乳蛋白是乳中的重要营养成分，主要含有乳清蛋白(whey protein,WP)和酪蛋白(casein,CN)2类。其中乳清蛋白的含量占到乳蛋白的18%~20%；而酪蛋白的含量占到乳蛋白的78%~85%。它们不仅含有机体所需的必需氨基酸(EAA)，而且还具有特定的生理活性，对机体代谢起着十分重要的调节作用^[1]。随着人们对膳食营养的重视，乳品中的高蛋白质、低脂肪已经成为衡量乳品质的重要指标^[2]。研究者预想通过提高饲粮中蛋白质的转移率和合成乳蛋白时可吸收氨基酸(AA)的比例来提高乳蛋白的产量，进而提升牛奶的营养价值^{[3, 4]}。但是由于实际的饲养生产中，没能准确地掌握氨基酸在乳腺中调控乳蛋白合成的过程^[5]，只是通过饲喂不同成分的高蛋白质饲料提高乳蛋白产量^{[6, 7]}。有研究表明，一般只有25%的食入氮(N)可转化成乳蛋白，而剩余的75%都随粪尿排放而损失。可见，食入N转化为乳蛋白的效率十分低^[8]。这样盲目的饲喂不仅达不到预期的效果反而会导致蛋白质饲料资源的浪费^{[6, 7]}。然而要解决食入N转化率低的问题，近年来研究较多的解决途径是通过激素或营养物质激活翻译起始因子的磷酸化来调节乳腺内蛋白质的合成率^{[9, 10]}。作为营养物质的必需氨基酸，它们除了作为蛋白质合成的底物外，也可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路来调节mRNA翻译过程^[11]，影响乳蛋白的合成。

mTOR是一种在结构和功能上较为保守的丝氨酸/苏氨酸磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase,PIKK)^[12]。基因的转录、蛋白质的翻译及核糖体的合成这些生物过程的启动都是通过多种细胞外信号(营养、能量及生长因子)作用于mTOR激活的^[13]。其中，mTOR信号蛋白存在2种不同的复合物形式：对雷帕霉素敏感的mTOR复合物1(mTOR complex 1,mTORC1)和对雷帕霉素不敏感的mTOR复合物2(mTOR complex 2,mTORC2)。其中，mTORC1包括mTOR、mTOR调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,Raptor)、mLST8(mammalian ortholog of LST8,又称GβL)和富含脯氨酸的Akt底物40(proline-rich Akt substrate of 40 kDa,PRAS40)。作为抑制剂的雷帕霉素与mTORC1的末端结合，抑制mTOR的活性，导致真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein，4EBP1)和核糖体S6蛋白激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K1)的磷酸化作用的改变，进而影响mTOR信号通路对蛋白质翻译作用的改变^{[14, 15]}。

mTOR信号通路包括2条上游调控途径和2条下游调控途径。mTOR通过调控2条上游信号通路[磷脂酰肌醇3激酶(PI3K/Akt/mTOR)信号途径和腺苷酸活化蛋白激酶(LKB1/AMPK/mTOR)信号途径^{[16, 17]}中因子的磷酸化作用产生应答效应，调节2条不同的下游通路，包括真核翻译起始因子4EBP1和S6K1通路，从而分别控制特定亚组的mRNA的翻译^[18]。

mTOR信号通路中的2条上游调控途径为：PI3K/Akt/mTOR信号通路和LKB1/AMPK/mTOR信号通路。PI3K/Akt/mTOR信号通路可以调控细胞的生长及增殖^[16]。而LKB1/AMPK/mTOR信号通路，以AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)为能量感受器，调节机体代谢和能量的平衡^[17]。在哺乳动物细胞中，生长因子、氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)是调控mTOR活性的上游信号。生长因子是通过PI3K/Akt/mTOR通路实现mTOR信号转导的调控^[16]。

mTOR调节下游分子真核细胞起始因子4EBP1和S6K1激活下游信号的转导^[19]。4EBP1和S6K1是蛋白翻译的关键调节因子。4EBP1与真核细胞翻译启动因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)结合，从而抑制蛋白质翻译。mTOR的激活会抑制4EBP1发生磷酸化，导致eIF4E释放4EBP1，从而降低了4EBP1对eIF4E起始翻译的抑制作用，使eIF4E的表达增高，从而促进与细胞生长相关的关键蛋白质的翻译^[20]。mTOR的另外一个靶点S6K1，它使核糖体S6蛋白磷酸化，增强含嘧啶基因mRNA的翻译功能，调节蛋白质的合成^[21]。

乳腺从血液中获得的必需氨基酸，在乳蛋白合成过程中，不仅可以作为合成底物有效的被利用，还可以作为信号蛋白激活信号通路来调控乳蛋白的合成^[22]。因此深入研究乳腺对必需氨基酸的利用以及必需氨基酸对乳蛋白合成过程的调控作用机制显得尤为必要。

通过利用乳腺上皮细胞研究mTOR下游信号通路调控乳蛋白合成加速了泌乳细胞信号转导与分子机制研究的进程。必需氨基酸主要是集中在mRNA的转录和翻译水平影响乳蛋白的合成。mRNA的翻译效率和乳腺从血液中摄取必需氨基酸的量与蛋白质合成率有关^[23]，必需氨基酸摄取量又与翻译效率存在着正相关关系。因此，必需氨基酸的调节作用对乳蛋白合成至关重要。已经明确的是，在乳蛋白合成过程中，必需氨基酸激活mTOR上游的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)，影响mTORC1的活性，进而影响下游因子4EBP1和S6K1的磷酸化状态^{[9, 10, 16, 24, 25, 26, 27, 28, 29]}。当S6K1发生磷酸化时，激活核糖体S6蛋白，进而促进mRNA的翻译^{[13, 30]}。当4EBP1发生磷酸化，释放eIF4E，启动mRNA翻译的起始^{[31, 32, 33]}。

目前，国内外利用奶牛乳腺上皮细胞为探讨必需氨基酸调控乳蛋白合成的机理性文章较少。近年来，Burgos等^[34]在体外培养的奶牛乳腺上皮组织中的研究表明，适量的添加氨基酸混合物可以有效提高乳蛋白的合成量。Jobgen等^[35]、Moshel等^[36]和徐柏林等^[37]在奶牛乳腺上皮细胞和小鼠CID9细胞上展开研究，提出一个比较新的观点：必需氨基酸不仅可以作为合成乳蛋白的底物，还可以作为信号分子调控乳蛋白的合成。根据必需氨基酸对信号蛋白磷酸化的影响，我们可以将必需氨基酸分为3大类：1)支链氨基酸(BCAA，即：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，它们刺激信号蛋白的磷酸化作用；2)赖氨酸、组氨酸和苏氨酸它们抑制信号蛋白的磷酸化作用；3)苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸对信号蛋白的磷酸化作用不显著^[15]。精氨酸是奶牛特有的必需氨基酸，它能够激活细胞内mTOR信号通路，从而促进乳蛋白基因的表达。当精氨酸(Arg)的添加浓度为556 mg/L时，mTOR和S6K1基因的表达均上调，而4EBP1基因的表达显著下调^{[37, 38]}。

在所有氨基酸中，对mTOR信号通路有显著正调节作用是支链氨基酸。并且支链氨基酸对蛋白质的合成最主要的调控作用发生在mRNA翻译的起始阶段。而在支链氨基酸中，亮氨酸和异亮氨酸通过mTOR信号通路促进乳蛋白的合成作用最为显著^[39]。在小鼠和奶牛乳腺上皮中，亮氨酸对κ酪蛋白的合成有促进作用，是通过mTOR信号通路及其下游4EBP1和S6K1的磷酸化直接调控乳蛋白的合成^[36]，而添加mTOR上游通路的抑制剂(LY294002)则显著降低了S6K1的磷酸化作用^{[40, 41]}，进而减少了乳蛋白合成量。在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞体系(MAC-T)中，单独添加亮氨酸和异亮氨酸时，mTOR磷酸化比率分别提高了64%和106%^[22]；去除亮氨酸和异亮氨酸时，蛋白质翻译因子的磷酸化程度降低，蛋白质合成量减少。而在乳腺组织切片(MTS)中，mTOR、4EBP1和eIF4E的磷酸化降低程度虽然没有在乳腺上皮细胞中明显，但是也会减少蛋白质的合成量^[22]。

乳蛋白合成时主要限制性氨基酸为赖氨酸和蛋氨酸^[44]。其中，乳蛋白合成的第一限制性氨基酸是蛋氨酸^{[42, 43]}。大量关于乳腺利用氨基酸的体内试验表明，向奶牛饲粮中添加过瘤胃蛋氨酸和赖氨酸，可以有效提高奶牛的乳产量和乳蛋白产量^{[44, 45, 46, 47]}。在体外培养乳腺上皮细胞时添加赖氨酸，mTOR信号通路中与乳蛋白翻译相关的基因mTOR和S6K1表达均上调，并且mTOR差异极显著，但4EBP1表达下调^[48]。当在体外培养乳腺上皮细胞培养添加蛋氨酸时，mTOR信号通路中与乳蛋白翻译相关的基因mTOR和S6K1表达均上调但差异不显著，但真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,eIF4E-BP1)表达下调且差异极显著。赖氨酸和蛋氨酸添加后eIF4E-BP1表达下调，这与这2种氨基酸在乳蛋白翻译中所起的负调控的作用相符^[38]。已知，当添加蛋氨酸能够显著提高酪蛋白基因的表达量，说明蛋氨酸能够调节靶基因的表达^{[44, 49]}。然而当蛋氨酸的浓度是57 μg/mL时，蛋白αs1-酪蛋白mRNA表达水平达最高^[50]。赖氨酸的加入不仅会影响信号蛋白磷酸化的水平，还会影响酪蛋白的合成。总体来说，当乳腺细胞培养体系中赖氨酸浓度处于适宜水平(197 μg/mL)时，αs1-酪蛋白mRNA表达水平增高；反之，当浓度达到220 μg/mL则会抑制αs1-酪蛋白mRNA基因表达^[1]。苏氨酸和苯丙氨酸对酪蛋白的影响与蛋氨酸和赖氨酸的大致相同，乳腺细胞培养体系中苏氨酸(121 μg/mL)和苯丙氨酸(126 μg/mL)浓度处于适宜水平时，αs1-酪蛋白mRNA表达水平增高；反之,会抑制αs1-酪蛋白mRNA基因表达^[1]。

但并非所有的必需氨基酸都是正调控于mTOR的信号通路和乳蛋白合成，一些非支链氨基酸就是负调节于乳蛋白合成。虽然在目前所掌握的文献中，极少有报道必需氨基酸对mTOR信号通路是负调节作用，但并不能排除。在乳腺细胞培养中添加组氨酸相对于添加蛋氨酸而言，乳腺合成乳蛋白的量会减少^[50]。Prizant等^[15]研究发现，组氨酸和苏氨酸不仅减少了mTOR和S6K1的磷酸化，而且还降低了蛋白质的合成率(65%)。目前对组氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸这4种氨基酸对乳蛋白的合成及乳产量的影响的研究比较少。另外，还有研究发现虽然提高了个别氨基酸的添加量，但是氨基酸配比不平衡也会严重影响乳蛋白的合成^[38]。只有在最佳配比模式下转录和翻译水平调控乳蛋白合成才是最有效的^{[48, 51]}。

乳蛋白合成信号通路及其关键信号分子的研究已经成为泌乳生物学研究的重点，这将有利于完善乳腺发育与泌乳机制，提高乳的产量和质量。目前的研究结果表明，利用反刍动物乳腺组织研究必需氨基酸通过mTOR信号通路影响乳蛋白合成的机理已经有了较成熟的报道，但是仍有很多问题有待解决。例如，哪些必需氨基酸通过mTOR信号对于酪蛋白的合成是正调控；哪些必需氨基酸是负调控？影响了哪些下游信号，如何影响，改变的信号分子对于乳蛋白合成会起什么样的作用？只有系统全面的掌握必需氨基酸对乳蛋白合成作用机制时，才可以解决研究时所遇到的瓶颈问题,保证研究后所提供理论的真实性。