吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种新型氧化还原酶的辅酶，于20世纪70年代末在甲基营养菌被发现。PQQ广泛存在于动植物体内，但动物自身不能合成，肠道微生物合成和外源摄入是动物组织中PQQ的主要来源，外源PQQ对维持动物机体正常生理功能至关重要。被动物摄入后，PQQ在小肠被吸收，经肾脏排出。研究表明，PQQ具有抗氧化应激[1]、防治肝损伤[2]、调节脂质代谢[3]等功能。日本科学家曾建议将PQQ定义为新型B族维生素，目前将PQQ划归为类维生素。PQQ二钠(PQQ·Na2)已成为美国、加拿大等国家官方承认的膳食组成成分或保健食品。
关于PQQ在畜牧业方面的研究较少。本课题组前期研究表明，将PQQ水溶液均匀喷洒于饲料后饲喂，能增强蛋鸡的抗氧化能力，提高产蛋率(laying rate,LR)并改善蛋品质[4]。维生素E是饲料行业广泛使用的抗氧化剂，在改善动物机体抗氧化状态的同时，尚具有调节脂质代谢，降低鹌鹑蛋胆固醇含量的作用[5]。PQQ·Na2作为PQQ的商品形式，可作为添加剂直接添加到动物饲粮中，不需要将PQQ溶于水后再与动物饲粮混合的过程，减小了工作量。关于PQQ·Na2对产蛋鸡脂质代谢和鸡蛋胆固醇含量的影响尚未见报道。因此，本试验旨在研究将PQQ·Na2直接添加到产蛋鸡饲料中，对产蛋鸡生产性能、脂质代谢和抗氧化能力的影响，探究PQQ·Na2降低鸡蛋胆固醇的可能性，并以维生素E为对照，为PQQ·Na2作为新型饲料添加剂提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料
PQQ·Na2由化学合成，纯度99.9%，为便于均匀混在饲料中，首先用玉米淀粉稀释PQQ·Na2为0.1%的预混剂。PQQ·Na2由上海医学生命科学研究中心有限公司馈赠。 1.2 试验设计及饲粮
试验采用单因子试验设计，选取360只产蛋率和体重相近的23周龄京红1号产蛋鸡，随机分为5组，为1个对照组和4个试验组，每组6个重复，每个重复12只鸡。试验分预试期1周和正试期8周2个阶段。预试期各组均饲喂基础饲粮；正试期，对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮基础上添加0.08、0.80、1.60 mg/kg PQQ·Na2和100 mg/kg维生素E的饲粮。
基础饲粮参照NRC(2004)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)，结合京红1号产蛋鸡饲养手册配制。试验采用玉米-豆粕型粉状饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
半开放式鸡舍3层立体笼养，自然光照加人工补光，光照时间16 h/d、强度20 lx，相对湿度50%~90%，纵向负压通风。每天喂料、捡蛋、清粪各2次，每周消毒2次，自由采食和饮水。常规防疫和管理。 1.4 指标测定和方法 1.4.1 生产性能
正试期，每天以重复为单位记录产蛋数和蛋重，计算产蛋率和平均蛋重(average egg weight,AEW)。每2周称剩料，以重复为单位计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料蛋比(the ratio of feed to egg,F/E)。 1.4.2 蛋品质
正试期第28、42和56天，每个重复随机选取接近平均蛋重的鸡蛋3枚，测定蛋品质。蛋壳强度(eggshell strength,ES)、蛋白高度(albumen height,AH)、哈氏单位(Haugh unit,HU)和蛋黄颜色(yolk color,YC)采用以色列ORKA公司生产的系列鸡蛋品质测定仪测定；蛋形指数(egg shape index,ESI)采用日本富士坪公司生产的蛋形指数测定仪测定。 1.4.3 脂质代谢
试验结束，每重复随机选取体重相近的产蛋鸡1只，翅静脉采血，肝素钠抗凝，3 600 r/min离心10 min，制备血浆，-20 ℃保存备用。屠宰鸡只，摘取左侧肝脏，液氮速冻，-80 ℃保存。肝脏粗脂肪提取方法参考Folch等[6]，以氯仿-甲醇(v/v，2 ∶ 1)提取；肝脏总胆固醇(total cholesterol,TC)含量采用市售试剂盒测定。血浆甘油三酯(total triglyceride,TG)、TC、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein,LDL-C)含量采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)酶法测定，试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司。 1.4.4 鸡蛋胆固醇含量
试验结束，每重复随机采集鸡蛋3枚，称重，分离蛋黄并称重。 蛋黄相对重量(%)=(蛋黄重/蛋重)×100。
混匀蛋黄，取样用于胆固醇含量的测定。鸡蛋胆固醇含量以蛋黄胆固醇含量(mg/g)和全蛋胆固醇含量(mg/枚)表示[7]。鸡蛋胆固醇含量采用GPO-PAP酶法测定，测定方法参考江均平等[8]，以乙醇提取蛋黄粗脂肪后，用市售试剂盒测定，试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司。 1.4.5 抗氧化能力
血浆和肝脏的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)均采用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 1.5 数据统计分析
试验数据以“平均值±标准差”表示。数据采用SPSS 19.0 one-way ANOVA程序进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著性判断标准。 2 结果与分析 2.1 PQQ·Na2对蛋鸡生产性能的影响
由表2可知，与对照组相比，试验期1~4周，PQQ·Na2对产蛋率无显著影响(P＞0.05)；7~8周、5~8周和1~8周0.80 mg/kg PQQ·Na2组的产蛋率显著高于对照组(P＜0.05)；100 mg/kg维生素E对产蛋率无显著影响(P＞0.05)。试验期3~4周、5~6周、5~8周和1~8周，0.80 mg/kg PQQ·Na2组产蛋率均显著高于100 mg/kg维生素E组(P＜0.05)。
| 表2 PQQ·Na2对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of PQQ·Na2 on performance of laying hens |
与对照组相比，PQQ·Na2对试验期内各阶段的平均蛋重无显著影响(P＞0.05)；3~4周和5~8周，0.08 mg/kg PQQ·Na2组的平均蛋重显著高于100 mg/kg维生素E组(P＜0.05)。
试验期1~4周，各组平均日采食量没有显著差异(P＞0.05)，3~4周，0.80和1.60 mg/kg PQQ·Na2组平均日采食量显著高于对照组；试验期5~8周和1~8周，各PQQ·Na2组的平均日采食量均显著高于对照组(P＜0.05)，与维生素E组没有显著差异(P＞0.05)。
PQQ·Na2和维生素E对料蛋比无显著影响(P＞0.05)。
2.2 PQQ·Na2对蛋鸡蛋品质的影响
由表3可知，PQQ·Na2和维生素E对蛋形指数、哈氏单位、蛋壳强度和蛋黄颜色无显著影响(P＞0.05)。42 d，0.80 mg/kg PQQ·Na2和维生素E组的蛋白高度显著高于对照组(P＜0.05)，1.60 mg/kg PQQ·Na2组的蛋白高度显著低于维生素E组(P＜0.05)；56 d，1.60 mg/kg PQQ·Na2组的蛋白高度显著高于对照组(P＜0.05)，各PQQ·Na2组的蛋白高度与维生素E组没有显著差异(P>0.05)。
| 表3 PQQ·Na2对蛋鸡蛋品质的影响 Table 3 Effects of PQQ·Na2 on egg quality of laying hens |
与对照组相比，1.60 mg/kg PQQ·Na2和维生素E显著升高血浆TG含量(P＜0.05)；PQQ·Na2显著升高血浆HDL-C含量(P＜0.05)，对LDL-C含量无显著影响(P＞0.05)。与维生素E组相比，0.08和0.80 mg/kg PQQ·Na2组血浆TG含量显著低于维生素E组(P＜0.05)；各PQQ·Na2组血浆HDL-C含量均高于维生素E组，且0.08 mg/kg PQQ·Na2差异显著(P＜0.05)，PQQ·Na2对血浆LDL-C含量的影响与维生素E没有差异(P＞0.05)。PQQ·Na2不影响蛋黄相对重量和蛋黄胆固醇含量(P＞0.05)。与对照组相比，0.80 mg/kg PQQ·Na2可显著升高肝脏TC含量(P＜0.05)、显著降低11.27%血浆和全蛋TC含量(P＜0.05)，与维生素E组没有显著差异(P＞0.05)。
| 表4 PQQ·Na2对蛋鸡脂质代谢和鸡蛋胆固醇含量的影响 Table 4 Effects of PQQ·Na2 on lipid metabolism and egg cholesterol content of laying hens |
与对照组和维生素E组相比，PQQ·Na2有提高血浆T-SOD活性的趋势(P＞0.05)；0.80 mg/kg PQQ·Na2组血浆MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)，与维生素E组没有显著差异(P＞0.05)，1.60 mg/kg PQQ·Na2组MDA含量与对照组无显著差异(P＞0.05)，但显著高于维生素E组(P＜0.05)。与对照组相比，PQQ·Na2能提高肝脏T-SOD活性和T-AOC，且0.08 mg/kg PQQ·Na2组差异显著(P＜0.05)；各PQQ·Na2组肝脏T-SOD活性与维生素E组均无显著差异(P＞0.05)，T-AOC活性显著低于维生素E组(P＜0.05)；1.60 mg/kg PQQ·Na2组肝脏MDA含量显著高于对照组和维生素E组(P＜0.05)。
| 表5 PQQ·Na2对蛋鸡抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of PQQ·Na2 on antioxidant capacity of laying hens |
本试验表明，饲粮中添加0.80 mg/kg PQQ·Na2能显著提高蛋鸡产蛋率和平均日采食量，对料蛋比无显著影响。产蛋率的提高可能与PQQ改善动物繁殖机能[9]有关，饲喂不含PQQ的纯合饲粮的鼠生长缓慢，存活率较低，雌鼠产仔数降低。PQQ·Na2可能通过改善蛋鸡生殖系统功能，进而提高产蛋率。蛋鸡产蛋率提高的同时，需要从饲粮中摄入更多的营养物质满足生产需要，引起采食量的增加，采食量和产蛋率同时提高，因而料蛋比无显著变化。本试验中，与对照组相比，维生素E对蛋鸡生产性能无显著影响，与前人研究结果[10, 11, 12]相符。0.80 mg/kg PQQ·Na2组产蛋率显著高于维生素E组，表明PQQ·Na2作为蛋鸡饲料添加剂较维生素E具有优越性。本试验结果表明，0.80和1.60 mg/kg PQQ·Na2能分别增加42和56 d蛋白高度，改善鸡蛋品质。 3.2 PQQ·Na2对蛋鸡脂质代谢和鸡蛋胆固醇的影响
维生素E对蛋黄相对重量的影响尚无一致结论。前人研究资料有维生素E可显著增加蛋黄相对重量[11, 13]和不影响蛋黄相对重量[10]的报道。本试验结果显示，100 mg/kg维生素E对蛋黄相对重量无显著影响，与Radwan等[10]结果相符。0.08和0.80 mg/kg PQQ·Na2有增加蛋黄相对重量的趋势。研究发现，250 mg/kg α-生育酚盐可显著降低鹌鹑蛋黄中胆固醇含量[5]，维生素E可显著降低鸡蛋蛋黄胆固醇含量[14]；但也有研究[10, 12]结果没有降低。上述研究均采用蛋黄胆固醇含量(mg/g)表述鸡蛋中胆固醇含量。本文中，当以蛋黄胆固醇含量表示时，维生素E不能降低鸡蛋胆固醇含量，与后2项研究结果相符。但当转换为每枚鸡蛋中的胆固醇含量(全蛋胆固醇)时，与对照组相比，维生素E显著降低了鸡蛋胆固醇含量。0.80 mg/kg PQQ·Na2组出现相同效果，且伴随鸡蛋胆固醇含量的降低，出现血浆胆固醇含量降低和肝脏胆固醇含量升高的现象。
鸡蛋胆固醇的含量与蛋鸡品种、鸡龄、饲粮等因素有关。蛋鸡饲粮胆固醇含量一般较低，体内胆固醇主要经内源合成。肝脏和卵巢是主要合成部位，其中肝脏是最活跃的合成部位，也是血液胆固醇的主要来源。蛋鸡体内的胆固醇主要经鸡蛋排出(2/3)，此外还通过粪便和胆汁酸代谢途径排出。PQQ·Na2影响蛋鸡胆固醇代谢的原因可能有：1)通过HDL-C介导逆胆固醇转运过程。血液中HDL-C被称为“好”胆固醇，能介导逆胆固醇转运过程[15]，将外围组织中胆固醇逆转运至肝脏，经胆汁酸途径排出。本试验中，PQQ·Na2显著升高了血浆HDL-C含量，0.80和1.60 mg/kg PQQ·Na2显著升高了肝脏胆固醇含量，说明PQQ·Na2可能通过增加血液HDL-C含量，促进血液胆固醇逆转运回肝脏，促进胆固醇经胆汁酸途径排出。2)通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)间接调控胆固醇-7-α羟化酶(CYP7A1)的作用。研究表明，PQQ可激活PGC-1α启动子，增加PGC-1α的基因和蛋白质表达[16]，而PGC-1α可激活CYP7A1。CYP7A1是催化胆固醇转化为中性胆汁酸的主要酶，体外培养的HepG2细胞在注射表达PGC-1α的重组体腺病毒后，可直接激活CYP7A1基因的表达；在培养细胞的转染分析中，PGC-1α可激活CYP7A1的启动子[17]。PQQ·Na2可能通过增加PGC-1α的表达，进而促进CPY7A1基因的表达，增加胆固醇转化为胆汁酸排出，从而有利于鸡蛋胆固醇含量的降低。然而，本试验中，不同剂量PQQ·Na2对鸡蛋胆固醇含量的影响呈现不规律性。原因可能是低浓度(0.08 mg/kg)PQQ·Na2对蛋鸡体内胆固醇代谢影响较弱，不能表现明显的降鸡蛋胆固醇作用。对于高浓度(1.60 mg/kg)PQQ·Na2组而言，血浆HDL-C含量升高，介导逆胆固醇转运过程，引起肝脏胆固醇含量升高，同时，高浓度PQQ·Na2可能对CPY7A1基因表达影响较大，加速胆汁酸肠肝循环，使以粪便中游离胆盐形式排出的胆固醇增加。但机体为了维持正常的肠肝循环，弥补胆盐损失，肝脏可能通过合成更多的胆固醇以补充随粪便排泄掉的部分，同时多余的胆固醇进入血液和鸡蛋。因此，高浓度PQQ·Na2升高肝脏胆固醇含量的同时，并没有引起血液和鸡蛋胆固醇含量的降低。不同剂量PQQ·Na2对鸡蛋胆固醇含量产生的影响不同，说明PQQ·Na2对鸡蛋胆固醇含量的影响存在剂量关系。本试验中PQQ·Na2梯度设置较少，关于PQQ·Na2对胆固醇代谢的规律性影响，还有待进一步研究。 3.3 PQQ·Na2对蛋鸡抗氧化能力的影响
PQQ具有较强的抗氧化能力，约能参与2万个氧化还原循环而不发生自身氧化或多聚反应。PQQ能降低缺血/再灌注模型下心肌组织[18]内MDA含量的升高，防止高氧应激引起的啮齿动物认知能力的下降[19]。维生素E是饲料行业广泛使用的抗氧化剂，能缓解蛋鸡机体受到的氧化应激[20]。本试验中，与对照组相比，PQQ·Na2和维生素E不影响血浆T-SOD活性，0.80 mg/kg PQQ·Na2和100 mg/kg 维生素E显著降低了血浆MDA含量；PQQ·Na2和维生素E均能提高肝脏T-SOD活性和T-AOC，显示PQQ·Na2和维生素E均能改善蛋鸡机体抗氧化能力。
本试验中，1.60 mg/kg PQQ·Na2组血浆和肝脏MDA含量均增加，可能与不同条件下PQQ表现出促氧化能力有关[21]。在氧气(O2)存在时，PQQ与还原型辅酶Ⅱ[NAD(P)H]反应，伴随过氧化氢(H2O2)和过氧根离子(O-2)的产生[22]，PQQ的过量摄入可能加速活性氧的产生，增加其毒性。本试验中，MDA含量的增加可能因1.60 mg/kg PQQ·Na2含量较高，活性氧产生较多，增加其攻击脂质的可能，增加脂质过氧化物的产生。此外，血浆MDA含量的略微增加也可能由该组血浆胆固醇含量升高所致。肝脏MDA含量增加说明1.60 mg/kg PQQ·Na2可能对蛋鸡机体造成一定程度的负面影响。但以往文献研究表明PQQ·Na2安全性较好：小鼠口服250～2 000 mg/kg体重的PQQ对其红细胞核没有影响[23]；体外基因毒性试验表明，PQQ不会引起染色体的变化。给大鼠饲喂2 000 mg/kg体重的PQQ·Na2，未见基因毒性[24]。关于PQQ·Na2在产蛋鸡上的安全剂量有待进一步研究。 4 结 论
① 本试验条件下，PQQ·Na2能提高蛋鸡产蛋率，0.80 mg/kg组生产性能优于100 mg/kg维生素E组；PQQ·Na2对鸡蛋品质影响不大，可在一定程度上增加蛋白高度。
② PQQ·Na2可能通过升高蛋鸡血浆HDL-C含量介导逆胆固醇转运，促进胆汁酸途径，有利于降低鸡蛋胆固醇含量。
③ PQQ·Na2可增强蛋鸡机体抗氧化能力，降低蛋鸡血浆MDA含量，升高肝脏T-SOD活性和T-AOC。
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