 8 7.53 11 C9N13 0.025 0 0.025 0 0.087 5 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 7.87 12 C9N9 0.025 0 0.025 0 0.087 5 0.027 5 0.007 5 0.030 0 0.008 0 7.30 13 C1N13 0.040 0 0.040 0 0.075 0 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 9.08 14 C1N9 0.040 0 0.040 0 0.075 0 0.027 5 0.007 5 0.030 0 0.008 0 8.41 15 C1N14 0.040 0 0.040 0 0.075 0 0.022 5 0.007 5 0.020 0 0.005 8 9.12 16 C1N11 0.040 0 0.040 0 0.075 0 0.032 5 0.006 3 0.020 0 0.006 5 8.75 17 C8N10 0.017 5 0.035 0 0.075 0 0.027 5 0.010 0 0.020 0 0.007 3 7.10 18 C8N2 0.017 5 0.035 0 0.075 0 0.030 0 0.008 8 0.022 5 0.005 8 7.46 19 C8N13 0.017 5 0.035 0 0.075 0 0.025 0 0.006 3 0.030 0 0.005 8 7.80 20 C8N11 0.017 5 0.035 0 0.075 0 0.032 5 0.006 3 0.020 0 0.006 5 7.49

表5 最优碳源、氮源组合复合试验方案 Table 5 The compound testing program of the best combination of carbon and nitrogen sources

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 最佳碳氮比试验方案 Table 6 The testing program of the best ratio of carbon to nitrogen % 试验号 Experimental No. 组合名称 Combination name 碳源氮 源体积比 Volume ratio of carbon and nitrogen source 棉籽粕 Cottonseed meal 酵母浸膏 Yeast extrac 玉米干酒 糟及其 可溶物 Corn DDGS (NH3)2SO4 无水葡萄糖 Anhydrous dextrose 麸皮 Wheat bran 糖蜜 Molasses 碳氮比 C/N 1 1 ∶ 1 1.25 0.32 1.50 0.29 0.88 1.75 3.75 7.80 2 2 ∶ 1 0.83 0.21 1.00 0.19 1.17 2.33 5.00 9.56 3 3 ∶ 1 0.63 0.16 0.75 0.15 1.31 2.63 5.63 10.64 4 C8N13 4 ∶ 1 0.50 0.13 0.60 0.12 1.40 2.80 6.00 11.38 5 5 ∶ 1 0.42 0.11 0.50 0.10 1.46 2.92 6.25 11.91 6 6 ∶ 1 0.36 0.09 0.43 0.08 1.50 3.00 6.43 12.31 7 8 ∶ 1 0.28 0.07 0.33 0.06 1.56 3.11 6.67 12.88 8 9 ∶ 1 0.25 0.06 0.30 0.06 1.58 3.15 6.75 13.09 9 12 ∶ 1 0.19 0.05 0.23 0.04 1.62 3.23 6.92 13.53 10 15 ∶ 1 0.16 0.04 0.19 0.04 1.64 3.28 7.03 13.83 11 1 ∶ 1 1.38 0.38 1.50 0.40 0.50 2.00 2.50 6.93 12 2 ∶ 1 0.92 0.25 1.00 0.27 0.67 2.67 3.33 8.67 13 3 ∶ 1 0.69 0.19 0.75 0.20 0.75 3.00 3.75 9.84 14 4 ∶ 1 0.55 0.15 0.60 0.16 0.80 3.20 4.00 10.68 15 5 ∶ 1 0.46 0.13 0.50 0.13 0.83 3.33 4.17 11.31 16 C7N9 7 ∶ 1 0.34 0.09 0.38 0.10 0.88 3.50 4.38 12.20 17 9 ∶ 1 0.28 0.08 0.30 0.08 0.90 3.60 4.50 12.80 18 10 ∶ 1 0.25 0.07 0.27 0.07 0.91 3.64 4.55 13.03 19 12 ∶ 1 0.21 0.06 0.23 0.06 0.92 3.69 4.62 13.39 20 15 ∶ 1 0.17 0.05 0.19 0.05 0.94 3.75 4.69 13.79

表6 最佳碳氮比试验方案 Table 6 The testing program of the best ratio of carbon to nitrogen

根据课题组前期研究结果^[3]，在培养基中添加一定量的KH₂PO₄、MgSO₄、CaCl₂可满足酵母菌对无机盐的需求。本试验在优化后的培养基中加入不同比例的KH₂PO₄、MgSO₄、CaCl₂，如表7所示，然后接入5%酿酒酵母菌XR4，30 ℃培养48 h，同样通过测定培养液中活菌数以及甘露聚糖与β-葡聚糖的含量确定无机盐的添加量。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 无机盐添加量试验方案 Table 7 The testing program of the additive amount of inorganic salts % 试验号 Experimental No. KH2PO4 MgSO4 CaCl2 1 0.1 0.03 0.01 2 0.1 0.04 0.02 3 0.1 0.05 0.03 4 0.2 0.03 0.02 5 0.2 0.04 0.03 6 0.2 0.05 0.01 7 0.3 0.03 0.03 8 0.3 0.04 0.01 9 0.3 0.05 0.02

表7 无机盐添加量试验方案 Table 7 The testing program of the additive amount of inorganic salts

将试验研制的酵母菌液态培养基与基础培养基和酵母菌常用商品培养基(麦芽汁培养基和马铃薯无水葡萄糖水培养基)进行对比试验，以验证其使用效果。

采用平板倾注法^[4]。

酵母破壁：采用涡流微珠破壁法^[5]。

硫酸水解：用72％的硫酸溶液处理^[6]。

单糖含量测定：采用液相色谱-示差折光检测器测定7样品及校正多糖中甘露糖和无水葡萄糖含量^[7,8]。

结果计算：以校正多糖的含量为横坐标，峰面积为纵坐标制备校正曲线，得出回归方程。样品的峰面积代入回归方程中计算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。

试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA对数据进行方差分析；使用DPS 14.10软件运用Topsis法对数据进行多试验、多指标综合分析^[9,10]。 2 结 果 2.1 碳源及氮源选择试验结果

由表8可知，碳源选择试验中酵母菌活菌数最高是麸皮，活菌数为5.38×10⁸ CFU/mL，显著高于其余6种备选碳源(P<0.05)，其次是玉米粉和无水葡萄糖，活菌数分别是3.65×10⁸和3.28×10⁸ CFU/mL，显著高于玉米皮、糖蜜、喷浆玉米皮和可溶性淀粉(P<0.05)；7种碳源中活菌数最低的是可溶性淀粉，为0.51×10⁸ CFU/mL，仅为麸皮的约1/10。考虑备选碳源的成本单价，最终确定3种最佳碳源分别是无水葡萄糖、麸皮和糖蜜。

表8

Table 8

表8(Table 8)

表8 碳源选择试验活菌数结果 Table 8 Results of viable count in carbon source selection test 108 CFU/mL 项目 Item 无水葡萄糖 Anhydrous dextrose 糖蜜 Molasses 玉米皮 Corn bran 麸皮 Wheat bran 玉米粉 Corn flour 喷浆玉米皮 Corn husk of spray 可溶性淀粉 Soluble starch 活菌数 Viable count 3.28±0.67b 1.54±0.14c 2.10±0.44c 5.38±0.99a 3.65±1.10b 1.22±0.23cd 0.51±0.14d 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表14同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 14.

表8 碳源选择试验活菌数结果Table 8 Results of viable count in carbon source selection test

由表9可知，在氮源选择试验中棉籽粕、玉米DDGS、玉米胚芽粕和酵母浸膏的活菌数较高，分别为5.13×10⁸、4.97×10⁸、4.93×10⁸和4.87×10⁸ CFU/mL，四者之间差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他6种备选氮源(P<0.05)；而属于无机氮源的(NH₃)₂SO₄的活菌数最低，仅为1.98×10⁸ CFU/mL。考虑到玉米胚芽粕蛋白质含量高、价格较昂贵，而且在酵母菌生长繁殖过程中无机氮源与有机氮源对其产生的效果各异，最终确定4种最佳氮源为棉籽粕、玉米DDGS、酵母浸膏以及(NH₃)₂SO₄。

表9

Table 9

表9(Table 9)

表9 氮源选择试验活菌数结果 Table 9 Results of viable count in nitrogen source selection test 108 CFU/mL 备选氮源 Alternative nitrogen source 活菌数 Viable count 备选氮源 Alternative nitrogen source 活菌数 Viable count 酵母浸膏 Yeast extract 4.87±0.49a 菜籽粕 Rapeseed meal 2.11±0.18c 蛋白胨 Peptone 4.23±0.51ab 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 3.63±0.64b 豆粕 Soybean meal 2.38±0.23c 玉米胚芽粕 Corn germ meal 4.93±1.20a (NH3)2SO4 1.98±0.19c 葵花籽粕 Sunflower meal 2.26±0.58c 棉籽粕 Cottonseed meal 5.13±0.47a 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 4.97±0.55a 所有数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。 All values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表9 氮源选择试验活菌数结果Table 9 Results of viable count in nitrogen source selection test

由表10可知，在复合氮源优化试验中组合N10的活菌数最高，为8.50×10⁸ CFU/mL，显著高于其他组合(P<0.05)，组合N2、N13的活菌数次之，分别为3.67×10⁸和3.29×10⁸ CFU/mL，组合N9、N11和N14活菌数相对也比其他9个组合高；在复合碳源试验中活菌数最高的依次为组合C5、C7、C9、C1和C8，它们较其余10个样本均高。

表10

Table 10

表10(Table 10)

表10 碳源氮源组合优化试验活菌数结果 Table 10 Results of viable count in the combination of carbon and nitrogen combinatorial optimization test 108 CFU/mL 复合氮源组合号 Compound nitrogen source combination No. 活菌数 Viable count 复合碳源组合号 Compound carbon source combination No. 活菌数 Viable count N1 1.99±0.15fg C1 2.20±0.14d N2 3.67±0.05b C2 1.70±0.07de N3 1.51±0.10hij C3 1.03±0.13de N4 1.60±0.14ghij C4 1.10±0.10de N5 2.48±0.13ij C5 9.40±0.53a N6 1.34±0.09ij C6 1.24±0.09de N7 2.35±0.07ef C7 9.10±0.25b N8 1.82±0.15gh C8 2.02±0.17d N9 2.89±0.17cd C9 6.50±0.11c N10 8.50±0.62a C10 0.96±0.09de N11 2.59±0.33de C11 1.26±0.02de N12 1.18±0.08j C12 1.14±0.08de N13 3.29±0.17bc C13 1.36±0.05de N14 2.40±0.11ef C14 0.40±0.02e N15 1.85±0.47gh C15 0.38±0.03e 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表11、表12、表13同。 In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 11,Table 12 and Table 13.

表10 碳源氮源组合优化试验活菌数结果 Table 10 Results of viable count in the combination of carbon and nitrogen combinatorial optimization test

由表11可知，组合C8N13活菌数最高，可达29.43×10⁸ CFU/mL，显著高于其他19个组合(P<0.05)；其次是组合C8N11，活菌数为15.37×10⁸ CFU/mL；组合C7N9的β-葡聚糖和甘露聚糖 含量均为最高，分别为1 186.1和551.7 mg/L，显著高于其余19个组合(P<0.05)。运用Topsis法对活菌数、β-葡聚糖和甘露聚糖3个指标进行综合分析，得到优化组合为C8N13和C8N11。

表11

Table 11

表11(Table 11)

表11 20种碳源氮源复合组各指标及Topsis法排序分析结果 Table 11 Indexes of complex groups of 20 kinds of carbon and nitrogen and the sorting results of Topsis 试验号 Experimental No. 组合名称 Combination name 甘露聚糖 Mannan/(mg/L) β-葡聚糖 β-glucan/(mg/L) 活菌数 Viable count/(108 CFU/mL) D+ D plus D- D minus 统计量CI Statistics CI 名次 Ranking 1 C5N10 209.2±0.29hi 304.7±0.76fgh 2.49±0.78fg 0.826 8 0.127 1 0.133 2 19 2 C5N2 189.0±0.40i 211.0±0.16gh 1.16±0.11h 0.873 5 0.094 0 0.097 1 20 3 C5N13 227.9±0.32ghi 403.1±0.98efgh 2.60±0.61fg 0.811 0 0.155 8 0.161 2 18 4 C5N11 254.5±1.31fghi 527.9±0.45cdefgh 3.93±0.51e 0.761 2 0.206 0 0.213 0 15 5 C7N13 377.7±0.34bcde 738.0±1.69abcdef 2.55±0.12fg 0.766 5 0.296 0 0.278 6 10 6 C7N9 551.7±0.45a 1 186.1±0.37a 4.90±0.45cd 0.679 7 0.484 9 0.416 4 3 7 C7N14 382.0±0.23bcde 781.3±1.06abcdef 4.27±0.55de 0.717 3 0.317 5 0.306 8 8 8 C7N11 432.9±1.16b 664.3±0.32bcdef 5.57±0.13c 0.685 5 0.330 1 0.325 0 6 9 C9N10 246.7±0.16fghi 466.1±1.12defgh 2.58±0.12fg 0.802 5 0.177 5 0.181 1 17 10 C9N2 287.0±0.18efgh 920.4±0.41abcd 2.65±0.31fg 0.766 6 0.305 8 0.285 1 9 11 C9N13 304.9±0.31defgh 608.0±0.49cdefg 2.90±0.97f 0.774 0 0.236 3 0.233 9 13 12 C9N9 315.6±0.58cdef 584.6±1.84cdefg 2.68±0.21fg 0.780 2 0.234 9 0.231 4 14 13 C1N13 429.2±0.12bc 1 005.4±0.64abc 2.41±0.23fg 0.755 2 0.379 5 0.334 4 5 14 C1N9 399.1±0.67bcd 686.7±0.36bcdef 2.32±0.90fg 0.773 7 0.294 6 0.275 8 11 15 C1N14 323.3±0.19cdef 459.1±1.58defgh 2.11±0.78fg 0.804 4 0.211 6 0.208 3 16 16 C1N11 359.1±0.45bcde 571.2±1.78cdefg 2.26±0.98fg 0.787 2 0.251 5 0.242 1 12 17 C8N10 295.4±0.08efgh 1 115.9±0.65ab 4.20±0.30de 0.719 4 0.369 9 0.339 6 4 18 C8N2 379.1±0.20bcde 833.0±1.40abcde 4.27±0.45de 0.715 0 0.327 7 0.314 3 7 19 C8N13 333.8±0.25cdef 626.9±0.42cdefg 29.43±0.56a 0.225 7 0.824 9 0.785 2 1 20 C8N11 295.1±0.76efgh 722.7±0.27abcdef 15.37±0.45b 0.448 5 0.471 1 0.512 3 2

表11 20种碳源氮源复合组各指标及Topsis法排序分析结果 Table 11 Indexes of complex groups of 20 kinds of carbon and nitrogen and the sorting results of Topsis

由表12可知，组合3甘露聚糖含量最高，可达294.0 mg/L，高于其余19个组合，其次是组合4、17、8和10，四者差异不显著(P>0.05)；组合17的活菌数最高，为31.53×10⁸ CFU/mL，显著高于其余组合(P<0.05)，其次是活菌数分别为28.37×10⁸和27.13×10⁸ CFU/mL的组合13和9；β-葡聚 糖含量最高的为组合17和19，含量分别为843.7和839.9 mg/L，二者差异不显著(P>0.05)。运用Topsis法对活菌数、β-葡聚糖和甘露聚糖3个指标进行综合分析得到组合17排列第一，为最优组合，其碳氮比为12.80。

表12

Table 12

表12(Table 12)

表12 组合C8N13和C8N11不同碳氮比下各指标及Topsis法排序分析结果 Table 12 Indexes of different carbon and nitrogen ratios of C8N13 and C8N11 and the sorting results of Topsis 组合号 Group No. 碳氮比 C/N 活菌数 Viable count/(108 CFU/mL) β-葡聚糖 β-glucan/(mg/L) 甘露聚糖 Mannan/(mg/L) D+ D plus D- D minus 统计量CI Statistics CI 名次 Ranking 1 7.80 2.77±0.55hi 506.6±0.29d 218.4±0.23abc 0.442 2 0.191 2 0.301 8 18 2 9.56 2.37±0.57hi 469.1±1.39 194.7±0.61bc 0.455 5 0.165 1 0.266 1 19 3 10.64 3.17±0.59h 697.8±0.56abc 294.0±0.62a 0.419 0 0.288 9 0.408 1 11 4 11.38 2.20±0.52hi 730.9±0.65abc 252.8±0.78ab 0.434 2 0.265 5 0.379 4 13 5 11.91 3.90±0.56h 697.6±0.56abc 206.0±0.47abc 0.418 3 0.231 0 0.355 8 15 6 12.31 3.43±0.32h 657.6±0.22bc 172.0±0.87bcd 0.435 2 0.202 0 0.317 0 16 7 12.88 3.53±0.74h 790.3±0.66ab 221.1±0.13abc 0.418 3 0.262 6 0.385 7 12 8 13.09 17.87±0.85d 786.7±0.81ab 241.7±0.31ab 0.208 6 0.364 6 0.636 1 7 9 13.53 27.13±0.42b 738.4±0.32abc 212.9±0.06abc 0.110 7 0.450 1 0.802 6 2 10 13.83 18.77±1.17d 695.6±0.19abc 240.8±0.83ab 0.200 7 0.357 3 0.640 3 6 11 6.93 2.53±0.25hi 489.7±0.19d 185.4±0.24bc 0.453 9 0.163 9 0.265 3 20 12 8.67 3.50±0.52h 595.6±0.32cd 195.9±0.25bc 0.430 9 0.198 3 0.315 2 17 13 9.84 28.37±0.67b 736.9±0.37abc 178.6±0.22bc 0.132 2 0.456 5 0.775 5 3 14 10.68 8.67±1.29g 763.1±0.30ab 200.1±0.17abc 0.350 4 0.265 1 0.430 8 10 15 11.31 19.43±0.99d 761.7±0.39ab 204.4±0.26abc 0.201 9 0.361 1 0.641 3 5 16 12.20 3.30±0.50h 781.1±0.63ab 191.8±0.28bc 0.428 2 0.244 8 0.363 8 14 17 12.80 31.53±0.23a 843.7±1.03a 252.7±1.14ab 0.042 6 0.531 7 0.925 8 1 18 13.03 12.90±1.65e 800.3±0.23ab 181.5±0.19bc 0.297 5 0.297 5 0.500 0 8 19 13.39 24.33±1.10c 839.9±0.32a 172.4±0.21bcd 0.164 1 0.421 6 0.719 8 4 20 13.79 10.70±0.90f 800.8±0.41ab 208.4±0.32abc 0.318 7 0.291 3 0.477 6 9

表12 组合C8N13和C8N11不同碳氮比下各指标及Topsis法排序分析结果 Table 12 Indexes of different carbon and nitrogen ratios of C8N13 and C8N11 and the sorting results of Topsis

由表13可知，在无机盐添加量的试验中采用Topsis法综合活菌数、β-葡聚糖以及甘露聚糖3个指标，样本7排名第一，说明在KH₂PO₄、MgSO₄、CaCl₂添加量分别为0.3%、0.03%和0.03%时效果最好。

表13

Table 13

表13(Table 13)

表13 无机盐添加量试验各指标及Topsis法排序分析结果 Table 13 Indexes of additive amount of inorganic salts test and the sorting results of Topsis 样本 Samples 活菌数 Viable count/(108 CFU/mL) β-葡聚糖 β-glucan/(mg/L) 甘露聚糖 Mannan/(mg/L) D+ D plus D- D minus 统计量CI Statistics CI 名次 Ranking 1 1.28±0.03bcd 778.4±0.42a 286.1±0.42a 0.244 9 0.250 3 0.505 4 2 2 1.07±0.23d 774.4±0.63ab 307.5±0.63a 0.289 6 0.276 8 0.488 7 3 3 1.50±0.39bc 702.1±0.16abc 171.5±0.16b 0.293 1 0.119 1 0.288 9 5 4 1.21±0.12cd 749.6±0.20abc 205.1±0.20b 0.305 6 0.130 8 0.299 7 4 5 1.51±0.18bc 660.8±0.11cd 174.6±0.11b 0.290 6 0.115 7 0.284 7 6 6 1.19±0.19cd 660.3±0.31cd 142.4±0.31b 0.374 6 0.045 6 0.108 5 9 7 2.38±0.17a 651.6±0.58cd 210.8±0.58b 0.164 6 0.310 9 0.653 8 1 8 1.62±0.20b 583.9±0.44d 151.9±0.44b 0.312 9 0.121 5 0.279 6 7 9 1.44±0.12bcd 675.9±0.13bcd 182.4±0.13b 0.291 4 0.112 3 0.278 1 8

表13 无机盐添加量试验各指标及Topsis法排序分析结果Table 13 Indexes of additive amount of inorganic salts test and the sorting results of Topsis

由表14可知，试验研制的液态培养基其功效与麦芽汁培养基很接近，二者的活菌数分别为2.31×10⁸和2.62×10⁸ CFU/mL；基础培养基酵母 菌活菌数为0.66×10⁸ CFU/mL，其数值仅约为优 化培养基的29%，约为麦芽汁培养基的1/4；马铃薯无水葡萄糖水培养基与优化后培养基活菌数结果相比差异显著(P<0.05)，约为优化后培养基的1/2。

表14

Table 14

表14(Table 14)

表14 验证试验活菌数结果 Table 14 Results of viable count in verification test 108 CFU/mL 项目 Item 基础培养基 Basal culture medium 优化后培养基 Optimized culture medium 马铃薯无水葡萄糖水培养基 Potato anhydrous glucose culture medium 麦芽汁培养基 Malt extract medium 活菌数Viable count 0.66±0.05c 2.31±0.02a 1.29±0.02b 2.62±0.01a

表14 验证试验活菌数结果Table 14 Results of viable count in verification test

碳源是酵母菌的重要营养物质，是细胞和各种代谢产物的主要元素，同时又是酵母菌生长的能源。兼性厌氧的酵母菌通常以糖类、乙醇和乳酸等作为碳源和能源，以满足菌体生命活动的需要，一般酵母菌都利用单糖和二糖作为碳源。无水葡萄糖是酵母菌碳源的最佳选择，但它成本偏高，而糖蜜作为副产品，量大价廉，更适用于大规模生产上使用。糖蜜含有丰富的蔗糖，可为酵母生长提供充足的碳源，但其还原性糖含量较低，故在本培养基的研究中添加0.9%的无水葡萄糖和糖蜜。此外，糖蜜中也含有可供发酵性氮、无机盐和维生素，可为菌体生长提供营养。对于其他几种碳源如麸皮、玉米皮、淀粉、玉米粉等，菌体将其降解为单糖，提供所需要的碳源与能量需要。由活菌数结果可知，麸皮作为碳源时酵母菌生长情况良好，且其成本较低，故最终选择无水葡萄糖、糖蜜及麸皮作为复合碳源组分。

氮源主要用于构成菌体蛋白质、核酸等和含氮的目的产物。常用的氮源包括有机氮源(如蛋白胨、酵母粉等)和无机氮源[如(NH₃)₂SO₄、NH₄Cl、NaNO₃等]2类。无机氮源多为小分子物质，水解后被酵母菌优先利用，但添加量过高对菌体生长产生抑制作用，也会使菌发酵产生异味，本研究中(NH₃)₂SO₄的添加量最终确定为0.08%。有机氮源多为大分子物质，需要酶类将其降解后才能利用，同时含有丰富的营养物质，能够促进细胞的生长和蛋白质的合成。本研究中，以棉籽粕和玉米DDGS为氮源的选择试验中活菌数相对较高，它们既能为酵母菌生长提供营养，促进活性物质的产生，同时气味芳香又能节约成本。除此之外，一般考虑到菌体对于底物利用有所不同，在确定氮源时通常将无机氮源与有机氮源相结合。酵母浸膏中含多种生长因子和氨基酸，能够促进细胞的生长和蛋白质的合成，而且菌体生长也比较旺盛，故最终复合氮源组分包括棉籽粕、玉米DDGS、酵母浸膏和(NH₃)₂SO₄。培养1 L酵母菌液需要麦芽汁培养基成本为93.67元，马铃薯无水葡萄糖水培养基成本为16.64元，而本试验研制的液体培养基仅为0.83元，但酵母菌生长效果与麦芽汁培养基基本接近。可见，本试验研制的液态培养基既可以保证酵母菌的繁殖，又可以降低生产成本。

培养基配方中各种营养素的浓度配比不同直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成与积累，其中碳氮比的影响较大。当碳氮比偏小时，菌体生长旺盛，易造成菌体提前衰老而自溶，影响代谢产物效果；当碳氮比过大时，活菌数相对较少，不利于产物的积累；只有碳氮比在最适时，活菌数与代谢产物才能达到均衡状态。但碳源、氮源浓度均高时，可导致菌体大量繁殖，增大发酵液黏度，影响溶解氧浓度，引起菌体代谢异常，影响产物合成；同样，碳源、氮源浓度均偏小则影响菌体繁殖，也不利于产物积累。本试验通过测定每一种碳源、氮源原料的含碳量与总氮量，从而计算出每一组碳氮源组合的碳氮比，这样更加精确的得到酵母菌生长的最佳碳氮比，本研究确定碳氮比为12.80。

本试验研制出生产用酵母菌液体培养基的组方为无水葡萄糖0.9%、糖蜜4.5%、麸皮3.6%、玉米DDGS 0.3%、棉籽粕0.275%、酵母浸膏0.075%和(NH₃)₂SO₄ 0.08%，无机盐为KH₂PO₄ 0.3%、MgSO₄ 0.03%和CaCl₂ 0.03%，此时活菌数为2.38×10⁸ CFU/mL，β-葡聚糖和甘露聚糖含量分别为651.6和210.8 mg/L。