中华绒螯蟹(Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis)，俗称河蟹，其品质由其体色及口感风味决定，但体色对价格的影响更直接。研究表明，池塘养殖的中华绒螯蟹体色不如湖泊网围养殖的中华绒螯蟹^[1]。随着湖泊治理的深入，缩小网围养殖面积势在必行。然而，人们对优质中华绒螯蟹的需求却在不断增加。改善池塘养殖中华绒螯蟹的品质是解决这一矛盾的重要途径，也是中华绒螯蟹养殖业持续发展的内在需求。

中华绒螯蟹的体色取决于其类胡萝卜素含量^[2,3]。它自身不能合成类胡萝卜素，但可以将食物中的类胡萝卜素直接沉积或转化为自身所需的类胡萝卜素^[4,5]，因而类胡萝卜素摄入不足时影响其体色。研究表明，β-胡萝卜素和叶黄素中的虾青素对甲壳类动物的体色影响较大^[6]。微藻^[7,8]、苜蓿(Medicago sativa)^[9]等材料中类胡萝卜素含量丰富。以螺旋藻(Spirulina)为饵料喂养色素缺陷综合征的印度明对虾(Fenneropenaeus indicus)能够显著提高其卵和幼虫中色素含量^[10]。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)被看作是天然虾青素的“浓缩品”，在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)饲料中添加0.5%的雨生红球藻，2周后其肌肉和虾壳中类胡萝卜素含量均得到显著提高^[11]。苜蓿粉中叶黄素含量达260 mg/kg，饲料中添加苜蓿粉对凡纳滨对虾体色有明显的改善作用^[9]。

不同来源、不同种类的类胡萝卜素在甲壳类动物体内的代谢途径不同^[12,13,14]，并且不同类胡萝卜素源的价格差异也较大，因此有必要比较不同类胡萝卜素源对中华绒螯蟹体色改善效果的差异。本试验拟比较螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉3种类胡萝卜素源对中华绒螯蟹体色的改善效果，为改善中华绒螯蟹体色筛选出合适的类胡萝卜素源，也为中华绒螯蟹品质优化饲料的研发提供参考。

试验用中华绒螯蟹购自苏州市阳澄湖国家现代农业产业园有限公司，螺旋藻和苜蓿粉购自东营市康瑞科技开发有限责任公司，雨生红球藻购自山东威福思特生物技术有限公司。

参考凡纳滨对虾的研究结果^[11]，结合螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉中类胡萝卜素实测含量，设计三者在饲料中的添加量分别为2.00%、0.55%、15.00%，以不添加类胡萝卜素源的饲料为对照饲料。4种试验饲料等氮等能，其组成及营养水平见表1。将所有原料用锤片式粉碎机粉碎，过60目筛。将各种原料混合均匀，加蒸馏水调质，用1.5 mm孔径的小型绞肉机将饲料制成面条状，室温风干，然后破碎成长度不超过1 cm的颗粒，-20 ℃保存备用。经试验，所有试验饲料均可在水中稳定存在1 h以上。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (as-fed basis) % 项目 Items 组别 Groups 对照Control 螺旋藻Spirulina 雨生红球藻 Haematococcus pluvialis 苜蓿粉 Alfalfa meal 原料 Ingredients 螺旋藻 Spirulina platensis 2.00 雨生红球藻 Haematococcus pluvialis 0.55 苜蓿粉Alfalfa meal 15.00 小麦麸 Wheat bran 12.00 10.00 11.45 菜籽粕 Rapeseed meal 10.00 10.00 10.00 10.00 淀粉 Starch 20.00 20.00 20.00 17.00 鱼粉 Fish meal 30.00 30.00 30.00 30.00 小虾米 Trash shrimp 2.00 2.00 2.00 2.00 乌贼膏 Squid visceral ointment 2.00 2.00 2.00 2.00 豆粕 Soybean meal 15.00 15.00 15.00 15.00 豆油 Soybean oil 4.00 4.00 4.00 4.00 一水合磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2·H2O 2.00 2.00 2.00 2.00 预混料 Premix1) 1.00 1.00 1.00 1.00 沸石粉 Zeolite 2.00 2.00 2.00 2.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 粗蛋白质 Crude protein 34.6 34.6 34.6 35.0 粗脂肪 Crude lipid 7.1 7.3 7.3 7.5 水分 Moisture 8.5 8.9 8.9 9.1 类胡萝卜素 Carotenoid/(mg/kg) 6.0 67.2 67.6 49.5 1)预混料为每千克饲料提供Premix provided the following per kg of diets：MgSO4·7H2O 3 g，KCl 4.5 g，FeSO4·H2O 150 mg，CuSO4·5H2O 40 mg，ZnSO4·H2O 100 mg，MnSO4·H2O 30 mg，KI 10 mg，CoCl2·6H2O 5 mg，Na2SeO3 2.4 mg，VA 10 000 IU，VD 4 000 IU，VE 150 mg，VK 3 mg，VB1 3 mg，VB2 4 mg，VB6 6 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 5 mg，烟酸 nicotinic acid 12 mg，叶酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 6 mg; VB12 0.2 mg，黏合剂 adhesive 3 g。各种维生素、矿物质原料均由上海三智生物科技有限公司提供All these ingredients of vitamins and minerals were supplied by Shanghai Sanzhi Biotech. Co.,Ltd。 2)实测值Measured values。

表1 试验饲料组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (as-fed basis)

中华绒螯蟹购回后用2%食盐水消毒，每箱放50只左右，以对照饲料驯养2周。然后选择健康、行动敏捷、大小均匀的个体[初重为(8.9±0.3) g]随机分到16个水族箱中，每箱15只。每种饲料投喂4箱蟹，试验期为60 d。

在室内循环养殖系统中进行养殖试验。以曝气的自来水为水源，养殖水经沉淀、过滤回流到蓄水池，经过增氧后由水泵抽回到各水族箱内。每天补充总水量10%～15%的曝气自来水。水族箱规格为140 cm×70 cm×50 cm，盛水0.3 m³，水交换速度为5 L/min，箱内设置直径为5 cm、长为20 cm的聚氯乙烯(PVC)管作隐蔽物。试验期间的水温为22～26 ℃，溶解氧浓度>6.0 mg/L，pH为7.5左右，氨氮浓度为0.1～0.2 mg/L，亚硝酸盐浓度为0.05～0.20 mg/L，硫化物浓度<0.05 mg/L。每天18:00投喂，21：00收集残饵。每周清洗养殖系统2次。

饲养60 d后停食24 h，统计存活蟹数，称重，计算存活率和特定生长率：

存活率(%)=100×(终末存活蟹数/
初始投放蟹数)；

特定生长率(%/d)=100×(ln终末体重-
ln初始体重)/试验天数。

从每箱随机取10只蟹，用自来水冲洗数次后用干净的毛巾擦净肢体，取头胸甲、肝胰腺。所采集样品用液氮速冻，-50 ℃保存，用以测定类胡萝卜素和虾青素含量。

类胡萝卜素的提取过程在避光和冰浴条件下参照Tolasa等^[15]和Chien等^[16]的方法进行：样品冷冻干燥(ALPHA1-2LD Plus冷冻干燥机，德国)12 h，研磨样品成粉末，取0.5 g样品，放入50 mL离心管中，加30 mL丙酮，用高速匀浆机(Ika-T18，德国)10 000 r/min匀浆1 min，再8 000 r/min离心10 min。重复提取3次(或至提取液无色)，合并提取液，转入250 mL分液漏斗中，加40 mL正己烷和100 mL 0.5% NaCl溶液，摇匀静止25 min后，放掉下层水溶性成分，在上层的正己烷提取液中加入5 g无水Na₂SO₄脱水，转入棕色容量瓶中用正己烷定容至50 mL。用分光光度法(HITACHI U-3900紫外分光光度计，日本)在波长470 nm下测定定容后溶液的吸光度值，并根据虾青素标准曲线(y=4.855 2x+0.073 5，R²=0.999 3)计算样品中类胡萝卜素含量。正己烷提取液中的虾青素含量采用高效液相色谱法测定。色谱柱为Waters Bondapak^TM C18(300 mm×3.9 mm)，流动相甲醇 ∶ 水=1 ∶ 1，流速1 mL/min，检测波长470 nm，柱温为室温，进样体积20 μL。虾青素的识别通过相同条件的标准品(DR，95.5%)的出峰时间确定；根据虾青素标准品的积分面积做标准曲线(y=3.16×10^-5x，R²=0.996 5)，计算样品中虾青素含量。

试验结果以平均值±标准差(mean±SD，n=4)表示，采用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析，并用Turkey氏法进行多重比较，显著水平为P<0.05。

饲养过程中中华绒螯蟹摄食和生长表现正常。由表2可知，经过60 d的饲养，中华绒螯蟹的平均体重从8.9 g/只提高到20.3 g/只，但各组终末体重、存活率和特定生长率差异不显著(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中添加螺旋藻、雨生红球藻和苜蓿粉对中华绒螯蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of supplementations of Spirulina,Haematococcus pluvialis and alfalfa meal on growth performance of Chinese mitten crab 组别 Groups 初始体重 IBW/(g/只) 终末体重 FBW/(g/只) 存活率 SR/% 特定生长率 SGR/(%/d) 对照 Control 8.8±0.1 19.3±1.4 73±12 1.30±0.14 螺旋藻 Spirulina 8.8±0.2 19.4±1.8 72±6 1.31±0.13 雨生红球藻 Haematococcus pluvialis 9.2±0.3 21.9±1.4 77±9 1.45±0.13 苜蓿粉 Alfalfa meal 9.0±0.3 20.7±1.9 73±5 1.38±0.13 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 饲料中添加螺旋藻、雨生红球藻和苜蓿粉对中华绒螯蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of supplementations of Spirulina,Haematococcus pluvialis and alfalfa meal on growth performance of Chinese mitten crab

采样时目测发现投喂添加类胡萝卜素源饲料的3组中华绒螯蟹体色均比对照组深。

由表3可知，螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉组中华绒螯蟹头胸甲中类胡萝卜素含量依次增加，分别为(122.7±1.3) μg/g、(140.3±2.2) μg/g、(149.5±7.3) μg/g，而对照组中华绒螯蟹头胸甲中类胡萝卜素含量仅为(66.0±4.6) μg/g，3个试验组比对照组分别提高了86%、113%和127%，差异显著(P<0.05)，同时雨生红球藻、苜蓿粉组还显著高于螺旋藻组(P<0.05)；螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉组中华绒螯蟹肝胰腺中类胡萝卜素含量分别为(26.5±4.0) μg/g、(43.5±2.7) μg/g、(52.5±2.5) μg/g，分别比对照组的(14.2±3.3) μg/g提高了87%、206%和270%，各组间差异均达显著水平(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中添加螺旋藻、雨生红球藻和苜蓿粉对中华绒螯蟹头胸甲和肝胰腺中类胡萝卜素和虾青素含量的影响 Table 3 Effects of supplementations of Spirulina,Haematococcus pluvialis and alfalfa meal on carotenoid and astaxanthin contents in carapace and heaptopancereas of Chinese mitten crab 组别 Groups 头胸甲 Carapace 肝胰腺 Heaptopancereas 类胡萝卜素 Carotenoid 虾青素 Astaxanthin 类胡萝卜素 Carotenoid 虾青素 Astaxanthin 对照 Control 66.0±4.6a 39.3±3.0a 14.2±3.3a 8.7±1.8a 螺旋藻 Spirulina 122.7±1.3b 91.9±6.0b 26.5±4.0b 17.3±3.4b 雨生红球藻 Haematococcus pluvialis 140.3±2.2c 100.7±2.5bc 43.5±2.7c 29.9±2.2c 苜蓿粉 Alfalfa meal 149.5±7.3c 102.6±5.6d 52.5±2.5d 36.7±1.6d

表3 饲料中添加螺旋藻、雨生红球藻和苜蓿粉对中华绒螯蟹头胸甲和肝胰腺中类胡萝卜素和虾青素含量的影响 Table 3 Effects of supplementations of Spirulina,Haematococcus pluvialis and alfalfa meal on carotenoid and astaxanthin contents in carapace and heaptopancereas of Chinese mitten crab

由表3可知，螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉组中华绒螯蟹头胸甲中虾青素含量依次为(91.9±6.0) μg/g、(100.7±2.5) μg/g、(102.6±5.6) μg/g，分别比对照组的(39.3±3.0) μg/g提高了134%、156%、161%，差异显著(P<0.05)，同时苜蓿粉组还显著高于螺旋藻、雨生红球藻组(P<0.05)；螺旋藻、雨生红球藻、苜蓿粉组肝胰腺中虾青素含量依次为(17.3±3.4) μg/g、(29.9±2.2) μg/g、(36.7±1.6) μg/g，分别比对照组的(8.7±1.8) μg/g提高了99%、244%、322%，各组间差异均达显著水平(P<0.05)。

本试验结果表明，3种类胡萝卜素源对中华绒螯蟹生长性能的影响无显著差异，但对体色的影响差异较大，以苜蓿粉的增色效果最强，雨生红球藻次之，螺旋藻最差。

螺旋藻中类胡萝卜素含量高达3 360 mg/kg，玉米黄质和β-胡萝卜素是其类胡萝卜素的主要组成部分^[17]。本试验中，饲料中添加2.00%的螺旋藻，中华绒螯蟹头胸甲和肝胰腺中类胡萝卜素含量显著高于对照组，表明螺旋藻中的类胡萝卜素经过代谢能够在中华绒螯蟹体内得到有效积累，从而起到增色效果。这一结果与张饮江等^[18]的研究结果相一致。

雨生红球藻中虾青素含量为1.5%～3.0%，被看作是天然虾青素的“浓缩品”^[11]，大量研究表明雨生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其他绿藻高，而且雨生红球藻所含虾青素及其酯类的配比(约70%的单酯、25%的双酯及5%的单体)与水产养殖动物自身配比极为相似^[19]。虾青素是甲壳类动物类胡萝卜素代谢途径中的终产物和重要储存形式^[20]。已有研究表明，在日本沼虾饲料中添加50 mg/kg雨生红球藻，经过63 d饲养后体色改善明显^[5]。本试验中，添加0.55%雨生红球藻的饲料中类胡萝卜素含量为67.6 mg/kg，与添加2.00%螺旋藻饲料的67.2 mg/kg相当，但头胸甲和肝胰腺中积累的类胡萝卜素和虾青素的量要高于螺旋藻组，这表明雨生红球藻作为中华绒螯蟹类胡萝卜素源比螺旋藻的增色效果要好。但雨生红球藻价格昂贵，比较适合在中华绒螯蟹上市前的短期内增色使用。

苜蓿粉中类胡萝卜素含量达330 mg/kg，其中叶黄素含量达260 mg/kg^[9]，已被作为色素源在动物饲料中广泛应用。肉仔鸡饲粮中添加苜蓿草粉后，肉仔鸡皮肤颜色明显加深^[21]；产蛋鸡饲粮中添加苜蓿草粉后，蛋黄色泽也得到显著提高^[22]。在水产动物上，有报道称添加苜蓿提取物可改善南美白对虾的体色，且6%的苜蓿提取物在着色效果上优于饲料着色剂加丽素红^[23]；另有报道称5%～20%的苜蓿草粉对黄河鲤鱼的增色效果显著^[24]。从本试验的结果来看，添加15%苜蓿粉的饲料中类胡萝卜素含量为49.5 mg/kg，低于添加2.00%螺旋藻和0.55%雨生红球藻的饲料(对应饲料中类胡萝卜素含量分别为67.2和67.6 mg/kg)，但中华绒螯蟹头胸甲和肝胰腺中类胡萝卜素和虾青素含量却是3组中最高的。这提示，类胡萝卜素含量在一定范围内时，苜蓿粉对中华绒螯蟹体色的改善作用优于螺旋藻和雨生红球藻。虽然苜蓿粉对体色相对高效的改善机制尚不清楚，但与螺旋藻和雨生红球藻相比，其价格低廉，原料容易获得，还可作为蛋白质源来使用，因此更宜选用。

① 饲料中添加螺旋藻、雨生红球藻和苜蓿粉均可以显著改善中华绒螯蟹的体色。

② 本试验条件下，对中华绒螯蟹体色的改善效果以苜蓿粉最好，螺旋藻最差。