反刍动物饲粮中含一定比例的粗饲料有助于提高乳脂率，同时对保持瘤胃健康有利[1]。但我国粗饲料品质较差，优质粗饲料如苜蓿短缺，大部分依赖进口，2012年苜蓿进口量已达44.22万t。我国种植紫花苜蓿的主要省区为：甘肃、内蒙古、陕西、新疆和宁夏，种植面积分别占全国总面积的18.1%、13.6%、13.1%、10.7%和10.3%[2]。紫花苜蓿属于豆科苜蓿，为多年生草本植物，素有“牧草之王”的美称，含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，氨基酸种类齐全且比例平衡，是动物喜食的优质牧草。影响苜蓿营养价值的因素很多。姚玉霞等[3]对宁夏9个不同地区的陇东紫花苜蓿营养成分进行了综合评价，结果显示，不同产地的苜蓿在养分含量上存在差异，产地应成为选择苜蓿产品的主要依据之一。田雨佳[4]对不同刈割茬次苜蓿的营养价值进行比较发现，在年刈割3茬地区，第3茬苜蓿的中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)含量较低，粗蛋白质(crude protein,CP)含量较高，营养价值最高；第2茬则相反，第1茬居中。
苜蓿是反刍动物的优质粗饲料之一，了解其在体内的消化吸收状况对于提高其降解利用率至关重要。反刍动物饲料营养价值的评定方法主要有体内法(in vivo)、半体内法(in situ)和体外法(in vitro)。目前应用最为广泛的为体外法，即体外产气法或体外发酵法。体外发酵法是采用瘤胃液对饲料进行体外厌氧培养，以达到近似于瘤胃内发酵环境来研究饲料的瘤胃降解情况的技术。Menke等[5]建立并发展了评定饲料营养价值的体外发酵法，研究发现产气量与饲料在瘤胃中的消失率呈显著正相关。此方法不受试验动物的限制，且在不破坏样品的前提下，直观地比较出同类饲料的营养价值高低，是一种高效的评定方法。本试验以来自宁夏、甘肃、新疆及江苏地区的第1茬、第2茬及第3茬刈割的苜蓿作为研究对象，以产气量、营养物质消失率和瘤胃发酵特性参数为评定指标，比较研究不同产地、不同茬次苜蓿的瘤胃消失率，旨在为其在奶牛生产中的科学应用提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源与来源地特征本试验采集了宁夏固原、甘肃兰州、新疆呼图壁和江苏扬州4个地区的第1茬、第2茬及第3茬共12个紫花苜蓿样品。各地区的地理气候特征如下。
宁夏固原：位于宁夏南部山区，东经105°09′~106°58′，北纬34°14′~37°04′，海拔1 248~2 955 m，年平均气温6.8~8.8 ℃，年平均降水量327.7~612.7 mm。属南部温带半温湿区至温带半干旱区气候，春季气温较低，夏季较为凉爽，秋季温差较大，冬季时间长而且寒冷。该地区苜蓿年刈割3茬，初花期刈割，刈割时间分别为5月下旬、8月上旬及9月下旬。
甘肃兰州：地处甘肃省中部，我国版图的几何中心，东经102°35′~104°34′，北纬35°34′~37°07′，平均海拔1 500 m，年平均气温9.1 ℃，年平均降水量250~350 mm，并且集中分布在6—9月份。兰州南北群山环抱，东西黄河穿流而过，具有盆地城市的特征，属温带大陆性气候。该地区苜蓿年刈割3茬，初花期刈割，刈割时间分别为6月中旬、8月上旬及10月上旬。
新疆呼图壁：位于新疆中北部，天山北麓中段，准噶尔盆地南缘，东经86°05′~87°08′，北纬43°07′~45°20′。境内海拔高度相差较大，南北地区的气候有明显差异。该苜蓿种植地为冲积平原，属中温带大陆性气候，海拔460~700 m，温度由北向南逐渐降低，年均气温为2.9~7.1 ℃，年平均降水量110~400 mm，冬长夏短，冬寒夏热，昼夜温差大。该地区苜蓿年刈割3茬，初花期刈割，刈割时间分别为6月上旬、7月中旬及9月上旬。
江苏扬州：位于江苏中部，东经119°01′~119°54′，北纬32°15′~33°25′。地处江淮平原南端，受季风环流影响明显，属于亚热带湿润气候区，年平均气温15.6~16.1 ℃，年平均降水量1 020 mm，冬冷夏热，气温偏高，夏季降水偏多，光照春季明显偏多，其余季节偏少。该地区苜蓿年刈割3茬，初花期刈割，刈割时间分别为5月中旬、6月下旬及8月上旬。
选择清洁、无污染及无霉变的样品于65 ℃烘干，用植物粉碎机粉碎过1 mm筛，保存备用。以每个样品3个重复测定试验苜蓿样品营养水平(表1)。
 | 表1 试验苜蓿样品营养水平(风干基础)Table 1 Nutrient levels of experimental alfalfa samples (air-dry basis) |
瘤胃液采自南京农业大学江浦农场3头泌乳后期、体重为(500±25) kg装有永久性瘤胃瘘管的健康成年荷斯坦奶牛，栓饲。每天07:00和17:00饲喂干物质9 kg(青贮玉米秸秆 ∶ 苜蓿 ∶ 羊草 ∶ 精料=20 ∶ 20 ∶ 30 ∶ 30；精料主要由玉米、麦麸、豆粕组成；先粗后精)，自由饮水。早饲前采集瘤胃液，每头各采200 mL，混匀，并保存于充满二氧化碳(CO2)的39 ℃热水瓶内，迅速带回实验室，整个过程严格厌氧。
培养液配制：参照Theodorou等[6]的方法。需要预先配制A、B、C、D和E 5种溶液。溶液A：微量元素溶液，100 mL，含二水合氯化钙13.2 g、四水合氯化锰10.0 g、六水合氯化钴1.0 g、六水合氯化铁8.0 g；溶液B：缓冲液，1 000 mL，含碳酸氢铵4.0 g、碳酸氢钠35.0 g；溶液C：常量元素溶液，1 000 mL，含磷酸氢二钠5.7 g、磷酸二氢钾6.2 g、七水合硫酸镁0.6 g；溶液D：1 mL，0.1 %刃天青溶液(m/V)，厌氧指示剂，有氧时呈红色，厌氧时呈无色；溶液E：还原剂溶液，100 mL，含L-半胱氨酸盐酸盐(L-cysteine·HCl)0.625 g、氢氧化钠160 mg、九水合硫化钠0.625 g。
操作步骤：在558.9 mL蒸馏水中加入0.1 mL溶液A、200 mL溶液B、200 mL溶液C及1 mL溶液D，通CO2饱和后放置于39 ℃恒温水浴箱中5~6 h，加入40 mL溶液E，混匀后通CO2至饱和并加热至39 ℃，继续通CO2 0.5~1 h。然后与经4层纱布过滤的瘤胃液在厌氧条件下充分混匀 (V/V=10 ∶ 90)，pH调至6.70，厌氧分装100 mL/瓶(含1 g发酵底物)，39 ℃静置培养96 h。
1.1.3 试验仪器GC-14B型气相色谱仪(日本岛津)、pH-HJ90B酸度计等。
1.2 测定指标与测定方法 1.2.1 常规营养成分分析按美国公职分析化学师协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)[7]的方法测定试验样品中干物质(dry matter,DM)、有机物(organic matter,OM)、粗蛋白质(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)和粗灰分(ash)含量，采用Van Soest等[8]的方法测定中性洗涤纤维(NDF)及酸性洗涤纤维(ADF)含量。计算底物干物质消失率(disappearance rate of DM,DMD)、有机物消失率(disappearance rate of OM，OMD)、中性洗涤纤维消失率(disappearance rate of NDF,NDFD)和酸性洗涤纤维消失率(disappearance rate of ADF,ADFD)。
1.2.2 发酵指标测定发酵过程中测定动态产气量，于24、48、72和96 h时结束发酵并测定培养液pH、挥发性脂肪酸(VFA)、氨态氮(NH3-N)及菌体蛋白(microbial protein,MCP)浓度，每个时间点4个重复。
参照Theodorou等[6]的方法测定产气量，分别在2、4、8、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96 h使用Reading Pressure Technique(RPT)装置记录发酵系统的产气量及压力，并根据产气量和压力值求算相关系数，对产气量进行校正。
参照秦为琳[9]的气相色谱法测定VFA浓度，取培养液样品1 mL加0.2 mL 25%偏磷酸(100 mL溶液含内标物巴豆酸0.646 4 g)1 mL，-20 ℃冰箱保存。测定前解冻，12 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL测定。气相色谱条件为柱温110 ℃，进样器温度为180 ℃，检测器温度为180 ℃。
参照Weathburn[10]的方法测定NH3-N浓度，将培养液与0.2 mol/L盐酸等体积混合，于-20 ℃保存。测定前解冻，于4 ℃条件下，10 000 r/min离心10 min，取上清液采用比色法进行测定分析。
采用考马斯亮蓝比色法测定MCP浓度，-20 ℃冻存的培养液样品室温下解冻，取3 mL样品1 000 r/min离心8 min，除去原虫和饲料残渣。2 mL上清液15 000 r/min离心30 min。100 μL上清液加入到5 mL考马斯亮蓝溶液中，在595 nm波长下读取吸光度值。以结晶牛血清白蛋白为标准品，制作标准曲线。
培养液(50 mL离心管)于10 000 r/min离心5 min，弃上清液，将沉淀转移到相应标记的坩埚中，在105 ℃烘箱中烘12 h后称重并灰化，计算DMD、OMD。之后采用Van Soest等[8]的方法配制中性洗涤剂和酸性洗涤剂分别测定发酵前后苜蓿的NDF、ADF，计算NDFD、ADFD。
某营养物质消失率(%)=100×(放入发酵瓶底物该营养物质的量-发酵残渣该营养物质的量)/放入发酵瓶底物该营养物质的量。
1.3 数据分析数据经Excel 2007初步整理后用SPSS 17.0进行多因素方差分析，用Duncan氏法多重比较显著性。试验结果以平均值±标准误(mean±SEM)表示，当P<0.05时认为差异显著。
2 结 果 2.1 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵产气量由表2可知，随发酵时间延长，苜蓿产气量呈逐渐上升趋势，前48 h发酵较为迅速，48 h以后基本趋于稳定。产地对苜蓿体外发酵各时间点产气量影响显著(P<0.05)。各时间点均为新疆最高，发酵前48 h宁夏最低，发酵后48 h甘肃最低，江苏居中。茬次对苜蓿体外发酵各时间点产气量影响显著(P<0.05)。第3茬苜蓿最高，其次为第1茬，第2茬最低。产地和茬次对苜蓿体外发酵各时间点产气量有显著的交互作用(P<0.05)。96 h产气量新疆第3茬和甘肃第3茬较高，分别为218.43和203.45 mL，甘肃第2茬和江苏第2茬较低，分别为156.72和169.75 mL。
| 表2 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵产气量Table 2 Gas production of different origins and stubbles of alfalfa during in vitro fermentation |
由表3可知，DMD、OMD、NDFD和ADFD均随发酵时间延长逐渐升高，其中24~48 h底物降解最快。产地对苜蓿体外发酵各时间点DMD、OMD和NDFD以及24~48 h ADFD影响显著(P<0.05)。96 h时，宁夏苜蓿DMD最高，显著高于其他地区(P<0.05)，甘肃和新疆差异不显著(P>0.05)，但显著高于最低的江苏(P<0.05)；宁夏、甘肃及新疆苜蓿OMD差异不显著(P>0.05)，但显著高于江苏(P<0.05)；宁夏苜蓿NDFD显著高于其他产地(P<0.05)；甘肃苜蓿ADFD最高，江苏最低，新疆和宁夏居中。茬次对苜蓿体外发酵各时间点DMD、OMD、NDFD和ADFD影响显著(P<0.05)。第3茬苜蓿的DMD、OMD、NDFD和ADFD均最高，第2茬最低，第1茬居中。产地和茬次对苜蓿体外发酵各时间点营养物质消失率有显著的交互作用(P<0.05)。96 h各营养物质消失率均为宁夏第3茬和新疆第3茬较高，江苏第2茬和甘肃第2茬较低。
| 表3 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵营养物质消失率Table 3 Nutrient disappearance rates of different origins and stubbles of alfalfa during in vitro fermentation |
由表4可知，随发酵时间延长培养液pH不断降低，介于6.29~6.69。产地对苜蓿24~48 h体外发酵培养液pH影响显著(P<0.05)，宁夏苜蓿显著高于新疆和江苏(P<0.05)，甘肃居中。茬次对苜蓿体外发酵各时间点培养液pH影响显著(P<0.05)。第2茬最高，其次为第1茬，第3茬最低。产地和茬次对苜蓿体外发酵24和96 h培养液pH有显著的交互作用(P<0.05)。96 h时，甘肃第2茬和江苏第2茬较高，分别为6.38和6.37，新疆第3茬和甘肃第1茬较低，均为6.29。
| 表4 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵培养液pHTable 4 Culture medium pH of different origins and stubbles of alfalfa during in vitro fermentation |
由表5可知，随发酵时间延长，苜蓿体外发酵培养液各VFA浓度逐渐升高，积累主要在前48 h，48~96 h培养液VFA浓度缓慢上升。产地对苜蓿体外发酵培养液乙酸(24 h)、丙酸(24~96 h)、丁酸(48~96 h)、总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度(24~48 h)影响显著(P<0.05)。96 h时，乙酸浓度宁夏苜蓿显著高于甘肃(P<0.05)；丙酸浓度新疆苜蓿显著高于江苏(P<0.05)；丁酸浓度甘肃苜蓿最低，显著低于其他产地(P<0.05)；TVFA浓度各产地差异不显著(P>0.05)。茬次对苜蓿体外发酵各时间点培养液VFA浓度影响显著(P<0.05)。乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度均为第3茬和第1茬显著高于第2茬(P<0.05)。产地和茬次对苜蓿体外发酵培养液乙酸(48和96 h)、丙酸(24~96 h)、丁酸(48~96 h)、TVFA浓度(24~48 h)有显著的交互作用(P<0.05)。96 h时，乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度均为新疆第3茬最高，甘肃第2茬最低。
| 表5 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵培养液VFA浓度Table 5 Culture medium VFA concentrations of different origins and stubbles of alfalfa during in vitro fermentation |
由表6可知，随发酵时间的延长，培养液NH3-N浓度宁夏第1、2茬，新疆第1、2茬和甘肃苜蓿呈现先降低后升高的变化趋势，而宁夏第3茬和江苏苜蓿呈现升高—降低—升高的变化趋势，新疆第3茬呈现先升高后降低的变化趋势；各组培养液的NH3-N浓度介于8.14~24.01 mg/dL。产地对苜蓿体外发酵各时间点培养液NH3-N浓度影响显著(P<0.05)。96 h时，宁夏苜蓿显著高于其他产地(P<0.05)。茬次对苜蓿体外发酵各时间点培养液NH3-N浓度影响显著(P<0.05)。96 h时，第3茬最高，显著高于第1茬和第2茬(P<0.05)。产地和茬次对苜蓿体外发酵各时间点培养液NH3-N浓度有显著的交互作用(P<0.05)。宁夏第3茬和新疆第3茬较高，江苏第2茬和新疆第1茬较低。
随发酵时间的延长，培养液MCP浓度宁夏第1茬，甘肃第2茬，新疆第2、3茬和江苏第1茬呈现升高—降低—升高的变化趋势，而宁夏第3茬，甘肃第1、3茬，新疆第1茬和江苏第2、3茬呈现先升高后降低的变化趋势，除宁夏第1茬外其他产地苜蓿培养液MCP浓度均在48 h达到最高，介于0.10~0.26 mg/mL。产地对苜蓿体外发酵各时间点培养液MCP浓度影响显著(P<0.05)。96 h时，江苏和新疆苜蓿著高于宁夏(P<0.05)。茬次对苜蓿体外发酵24和72 h培养液MCP浓度影响显著(P<0.05)。产地和茬次对苜蓿体外发酵24、72和96 h培养液MCP浓度有显著的交互作用(P<0.05)。96 h时，江苏第2茬苜蓿最高，宁夏第2茬和新疆第1茬较低。
| 表6 不同产地、不同茬次苜蓿的体外发酵培养液NH3-N和MCP浓度Table 6 Culture medium NH3-N and MCP concentrations of different origins and stubbles of alfalfa during in vitro fermentation |
3 讨 论 3.1 产地对苜蓿体外发酵特性的影响
本研究发现，不同产地苜蓿的体外发酵特性具有一定差异，其中新疆苜蓿产气量以及培养液VFA浓度最高，宁夏苜蓿的培养液NH3-N浓度和营养物质消失率最高，江苏苜蓿的培养液MCP浓度最高。艾丽霞等[11]研究表明，粗纤维(CF)含量较低，CP和无氮浸出物含量较高的底物体外发酵产气量较高，并且牧草的发酵产气量主要受可溶性非结构性碳水化合物与CP比例的影响，当比例越大时，理论最大产气量越高[12]。苜蓿的CP含量较一般禾本科牧草高，且CF含量低[13]，因此发酵产气多。由试验苜蓿营养水平(表1)可以看出，新疆苜蓿DM含量较高，NDF含量较低，且CP含量适中，因此新疆苜蓿的体外发酵产气量最高。宁夏和扬州苜蓿CP含量较高，瘤胃微生物降解时能够产生更多的NH3-N，促进MCP的合成。而不同产地苜蓿营养水平的差异则是由气候、地理等条件决定，宁夏固原属于高原半干旱大陆性气候，甘肃兰州属于温带大陆性气候，这2个地区的年平均降雨量都偏少，而苜蓿的耗水强度远较禾本科作物大[14]，这是影响苜蓿生长的关键因素；新疆属于中温带大陆性气候，昼夜温差大，有利于营养物质的积累；而江苏扬州属于亚热带湿润气候，夏季较热，梅雨季节降水偏多，植物难以越夏，因此苜蓿综合营养指标偏低。
3.2 茬次对苜蓿体外发酵特性的影响不同茬次苜蓿体外发酵特性的差异主要由四季气候的变化引起，第1茬苜蓿生长期处于春季，由于雨量充沛，昼夜温差大，积温较多，生长时间较长等因素，对喜温暖半干旱气候的苜蓿生长最为有利，因此第1茬苜蓿品质较佳(表1，与文献[15]一致)，产气量及营养物质消失率等较高[16]。第2茬苜蓿的生长期处于夏季，在高温干燥的热应激条件下，苜蓿生长发育受到影响，因此这段时间生长的苜蓿营养价值较低[4]。第3茬苜蓿由于生长周期较短，且水分充足，光照时间长，因此CF含量较低，CP含量较高，营养物质消失率最高，这与杜书增等[16]和胡守林等[17]的研究结果相反，他们在比较不同刈割茬次苜蓿的营养价值时发现，第1茬和第2茬苜蓿的CP含量高于第3茬，而CF含量则相反，这可能是由于苜蓿具体刈割时间以及收获期的不同造成的，有待于进一步研究。
3.3 不同处理差异的原因本试验采用体外批次培养，无底物外流、VFA吸收及唾液缓冲作用，从而导致发酵产物大量累积[18]及pH不断下降[19]，但都在正常变动范围内[20]。瘤胃液中NH3-N是蛋白质降解和微生物合成MCP的中间产物，瘤胃微生物生长所需的最佳NH3-N浓度为5~28 mg/dL[21]，本试验中NH3-N浓度在最佳变动范围内。体外培养初期苜蓿中蛋白质开始降解，NH3-N浓度快速上升，MCP合成也相应增加，二者同时在48 h时达到最高，随着发酵时间延长，由于底物的消耗以及pH下降影响了微生物生长，因此发酵后期NH3-N和MCP浓度有所降低。而培养液中NH3-N浓度在发酵后期呈现先下降后升高的趋势，可能是由于发酵后期大量微生物死亡，细菌溶菌、纤毛虫自溶等释放出氨的缘故[22]。Bonsi等[23]研究发现，产气量与DMD之间存在正相关关系。我们的统计结果也显示，苜蓿96 h产气量与其对应的DMD和培养液VFA浓度呈正相关，相关系数分别为0.708和0.807；与培养液pH呈负相关，相关系数为0.621。
4 结 论① 产地、茬次及其交互作用对苜蓿体外发酵产气量、营养物质消失率以及挥发性脂肪酸、氨态氮和菌体蛋白浓度等有显著影响。
② 发酵结束后，新疆苜蓿产气量和培养液VFA浓度最高，宁夏苜蓿营养物质消失率、培养液NH3-N浓度最高。
③ 第3茬苜蓿的产气量、营养物质消失率及培养液VFA、NH3-N及MCP浓度均为最高，第2茬产气量、营养物质消失率、培养液VFA浓度最低，第1茬培养液NH3-N及MCP浓度最低。
④ 新疆第3茬和甘肃第3茬苜蓿营养价值较高，甘肃第2茬和江苏第2茬苜蓿营养价值较低。
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