反刍动物瘤胃中含有丰富的微生物菌群，这些微生物能将饲粮中纤维素和非蛋白氮等养分发酵降解为挥发性脂肪酸(VFA)、肽类、氨基酸及氨等成分；同时利用氮源、碳源等合成微生物蛋白质(MCP)及B族维生素等。因而，瘤胃发酵功能对反刍动物生理健康及生产性能意义重大。植物精油是植物的次生代谢产物，研究显示精油具有可改善瘤胃发酵体系、降低氨氮产量、减少甲烷产生等作用^[1,2]。近年来，随着抗生素等药物性添加剂的毒副作用及残留效应逐渐被人们所认识和重视，精油等植物提取物以其无残留、毒副作用小等优势被广泛研究与应用。

苍术为菊科苍术属植物，其根茎入药，有燥湿健脾、祛风除湿的作用^[3]。现代药理研究表明，苍术含有精油和多糖等活性成分，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等有显著抑制效果，其中苍术精油有抗细菌、病毒、霉菌，防发炎，促进细胞新陈代谢等功能^[4]。目前关于植物精油特别是苍术精油对瘤胃微生物发酵影响的研究报道较少，本试验采用体外批次培养法，探讨苍术精油对肉牛瘤胃体外发酵功能的影响，为植物精油在反刍动物生产中的应用提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 试验动物、饲粮及饲养管理

选用3头平均体重为(300±15) kg安装有永久性瘤胃瘘管的健康锦江黄牛，以供瘤胃液的采集。试验动物在夏季高温环境中饲养，每天饲喂2次(08:00和18:00)，自由饮水。基础饲粮为玉米-麦麸-稻草型，精粗比为20 ∶ 80，基础饲粮组成及营养水平按照NY/T 815—2004《肉牛饲养标准》^[5](表1)。试验预试期14 d，第15天开始采集瘤胃液供体外培养。体外批次培养底物组成与瘤胃液供体牛饲粮组成完全相同。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 稻草 Rice straw 80.0 干物质 DM 88.21 玉米 Corn 10.2 净能 NE/(MJ/kg) 3.13 麦麸 Wheat bran 1.4 粗蛋白质 CP 11.76 豆粕 Soybean meal 3.6 中性洗涤纤维 NDF 60.02 棉籽粕 Cottonseed meal 3.4 酸性洗涤纤维 ADF 35.72 磷酸氢钙 CaHPO4 0.1 钙 Ca 0.64 石粉 Limestone 0.3 磷 P 0.31 食盐 NaCl 0.5 预混料 Premix1) 0.5 合计 Total 100.0 1)每千克预混料含Each kilogram of premix contained the following:VA 500 000 IU,VD3 80 000 IU,VE 2 000 000 IU,烟酸 niacin 80 g,Cu 2 g,Fe 10 g,Mn 8 g,Zn 6 g,Se 0.02 g,I 0.1 g,Co 0.02 g。 2)净能根据肉牛饲养标准[5]计算而得，其他为实测值。The net energy was a calculated value according to feeding standard of beef cattle[5],and the other nutrient levels were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

苍术精油购自某香料油有限公司，其主要成分为苍术素、β-桉油醇、茅术醇、羟基苍术酮等。苍术素对照品购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。 1.3 试验方法

采用体外批次培养法。其装置参照戈婷婷等^[6]的方法进行。此装置主体为恒温数显水浴摇床，其水浴温度和振荡速率均可调。培养瓶为150 mL的酸奶瓶，瓶口安装有橡皮塞，且橡皮塞上接有带三通阀的橡胶管，三通阀可打开和关闭，三通阀另一端与20 mL医用玻璃注射器相连，注射器用于体外培养过程中的产气量的测定。

于晨饲前由3头锦江黄牛瘤胃内上下左右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位点采集足量瘤胃液，灌入经预热达39 ℃并通有二氧化碳(CO₂)的灭菌清洁广口瓶中，广口瓶置于装有39 ℃蒸馏水的保温瓶中，灌满后立即盖好保温瓶盖子，迅速返回实验室，经4层纱布过滤后持续通入CO₂气体5 min，然后迅速分装至已预热好并装有培养底物(粉碎过40目的基础饲粮2 g、人工培养液40 mL及对应比例的苍术精油)的培养瓶内，每个培养瓶加20 mL瘤胃液。接通培养瓶和注射器，打开振荡开关，开始培养。

根据培养底物中苍术精油添加水平的不同，分别设为5个组，精油添加水平分别为0(对照组)、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%，每组设6个重复。 1.4 样品的采集与分析

从培养开始，每隔0.5 h左右记录1次产气量，每次记录完之后先关闭三通阀，放掉注射器中的气体，使注射器的刻度归零后，再打开三通阀重新培养，累计24 h的产气量之和即为总产气量。培养24 h后采集样品，立即用PHS-320型酸度计测定pH。将培养物用4层纱布过滤，将滤渣无损失地转移入100 mL大坩埚中，置于65 ℃烘箱中烘干，测定干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca，高锰酸钾滴定法)和磷(P，钼黄法)的含量等指标，测定方法参照袁缨^[7]主编《动物营养学实验教程》进行。滤液则转移至100 mL大离心管中，以1 500 r/min离心15 min，去除原虫和饲料大颗粒。离心之后取上清液在-20 ℃保存，用于测定氨态氮(NH₃-N，采用比色法测定)^[8]、MCP(采用三氯乙酸沉淀法测定)^[9]、VFA(采用GC-1690气相色谱仪)^[7]。 1.5 苍术精油中苍术素含量的测定 1.5.1 色谱条件^[3]

火焰离子化检测器(FID)，OV-1701型毛细管(30 m×0.32 mm×0.5 um)，2000色谱数据工作站，采用程序升温，初温150 ℃，初时25 min，升速10 ℃/min，终温250 ℃，终时10 min；进样室温度280 ℃，检测器温度280 ℃；柱前压力0.1 MPa，氮气作为载气。样品进样量1 μL。 1.5.2 对照品储备液的配制

精确称取一定量苍术素对照品，用正己烷配成8.60 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱备用。 1.5.3 供试品溶液的制备

准确移取苍术精油400 μL置于1 mL量瓶中，定容至刻度，作为供试品溶液，置于4 ℃冰箱备用。 1.5.4 标准曲线制备

精密量取苍术素对照品溶液25、50、100、200、400 μL分别置于1 mL量瓶中，稀释至刻度，取1 μL注入气相色谱仪，以苍术素对照品色谱峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)绘制标准工作曲线，得回归方程：Y=7 322.9X+444.16，R²=0.993 6。试验表明，苍术素在0.08～2.79 mg/mL内呈良好线性关系。 1.6 数据统计分析

基本数据处理采用Excel 2003，试验结果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序进行方差、线性和二次型分析，用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值”表示。 2 结 果 2.1 苍术精油的色谱图及苍术素含量

根据苍术素标准曲线方程：Y=7 322.9X+444.16，R²=0.993 6及苍术精油的色谱图可知，苍术精油中苍术素的含量为72.48 mg/mL。 2.2 苍术精油对锦江黄牛瘤胃微生物体外发酵参数的影响

由表2可知，添加苍术精油培养24 h后，各组瘤胃液总产气量均没有显著差异(P>0.05)，pH均处于5.58～5.66，符合瘤胃微生物正常生长范围。添加苍术精油后MCP含量均呈现增加趋势，其中添加0.75%精油组瘤胃MCP含量最高，比对照组提高了9.48%(P<0.05)，其余添加组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。各添加组瘤胃液中NH₃-N浓度呈二次型变化，其中0.50%精油添加组瘤胃液中的NH₃-N浓度最低，比对照组减少了23.08%(P>0.05)，其余各添加组均与对照组没有差异(P>0.05)。与对照组相比，各添加组各个VFA和总VFA浓度及乙酸/丙酸均无显著性变化(P>0.05)；其中0.75%精油添加组乙酸、总VFA浓度及乙酸/丙酸最大，与对照组相比，分别提高了14.16%(P>0.05)、3.84%(P>0.05)、23.28%(P>0.05)；0.25%精油添加组丙酸浓度最低，比对照组下降了16.72%(P>0.05)，1.00%精油添加组丁酸浓度最高，比对照组提高了8.84%(P>0.05)。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 苍术精油色谱图 Fig.1 The gas chromatogram of Rhizoma atractylodis oil

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 苍术精油对锦江黄牛瘤胃微生物体外发酵指标的影响 Table 2 Effects of Rhizoma atractylodis oil on rumen microbial fermentation parameters in vitro in Jinjiang yellow cattle 项目 Items 添加水平 Supplemental level/% SEM P值 P-value 0 0.25 0.50 0.75 1.00 线性Linear 二次Quadratic 总产气量 Total gas output/mL 113.83 112.33 116.00 106.50 117.00 5.19 0.990 0.817 pH 5.58 5.63 5.66 5.63 5.66 0.02 0.354 0.614 微生物蛋白质 MCP/(mg/mL) 1.16b 1.18ab 1.25ab 1.27a 1.22ab 0.02 0.052 0.104 氨态氮 NH3-N/(mg/dL) 1.82ab 1.97a 1.40b 1.80ab 1.95a 0.07 0.851 0.081 乙酸Acetate/(mmol/L) 32.35 29.52 29.83 36.93 32.52 1.12 0.318 0.690 丙酸 Propionate/(mmol/L) 28.23 23.51 25.01 26.13 27.26 0.69 0.889 0.053 丁酸 Butyrate/(mmol/L) 6.56 6.34 6.02 6.65 7.14 0.20 0.316 0.182 总挥发性脂肪酸 Total VFA/(mmol/L) 67.13 59.37 60.85 69.71 66.92 1.65 0.387 0.205 乙酸/丙酸 Acetate/propionate 1.16 1.28 1.19 1.43 1.21 0.05 0.463 0.379 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 苍术精油对锦江黄牛瘤胃微生物体外发酵指标的影响 Table 2 Effects of Rhizoma atractylodis oil on rumen microbial fermentation parameters in vitro in Jinjiang yellow cattle

由表3可知，与对照组相比，各添加组瘤胃中培养底物的DM和NDF降解率差异均不显著(P>0.05)；而ADF和CP降解率呈显著性上升(P<0.05)，0.50%精油添加组ADF降解率比对照组提高了16.13%(P<0.05)，0.25%、0.50%、0.75%和1.00%精油添加组的CP降解率比对照组分别提高了18.42%(P<0.05)、23.68%(P<0.05)、31.58%(P<0.01)和13.16%(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 苍术精油对锦江黄牛瘤胃养分体外降解率的影响 Table 3 Effects of Rhizoma atractylodis oil on rumen nutrient degradation in vitro in Jinjiang yellow cattle 项目 Items 添加水平 Supplemental level/% SEM P值 P-value 0 0.25 0.50 0.75 1.00 线性Linear 二次Quadratic 干物质降解率 DM degradation 0.32 0.33 0.33 0.33 0.34 0.00 0.333 0.808 中性洗涤纤维降解率 NDF degradation 0.36 0.40 0.37 0.36 0.35 0.01 0.241 0.316 酸性洗涤纤维降解率 ADF degradation 0.31ABb 0.27Bc 0.36Aa 0.34Aab 0.33Aab 0.01 0.012 0.253 粗蛋白质降解率 CP degradation 0.38Bc 0.45ABab 0.47Aab 0.50Aa 0.43ABbc 0.01 0.035 0.002

表3 苍术精油对锦江黄牛瘤胃养分体外降解率的影响 Table 3 Effects of Rhizoma atractylodis oil on rumen nutrient degradation in vitro in Jinjiang yellow cattle

苍术为祛湿中药，有燥湿健脾，祛风除湿的作用，其有效成分——苍术精油具有抗溃疡、抗炎、抗菌、调节胃肠道功能等作用^[4]。苍术素是苍术精油的主要成分之一，常用于评价苍术药材及苍术精油的质量。本研究表明，饲粮中添加苍术精油，提高了锦江黄牛瘤胃MCP产量，对瘤胃发酵模式产生了一定的影响。

瘤胃MCP合成的最适pH为6.0～7.0^[10]。本课题先前的研究^[11]表明常温条件下添加一定水平的苍术精油培养24 h后瘤胃液pH均处于6.02～6.12。本试验中，培养24 h后的瘤胃液pH变动在5.58～5.66，但是与对照组相比，试验组pH有上升趋势，这提示添加苍术精油能够提高瘤胃液的pH，使它更适宜于MCP合成。体外发酵产气量反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，与饲粮碳水化合物消化率高低有关，是评价反刍动物瘤胃发酵的一个重要指标。在本研究中，添加苍术精油对体外发酵的产气量无显著影响，这表明苍术精油添加后对锦江黄牛饲粮中碳水化合物的消化利用可能无影响。

瘤胃中细菌蛋白质代谢是瘤胃微生物区系营养代谢的重要组成部分^[12]。本研究表明，饲粮中添加苍术精油，体外发酵中瘤胃液MCP含量呈上升趋势，0.75%精油添加组达到最大。这可能与添加适宜浓度的苍术精油促进了瘤胃微生物的增殖，合成了更多的MCP有关。NH₃-N是瘤胃氮代谢的重要产物，也是微生物合成自身MCP的重要氮源。瘤胃内适宜的NH₃-N浓度是保证MCP合成效率的重要条件。据报道，瘤胃最佳NH₃-N浓度为0.35～29.00 mg/dL^[13]。本研究中各组NH₃-N浓度均在1.40～1.97 mg/dL内，处于文献报道的最佳浓度范围之内，但各组NH₃-N浓度值均低于本课题先前常温环境下的试验结果^[11]，这可能是由于环境温度升高，肉牛大量饮水稀释了瘤胃液NH₃-N浓度。此外，本研究结果显示，添加苍术精油后，肉牛瘤胃液的NH₃-N浓度有上升趋势，但差异不显著。这可能与精油添加量有关。Busquet等^[10]研究发现，香精油对瘤胃氮代谢的影响有剂量依赖性，高浓度组的香精油(3 000 mg/L)能够显著降低NH₃-N浓度，而低剂量组(3 mg/L)NH₃-N浓度未产生变化。

林波等^[14]在研究植物提取物对反刍动物瘤胃发酵调控研究中得出植物提取物能改变瘤胃发酵产生的VFA组成，从而调控瘤胃发酵模式。Casamiglia等^[15]研究结果表明，大蒜油、肉桂醛、丁香油、辣椒辣素和茴香醚可改善瘤胃微生物的发酵模式。本研究中添加0.75%苍术精油，乙酸、丁酸、总VFA浓度和乙酸/丙酸均呈上升趋势，丙酸呈下降趋势，这说明苍术精油可以通过调节瘤胃内微生物菌群，来改变瘤胃内丙酮酸的代谢途径，各个VFA浓度差异不显著可能提示产生的丙酮酸浓度未发生改变，只是发酵类型改变。目前，苍术精油对瘤胃发酵类型的影响尚未见报道，本研究中添加0.75%苍术精油后瘤胃液乙酸/丙酸高于对照组，分析可能是添加苍术精油对瘤胃发酵模式产生了一定的影响。 3.2 苍术精油对锦江黄牛瘤胃养分降解率的影响

反刍动物瘤胃内有个庞大的厌氧微生物菌群，这些微生物中有些能分泌纤维素酶、半纤维素酶及酯酶等酶，用以分解植物纤维。饲粮瘤胃降解率代表着该饲粮被微生物转化和利用的能力，也是影响DM采食量的一个主要因素，降解率越高，动物利用率也可能就越好^[16]。Molero等^[17]研究报道，植物精油能提高饲粮中DM和CP降解率。本试验中，饲粮添加苍术精油，可显著提高培养残渣ADF和CP的降解率，这可能是因为苍术精油刺激了瘤胃细菌和原虫的增殖，提高了纤维素分解菌等微生物对纤维素及含氮物质的降解能力，有关苍术精油对瘤胃养分降解率的影响机制还有待进一步研究。 4 结 论

本试验结果表明，饲粮添加0.75%苍术精油能够促进锦江黄牛瘤胃MCP的合成，提高瘤胃养分降解率。