瘤胃酸中毒特别是急性瘤胃酸中毒是反刍动物采食大量易发酵碳水化合物后，乳酸产生菌与乳酸利用菌平衡失调，造成乳酸大量积累、瘤胃液pH急剧下降、瘤胃功能紊乱的一种营养代谢病。近年来该疾病发病率不断提高，给反刍动物生产造成了巨大经济损失^[1]。牛链球菌(Streptococci bovis,S. bovis)是瘤胃内主要的产乳酸菌^[2]。高精料条件下S. bovis的大量增殖是瘤胃内乳酸积累及瘤胃酸中毒的主要诱因^[3]。烟酸(nicotinic acid)是动物维持正常生理功能必不可少的营养素之一。已有的研究表明，高精料饲粮中添加烟酸能够调控瘤胃酸代谢，显著降低瘤胃内乳酸浓度，提高瘤胃液pH，避免瘤胃酸中毒的发生，但其机制尚不清楚^[4]。微生物可利用培养液中的烟酸作为前体，在磷酸核糖转移酶的作用下合成氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)^[5]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物代谢过程中一种重要的辅酶，它参与了代谢网络中超过300个氧化还原反应^[6]。在碳水化合物代谢中，NAD更是扮演着重要角色。NAD⁺在糖降解过程中作为电子受体被还原，NAD⁺的缺乏将导致糖酵解的停止^[7]。同时，还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)/NAD⁺和胞内氧化还原状态相关，并密切影响到细菌内的乳酸代谢^[8]。烟酸对瘤胃酸代谢的调控是否与烟酸影响了S. bovis的生长及代谢有关，目前尚不清楚。为了进一步了解烟酸对瘤胃微生物的调控作用，本试验以瘤胃内重要的乳酸产生菌S. bovis为研究对象，研究烟酸对S. bovis生长和乳酸发酵的影响，以期为烟酸在反刍动物生产中的实际应用提供理论依据。

S. bovis菌种分离自健康牛的瘤胃液^[9]，获赠于黑龙江八一农垦大学动物科技学院吴凌教授。

烟酸购自郑州嘉禾生物制品有限公司，其有效成分含量大于98%。

基础培养液采用不添加烟酸的胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)^[10]。称取酪蛋白胨17.0 g，磷酸二氢钾2.5 g，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0 g，氯化钠5.0 g和葡萄糖2.5 g，蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，调节pH至5.5~6.2，115 ℃高温灭菌15 min，冷却至室温后备用。

采用单因素完全随机试验设计，分为4组，Ⅰ组作为对照组，培养液为不添加烟酸的基础培养液；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为试验组，分别在基础培养液中添加0.05、0.25、0.50 mg/mL烟酸，每组4个重复。

将S. bovis菌种干粉复壮培养，根据菌落生物学特性及生化反应特性鉴定菌种；挑取2~3个经鉴定的S. bovis菌落扩繁培养6 h，制备600 nm下吸光度值为0.5的种子液。在无菌条件下，移取20 μL种子液接种于含有5 mL培养液的带塞试管中，39 ℃恒温水浴振荡培养0、2、4、6、12、24 h后，用EP管收取全部培养液，迅速放入-80 ℃冷冻保存待测。

pH采用PHS-25型pH计(上海今迈仪器仪表有限公司)于取样后立即测定。

菌群密度采用分光光度法测定，在600 nm下测定培养液吸光度值(OD_{600 nm})。

葡萄糖浓度采用二硝基水杨酸(DNS)法(于鲁浩等^[11])测定。耗糖速率采用以下公式计算：

v=(C₀-C_G)×V/t。

式中：v为耗糖速率(mg/h)；C₀为初始葡萄糖浓度(mg/mL)；C_G为t时间点培养液中葡萄糖浓度(mg/mL)；V为培养液体积(mL)；t表示培养时间(h)。

乳酸浓度采用比色法测定(张龙翔等^[12])。乳酸产量采用以下公式计算：

M_L(mmol/L)=(C_L0-C_L)×V。

式中：M_L为培养液中乳酸产量(mmol/L)；C_L0为初始乳酸浓度(mmol/L)；C_L为终末培养液中乳酸浓度(mmol/L)；V为培养液体积(L)。

产乳酸效率为乳酸产量和葡萄糖浓度的质量百分比，采用以下公式^[13]计算：

W=100×(M_L×N_L)/(M_G×1 000)。

式中：W为S. bovis的产乳酸效率(%)；M_L为乳酸产量(mmol/L)；N_L为乳酸的摩尔质量(g/moL)；M_G为葡萄糖消耗量(mg/L)。

乳酸脱氢酶(LDH)活性采用乳酸脱氢酶酶活测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。

NAD⁺与NADH浓度采用比色法^[14]测定。

试验数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(Duncan氏法)。

由表1可见，各试验组的菌群密度在大多数时间点(除Ⅱ组6、12 h外)均低于对照组(Ⅰ组)。与对照组相比，Ⅳ组在2~6 h、24 h均显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)，Ⅲ组仅在4和6 h显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)，Ⅱ组在2、4、24 h均显著或极显著降低(P<0.05或0.01)，但在12 h显著升高(P<0.05)。Ⅳ组菌群密度在6~12 h极显著低于Ⅱ组(P<0.01)，在24 h显著低于Ⅲ组(P<0.05)；Ⅲ组在12 h极显著低于Ⅱ组(P<0.01)。Ⅰ~Ⅳ组0~24 h的平均菌群密度分别为0.579、0.551、0.524和0.486。可见添加烟酸可以抑制S. bovis的增殖，且随着添加量的增加抑制作用加强。

由表2可见，随着培养时间的增加，各组pH在0~12 h均呈现下降趋势，24 h略有升高，且均在12 h达到最低值。各组之间pH在2~12 h差异均达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)。试验组在2~24 h pH均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)，且随着烟酸添加量的增加，培养液pH逐步升高。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 烟酸对S. bovis菌群密度的影响 Table 1 Effects of nicotinic acid on bacteria density of S. bovis (OD600 nm) 培养时间 Culture time/h 组别 Groups Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 0.009±0.001 0.008±0.001 0.008±0.001 0.008±0.003 2 0.150±0.011Aa 0.133±0.012ABb 0.138±0.010ABab 0.116±0.005Bb 4 0.793±0.031Aa 0.658±0.036Bb 0.596±0.066Bbc 0.544±0.062Bc 6 0.880±0.024Aa 0.883±0.026Aa 0.829±0.026ABbc 0.762±0.089Bb 12 0.817±0.050ABb 0.875±0.023Aa 0.778±0.033Bb 0.762±0.033Bb 24 0.825±0.049Aa 0.751±0.040ABbc 0.800±0.031ABab 0.726±0.040Bc 0~24 0.579±0.008Aa 0.551±0.015ABb 0.524±0.020Bc 0.486±0.016Cd 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with the capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表1 烟酸对S. bovis菌群密度的影响 Table 1 Effects of nicotinic acid on bacteria density of S. bovis (OD600 nm)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 烟酸对培养液pH的影响 Table 2 Effects of nicotinic acid on pH of culture medium 培养时间 Culture time/h 组别 Groups Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 6.95±0.02 6.95±0.05 6.95±0.01 6.95±0.03 2 6.62±0.06Cd 6.65±0.06BCc 6.68±0.02Bb 6.80±0.03Aa 4 4.78±0.06D 4.88±0.05C 5.03±0.02B 5.10±0.04A 6 4.32±0.04D 4.41±0.04C 4.62±0.07B 4.77±0.03A 12 4.27±0.02Cd 4.31±0.01Cc 4.49±0.03Bb 4.55±0.04Aa 24 4.29±0.04Cc 4.45±0.07Bb 4.57±0.04Aa 4.59±0.07Aa

表2 烟酸对培养液pH的影响 Table 2 Effects of nicotinic acid on pH of culture medium

在培养液pH最低时间点(12 h)测定了烟酸对S. bovis乳酸发酵的影响(表3)。与对照组相比，Ⅱ组S. bovis的耗糖速率、乳酸产量和产乳酸效率没有显著变化(P>0.05)；Ⅲ、Ⅳ组极显著降低了耗糖速率、乳酸产量和产乳酸效率(P<0.01)，但对单位密度细菌耗糖速率没有显著影响(P>0.05)，说明中、高剂量的烟酸可能因为抑制S. bovis生长而减缓了耗糖速率和乳酸产生。Ⅲ和Ⅳ组之间耗糖与产乳酸指标差异不显著(P>0.05)。烟酸提高了乳酸脱氢酶活性，较对照组，Ⅱ组显著升高(P<0.05)，Ⅲ组差异不显著(P>0.05)，Ⅳ组极显著升高(P<0.01)。

由表4可见，添加烟酸对培养液中NAD⁺浓度没有影响(P>0.05)。各组NADH浓度为Ⅰ组<Ⅱ组<Ⅲ组<Ⅳ组，组间差异均极显著(P<0.01)。与对照组相比，Ⅲ、Ⅳ组的NAD浓度呈升高趋势，其中Ⅳ组达到差异极显著水平(P<0.01)，Ⅱ组NAD浓度无显著变化(P>0.05)。添加烟酸还提高了培养液中NADH/NAD⁺(P<0.01)，试验组极显著高于对照组(P<0.01)，Ⅲ、Ⅳ组极显著高于Ⅱ组(P<0.01)。

烟酸是微生物必需的B族维生素之一，对细菌的生长有较大的影响^[15]。梁琳琳等^[16]对B群链球菌(Streptococcus group B)的培养条件进行了考察，发现在7个生长因子中，烟酸对其生长的影响仅次于尿嘧啶，排第2位。刘嵘明等^[17]的研究中，烟酸浓度越高，大肠杆菌NZN111(Escherichia coli NZN111)的生物量和丁二酸的产量也越高；但当烟酸浓度超过0.5 mmol/L，大肠杆菌的生物量和丁二酸的产量均下降。其原因可能是烟酸过量，会抑制菌体的代谢^[18]。鲁友友等^[19]通过体外试验发现，瘤胃液中添加0.05 mg/mL烟酸可增加 瘤胃微生物蛋白(MCP)浓度，但过高水平的烟酸(0.08 mg/mL)在后期会抑制瘤胃微生物生长，降低MCP浓度。本研究结果与前人不同，添加烟酸抑制了S. bovis的增殖，且随剂量增加抑制作用增强。这可能是培养液中有机氮源本身含有一些维生素，再添加烟酸反而抑制S. bovis生长^[20]。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 烟酸对S. bovis乳酸发酵的影响(12 h) Table 3 Effects of nicotinic acid on lactic fermentation of S. bovis (12 h) 项目 Items 组别 Groups Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 耗糖速率 Glucose degradation rate/(mg/h) 0.891±0.016Aa 0.905±0.017Aa 0.802±0.027Bb 0.820±0.043Bb 单位密度细菌耗糖速率 Glucose degradation rate of per density unit of bacteria/(mg/h) 1.094±0.062 1.035±0.045 1.031±0.012 1.079±0.066 乳酸产量 Lactic acid production/(mmol/L) 19.911±2.644Aa 19.937±1.673Aa 14.249±0.399Bb 13.967±0.697Bb 单位密度细菌乳酸产量 Lactic acid production of per density unit of bacteria/(mmol/L) 24.559±4.663a 22.805±2.256ab 18.356±1.227b 18.419±1.598b 产乳酸效率 Lactic acid production efficiency/% 83.820±0.223Aa 82.580±0.139Aa 66.620±0.037Bb 63.930±0.064Bb 乳酸脱氢酶活性 LDH/(U/L) 90.882±18.322Bc 195.516±34.367ABb 153.961±38.579ABbc 254.410±38.849Aa

表3 烟酸对S. bovis乳酸发酵的影响(12 h) Table 3 Effects of nicotinic acid on lactic fermentation of S. bovis (12 h)

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 添加烟酸对NAD浓度的影响(12 h) Table 4 Effects of nicotinic acid on NAD concentration of culture medium (12 h) 项目 Items 组别 Groups Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD+/(μmol/L) 2.813±0.094 2.402±0.046 2.240±0.184 2.496±0.179 还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH/(μmol/L) 3.603±0.130D 3.942±0.352C 4.440±0.214B 5.289±0.318A 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD/(μmol/L) 6.416±0.160Bbc 6.344±0.046Bc 6.680±0.184Bb 7.785±0.180Aa 还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/ 氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH/NAD+ 1.282±0.319Cc 1.641±0.031Bb 1.991±0.160Aa 2.127±0.158Aa

表4 添加烟酸对NAD浓度的影响(12 h) Table 4 Effects of nicotinic acid on NAD concentration of culture medium (12 h)

之前的试验发现，添加烟酸可显著减少瘤胃内乳酸的产生，提高瘤胃液pH^{[19, 21]}。本试验表明烟酸同样抑制了S. bovis的乳酸发酵，降低了S. bovis的产乳酸效率，提高了培养液pH。这可能和烟酸作为NAD⁺前体可调控微生物细胞内代谢有关：烟酸的合成产物NAD⁺在糖代谢中扮演着重要角色，是糖酵解途径的关键辅酶因子^[22]。氧化态NAD⁺在糖酵解过程中作为电子受体被还原成等量的NADH，并释放ATP。NAD⁺的缺乏将导致糖酵解和ATP的供应的停止^[23]。为了保证糖酵解的一定速度，酵解过程中产生的NADH必须快速氧化为NAD⁺，且维持一定的胞质NAD⁺浓度^[24]。乳酸发酵途径是无氧状态下细胞氧化NADH为NAD⁺的一个关键途径^[25]。一些细菌(如大肠杆菌NZN111)由于NADH依赖的LDH无法合成而限制了糖酵解过程中形成的NADH再生为NAD⁺，造成辅酶不平衡，导致该菌株厌氧条件下不能正常生长^[26]。但由于乳酸的酸度较高，过度积累对细菌的生长会有抑制作用。因此我们认为，当培养液中有足量的NAD⁺时，乳酸发酵途径将会被抑制。De Felipe等^[27]在乳酸乳球菌细胞(Lactococcus lactis)、董志姚等^[28]在光滑球拟酵母细胞(Torulopsis glabrata)中过量表达NADH氧化酶noxE基因，促进了NADH氧化为NAD⁺，从而使葡萄糖消耗速率提高，减少乳酸产量，产乳酸效率大大降低^[27]。本研究中，糖酵解过程中消耗的NAD⁺，可以从培养液中的烟酸转化而来，以维持糖酵解的正常速率，从而使乳酸发酵受到抑制，乳酸产量和产乳酸效率下降。

微生物可利用烟酸、烟碱、烟酰胺等作为前体，在磷酸核糖转移酶的作用下合成NAD^+[5]。Takebe等^[29]研究认为，乳酸细菌中NAD⁺含量与培养基中烟酸浓度之间呈对数关系。屯妮萨体内试验结果表明，添加烟酰胺可显著地提高瘤胃微生物中NAD⁺浓度，降低NADH/NAD^+[30]。但也有报道，添加烟酰胺对瘤胃内NAD⁺浓度、NADH/NAD⁺均无显著影响^{[31, 32]}。本试验结果与前人不同，烟酸生成的NAD⁺与S. bovis糖酵解过程中消耗的NAD⁺达到了动态平衡，添加烟酸后NAD⁺浓度不受影响，而NADH浓度增加，NADH/NAD⁺升高。

在本试验条件下，添加烟酸可抑制S. bovis增殖，并保证NAD⁺浓度的稳定，维持糖酵解的进行，减少乳酸的生成，提高培养液pH，其中以0.50 mg/mL烟酸添加量效果最好。