反刍动物饲粮氮的来源主要包括真蛋白氮和非蛋白氮，其中非蛋白氮包括硝态氮、胺类、氨化物、氨基酸氮和尿素氮等。硝态氮能够在一定程度上替代尿素和真蛋白质饲料，降低饲养成本。国内外研究表明，反刍动物饲粮中可以用硝酸盐(NO^-₃)替代尿素和真蛋白质饲料作为瘤胃氮来源，同时减少甲烷的生成，改变瘤胃发酵模式，提高瘤胃微生物氮合成量^{[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]}。由于反刍动物复杂的瘤胃内环境及体外培养法的条件限制，NO^-₃对动物瘤胃发酵特性的影响仍限于模型模拟，且已有的报道结果并不一致，因此该模型尚不能准确代表NO^-₃对瘤胃液pH、氨态氮(NH₃-N)产量、挥发性脂肪酸(VFA)浓度、微生物蛋白质产量等影响程度的实际数据；此外，动物采食NO^-₃后，其瘤胃液NO^-₃和亚硝酸盐(NO^-₂)浓度随时间的变化趋势仍有待深入研究。为此，本试验旨在通过对湖羊直接饲喂不同水平的硝酸钾(KNO₃)，采集各时间点的瘤胃液，研究NO^-₃浓度的动态变化规律及其对瘤胃发酵参数、血液指标等的影响，探讨NO^-₃对反刍动物瘤胃代谢的影响，为生产实践中合理有效地添加NO^-₃提供一定参考依据。

采用单因子试验设计，选取9头体况良好、体重相近[(35.0±3.0) kg]、安装永久性瘤胃瘘管的湖羊，随机分为3组，每组3头，分别饲喂含0(对照组)、0.5%、1.0%KNO₃的饲粮。适应期30 d，之后为3 d采样期。

试验饲粮组成及营养水平见表1。试验前检测牧草中NO^-₃水平(苜蓿干草0.12%，羊草0.10%)，折算后3组饲粮中总NO^-₃水平分别为0.06%、0.56%和1.06%。每天饲喂2次(08:00和16:00)，自由饮水。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) % 项目 Items 硝酸钾添加水平 KNO3 supplemental level/% 0 0.5 1.0 原料 Ingredients 玉米 Corn 28.03 26.10 25.26 豆粕 Soybean meal 5.01 1.38 食盐 NaCl 0.15 0.15 0.15 石粉 Limestone 0.10 0.14 0.27 磷酸氢钙 CaHPO4 0.51 0.47 0.25 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 2.95 9.01 12.82 棉籽粕 Cottonseed meal 3.00 2.00 预混料 Premix1) 0.25 0.25 0.25 苜蓿干草 Alfalfa hay 18.00 18.00 18.00 羊草 Chinese wildrye 42.00 42.00 42.00 硝酸钾 KNO3 0.50 1.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 10.05 9.91 9.85 粗蛋白质 CP 12.30 12.46 12.37 中性洗涤纤维 NDF 37.67 38.46 38.68 酸性洗涤纤维 ADF 23.55 23.58 23.40 钙 Ca 0.42 0.41 0.45 总磷 TP 0.30 0.30 0.26 赖氨酸 Lys 0.54 0.47 0.43 蛋氨酸 Met 0.21 0.22 0.22 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 40 000 IU，VD3 5 080 IU，VE 50 mg，Fe 80 mg，Cu 37 mg，Zn 125 mg，Mn 138 mg，I 2 mg，Se 1.0 mg，Co 0.7 mg。 2)代谢能及氨基酸含量为计算值，其他均为实测值。ME and amino acids were calculated values,while others were measured values.

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

适应期内为达到最终添加浓度，采用逐级递增的添加方式，每隔5 d升高1个KNO₃的梯度，直至分别保持0.5%、1.0%的添加水平。采样期内分别于晨饲后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h通过真空负压装置，从瘤胃上下左右不同位点采集约30 mL瘤胃液，经4层纱布过滤，立即采用pHS-3C型pH计测定其pH，之后分装于10 mL离心管中，-20 ℃冰箱中保存待测其他指标。采样期每日晨饲后2 h，颈静脉采血，分装，一份加入抗凝剂，待测血液高铁血红蛋白浓度；另一份静止30 min，待析出血清时，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，待测血清生化指标。

1)NH₃-N浓度：采用酚-次氯酸钠比色法^[8]。

2)微生物蛋白质浓度：对Hall等^[9]的方法改进，采用差速离心法，取4 mL瘤胃液放入5 mL的离心管中，离心10 min(500 r/min)，沉淀为原虫，上清液转移到5 mL离心管中；将装有上清液的5 mL离心管再经过15 min离心(12 000 r/min)，沉淀为细菌；然后分别将两者的沉淀加4 mL 10%三氯乙酸(TCA)，混合均匀，置室温30 min，沉淀蛋白质；在沉淀中加入4 mL 5%氢氧化钠(NaOH)溶解；离心10 min(4 000 r/min)，取上清液；以5% NaOH作空白，用756型紫外分光光度计测定280和260 nm处的吸光度。

计算公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀)×稀释倍数。

3)VFA浓度：发酵液经10 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加0.2 mL 20%的偏磷酸(含60 mmol/L巴豆酸)，10 000 r/min再次离心15 min，取上清液1 μL，以巴豆酸为内标物，采用日本岛津GC-14B气相色谱仪测定乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度^[10]。测定条件：毛细管柱CP-WAX(柱长30 m，内径0.53 mm，膜厚1 μm)；载气为高纯N₂(压力0.7 MPa，流量30 mL/min)；燃气为H₂(流量30 mL/min)；气化室温度200 ℃，火焰离子化检测仪(FID)检测器温度200 ℃；柱温采用程序升温法，初温100 ℃，末温130 ℃，升温速率3 ℃/min，灵敏度为10，衰减为25。

4)NO^-₃浓度：紫外分光光度法测定^[11]。

5)NO^-₂浓度：比色法(南京建成生物工程研究所试剂盒)。

6)血液指标：血清生化指标由全自动生化分析仪测定；血液高铁血红蛋白浓度按照Benesch等^[12]的方法进行。

试验数据采用Excel软件整理，采用SPSS 13.0软件的one-way ANOVA进行方差分析，并用Duncan氏法进行差异显著性比较，结果以“平均值±标准差”表示。

湖羊瘤胃液NO^-₃和NO^-₂浓度的动态变化见图1。对照组NO^-₃和NO^-₂始终保持较低浓度。但采食KNO₃后，NO^-₃浓度逐渐升高，至1 h达到最大值，至4 h浓度与对照组组接近。其中，喂后0.5～1 h，1.0%组的浓度均显著高于对照组和0.5%组(P<0.05)；喂后1～2 h，1.0%组的浓度均显著高于对照组组(P<0.05)。但0.5%和1.0%组，喂后NO^-₂浓度至2 h达到最大值，至8 h时浓度趋近于0。其中，喂后0.5～4 h，0.5%和1.0%组的浓度均显著高于对照组(P<0.05)，且2组间无显著差异(P>0.05)。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 湖羊瘤胃液NO-3和NO-2浓度的动态变化 Fig. 1 Dynamic changes of nitrate and nitrite concentrations in rumen fluid of Hu sheep

NO^-₃对湖羊瘤胃液pH和NH₃-N浓度的影响见图2。各组pH变化趋势基本一致，喂后4～6 h降至最低值。其中，1.0%组的喂后2、6和8 h的pH显著高于对照组(P<0.05)；其余时间点，3个组的pH均无显著差异(P>0.05)。各组NH₃-N浓度均采食后0～2 h逐渐升高，之后逐渐下降。其中，1.0%组的喂后1 h浓度显著高于对照组(P<0.05)；1.5 h时，1.0%组显著高于对照组和0.5%组(P<0.05)；2 h时，0.5%和1.0%组显著高于对照组(P<0.05)；6 h时，1.0%组显著高于0.5%组(P<0.05)；其余时间点，3个组的NH₃-N浓度均无显著差异(P>0.05)。

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图2 NO-3对湖羊瘤胃液pH和NH3-N浓度的影响 Fig. 2 Effects of nitrate on pH and NH3-N concentration in rumen fluid of Hu sheep

NO^-₃对湖羊瘤胃液微生物蛋白质浓度的影响见表2。各组细菌蛋白、原虫蛋白和总微生物蛋白质浓度变均先升高后降低，8 h时又有所回升。其中，细菌蛋白浓度在喂后4 h时达到最大值；而原虫蛋白浓度在喂后6 h达到最大值(1.0%组在喂后8 h达到最大值)。此外，1.5 h时，0.5%和1.0%组的原虫蛋白、总微生物蛋白质浓度均显著高于对照组(P<0.05)；6 h时，0.5%组的原虫蛋白浓度显著高于对照组和1.0%组(P<0.05)；其余时间点，3个组的细菌蛋白、原虫蛋白和总微生物蛋白质浓度均无显著差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 NO-3对湖羊瘤胃液微生物蛋白质浓度的影响 Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL 项目 Items 时间 Time/h 硝酸钾添加水平 KNO3 supplemental level/% 0 0.5 1.0 细菌蛋白 BCP 0 0.55±0.10 0.65±0.21 0.69±0.18 0.5 0.59±0.10 0.71±0.38 0.74±0.02 1 0.69±0.16 0.68±0.14 0.83±0.02 1.5 0.66±0.12 1.08±0.21 0.95±0.09 2 0.66±0.09 0.77±0.30 0.96±0.10 4 0.98±0.01 1.09±0.12 1.05±0.02 6 0.74±0.01 0.78±0.25 0.85±0.58 8 0.91±0.03 0.84±0.30 0.92±0.42 原虫蛋白 PCP 0 0.65±0.22 0.69±0.14 0.72±0.12 0.5 0.86±0.32 0.92±0.12 0.96±0.30 1 1.00±0.20 1.03±0.44 1.19±0.03 1.5 0.96±0.15b 1.24±0.04a 1.23±0.28a 2 0.71±0.13 1.04±0.28 0.82±0.09 4 0.67±0.10 0.95±0.07 0.71±0.03 6 1.08±0.08b 1.49±0.25a 1.17±0.19b 8 0.64±0.04 1.05±0.32 1.56±0.51 总微生物蛋白质 Total MCP 0 1.20±0.33 1.34±0.35 1.42±0.06 0.5 1.45±0.22 1.63±0.50 1.71±0.28 1 1.69±0.04 1.71±0.31 2.02±0.04 1.5 1.62±0.03b 2.33±0.17a 2.18±0.18a 2 1.37±0.22 1.81±0.58 1.79±0.01 4 1.65±0.09 2.03±0.19 1.76±0.05 6 1.82±0.09 2.27±0.50 2.02±0.39 8 1.55±0.08 1.89±0.61 2.48±0.93 同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 NO-3对湖羊瘤胃液微生物蛋白质浓度的影响 Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL

NO^-₃对湖羊瘤胃液VFA浓度的影响见表3。各组乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度在喂后0～2 h逐渐升高，之后逐渐下降。除喂后4、6 h TVFA浓度和6 h 乙酸浓度外，TVFA和乙酸浓度均以1.0%组最高，0.5%组次之，对照组组最低，其中喂后4 h TVFA浓度3个组间差异显著(P<0.05)，0.5%组最高，1.0%组其次，对照组最低，且0.5%和1.0%组喂后4、8 h的TVFA和乙酸浓度均显著高于对照组(P<0.05)；喂后0.5、4、6 h，对照组和 0.5%组的丁酸浓度显著高于1.0%组(P<0.05)； 但丙酸浓度各组间无显著差异(P>0.05)；当KNO₃添加水平达到1.0%时，乙酸/丙酸在喂后1.5 h显著高于对照组和0.5%组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 NO-3对湖羊瘤胃液VFA浓度的影响 Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep 项目 Items 时间 Time/h 硝酸钾添加水平 KNO3 supplemental level/% 0 0.5 1.0 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 0 76.98±5.02b 89.05±1.84ab 99.95±10.49a 0.5 81.78±6.40 91.68±6.97 98.83±17.96 1 82.91±3.98 90.67±14.09 107.10±2.78 1.5 90.53±4.35 97.48±6.53 113.19±25.65 2 104.91±1.27 115.89±17.80 119.73±24.32 4 91.76±0.66c 116.59±0.83a 109.88±1.77b 6 96.99±0.52 111.97±13.05 103.65±12.95 8 70.37±3.44b 90.72±1.55a 94.28±3.28a 乙酸 Acetate/(mmol/L) 0 53.33±4.95b 59.96±9.05ab 79.56±6.62a 0.5 59.38±5.50 70.00±5.55 79.96±17.16 1 60.07±1.09b 69.41±10.03ab 82.44±2.20a 1.5 65.92±2.93 73.09±4.77 89.47±20.08 2 76.55±0.72 86.55±11.59 96.10±23.22 4 64.50±0.45b 86.03±0.29a 87.53±3.94a 6 68.66±0.28 82.78±12.44 79.24±11.53 8 50.49±1.41c 66.99±0.25b 75.74±1.19a 丙酸 Propionate/(mmol/L) 0 14.35±0.88 16.83±4.72 14.78±2.92 0.5 13.68±1.12 13.38±0.40 13.67±0.73 1 14.01±0.65 13.57±2.63 16.99±0.32 1.5 14.78±0.16 15.12±1.42 16.61±4.02 2 16.41±0.45 18.27±3.80 16.81±1.21 4 15.76±0.14 18.51±1.04 16.34±1.53 6 16.45±0.09 17.38±1.40 16.82±0.49 8 11.94±0.59 14.07±0.16 13.23±1.48 丁酸 Butyrate/(mmol/L) 0 9.30±0.95 12.26±6.17 5.62±0.95 0.5 8.73±0.22a 8.30±1.02a 5.21±0.08b 1 8.82±2.24 7.69±1.42 7.67±0.90 1.5 9.83±1.27 9.27±0.34 7.10±1.55 2 11.95±0.09a 11.07±2.41ab 6.82±0.11b 4 11.51±0.08a 12.05±0.51a 6.01±0.63b 6 11.88±0.14a 11.81±0.80a 7.59±0.93b 8 7.93±1.43ab 9.65±1.13a 5.32±0.61b 乙酸/丙酸 Acetate/propionate 0 3.73±0.57 3.79±1.60 5.45±0.63 0.5 4.34±0.05 5.23±0.26 5.83±0.95 1 4.29±0.12b 5.14±0.26a 4.85±0.22ab 1.5 4.46±0.15b 4.84±0.14b 5.40±0.10a 2 4.67±0.08 4.78±0.36 5.68±0.97 4 4.09±0.01 4.65±0.25 5.39±0.75 6 4.17±0.01 4.75±0.33 4.70±0.55 8 4.23±0.09b 4.76±0.04ab 5.76±0.56a

表3 NO-3对湖羊瘤胃液VFA浓度的影响 Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

NO^-₃对湖羊血液指标的影响见表4。各组 血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、尿素氮、甘 油三酯和总胆固醇浓度均无显著差异(P>0.05)，且高铁血红蛋白浓度很低。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 NO-3对湖羊血液指标的影响 Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep 项目 Items 硝酸钾添加水平 KNO3 supplemental level/% 0 0.5 1.0 总蛋白 TP/(g/L) 71.53±4.48 68.30±3.32 71.13±2.40 白蛋白 ALB/(g/L) 34.10±3.96 33.68±1.75 34.03±2.39 球蛋白 GLB/(g/L) 37.43±3.55 34.63±4.64 37.10±0.56 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 3.99±0.63 3.89±0.56 4.14±0.05 尿素氮 UN/(mmol/L) 5.78±0.80 5.80±0.88 5.47±0.33 甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.35±0.09 0.21±0.10 0.28±0.07 总胆固醇 TCH/(mmol/L) 2.10±0.30 1.94±0.36 1.82±0.40 高铁血红蛋白 BM/% <0.1 <0.1 <0.1

表4 NO-3对湖羊血液指标的影响 Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep

本研究发现NO^-₃和NO^-₂的动态变化规律与林淼^[13]研究结果相近：肉牛瘤胃微生物适应占饲粮干物质2%的KNO₃后，NO^-₃在采食4 h内快速消失，且不产生NO^-₂的积累。

各组的pH变化在正常范围内(6.55～7.09)，喂后2、6、8 h的1.0%组pH显著高于对照组，其他时间点3个组间无显著差异。结果与Guo等^[4]类似，但与其他结果不同。Phuc等^[14]研究指出，给每头山羊每天饲喂0、2、4、6 g的KNO₃，对瘤胃液pH仍无显著影响。代俊芳等^[7]通过体外法发现在饲粮中添加含不同比例硝态氮的颗粒料未对瘤胃液pH产生显著影响。Lin等^{[2, 15]}比较不同氮源和适应NO^-₃前后的体外瘤胃pH均无显著差异。与前人研究结果不同的可能原因是本试验采用活体研究且添加水平与前人略有不同。

从发酵时间来看，NH₃-N浓度的变化主要是由于饲粮中含氮物质不断降解产生氨，导致NH₃-N浓度快速上升；之后瘤胃微生物以氨为原料合成细菌蛋白，导致NH₃-N浓度逐渐下降。Sar等^[16]报道，当绵羊饲粮组成为提摩西草 ∶ 苜蓿干草 ∶ 精料=400 ∶ 400 ∶ 200时，按每头绵羊每kg代谢体重(BW^0.75)添加1.3 g硝酸钠(NaNO₃)，也引起了NH₃-N浓度的增加。同时，1.0%组显著高于对照组，这与Kemp等^[17]研究结果相近。

目前，关于NO^-₃对瘤胃微生物蛋白质浓度的影响鲜有报道。代俊芳等^[7]报道饲粮中硝态氮占饲粮氮水平在12%～18%范围内最有利于瘤胃微生物利用氨氮合成细菌蛋白，这可能是由于硝态氮作为氮源时，NO^-₃异化过程能产生更多的ATP，因而能够提高瘤胃微生物产量^[18]。Sakthivel等^[19]在水牛瘤胃液中分别添加0、5和10 mmol/L的NaNO₃，结果发现底物粗精比分别为70 ∶ 30、50 ∶ 50和30 ∶ 70时，微生物蛋白质浓度均随着NO^-₃浓度的增加而显著提高。本试验中，各组微生物蛋白质浓度采食后升高可能是由于碳水化合物发酵提供的能量较为充足，有利于瘤胃微生物蛋白质的合成。随着养分和能量的逐步消耗以及原虫吞噬作用的加强，瘤胃内细菌蛋白产量开始减少而原虫蛋白浓度继续升高，其浓度出现最大值的时间滞后于细菌蛋白浓度的最大值，之后随着可利用物质的减少以及原虫的自溶作用，原虫蛋白产量逐渐降低。

本试验关于VFA浓度的结果与Guo等^[4]研究结果相近，表明NO^-₃的添加使得瘤胃发酵模式更倾向于乙酸发酵，可能是由于NO^-₃还原过程中改变了瘤胃微生物的某些代谢途径，在一定程度上阻断了乙酸向丙酸合成的过程^[12]；或者是NO^-₃的快速降解使得电子从丁酸形成转移到NO^-₃还原的方向^[2]。但也有报道认为NO^-₃可以提高瘤胃液丙酸和丁酸产量，使发酵模式更倾向于丙酸发酵^[6]。差异的原因可能是不同试验中采用的试验方法、NO^-₃的添加水平以及动物的耐受程度不同。

本试验中发现各组间血清生化指标差异不显著，说明1.0%的添加水平不影响湖羊的代谢。同时，各组均未检测到高铁血红蛋白浓度(<0.1%)，可能是由于NO^-₃添加水平较低。

① 在湖羊饲粮中添加KNO₃，瘤胃液NO^-₃和NO^-₂浓度分别在1和2 h达到最大值，喂后6～8 h趋近于0。

② 与对照组相比，1.0%组的喂后2、6和8 h的pH显著提高，1、1.5和2 h的氨态氮浓度显著增加；同时，喂后1.5 h原虫蛋白和总微生物蛋白质浓度及喂后4、8 h乙酸和总挥发性脂肪酸的浓度显著提高，喂后0.5 h、2~6 h丁酸浓度显著降低，瘤胃发酵模式倾向于乙酸发酵。

③ 本试验中添加NO^-₃对湖羊血清生化指标无显著影响，均未检测到血液高铁血红蛋白(<0.1%)。