2. 北京市营养源研究所水产动物系统营养研究开放实验室, 北京 100069
2. Open Laboratory for Aquatic Animal Nutrition, Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China
丙二醛(MDA)为有毒有害的脂质过氧化产物，主要产生途径为油脂氧化酸败[1, 2, 3, 4]及机体组织应激[5, 6, 7]。MDA能与蛋白质产生交联作用并修饰蛋白质[8, 9, 10]，从而改变蛋白质形态及生理功能[11]，并能导致细胞膜流动性降低[12]、红细胞膜结构破坏[13]、DNA及细胞功能受到抑制[14, 15, 16, 17]。肠道作为饲料消化、吸收的主要器官，同时也是抵御细胞与毒素的屏障[18, 19]，当鱼体摄食含油脂氧化产物的饲料时，产生的MDA能直接损伤肠道黏膜组织[20]，导致鱼体生长受阻甚至死亡[21]。酵母培养物(yeast culture，YC)是经酵母菌发酵的培养物及酵母菌的混合物，含有维生素、矿物质、促生长因子及寡糖等物质。在饲料中添加酵母培养物有提高鱼体特定生长率，降低饲料系数，改善鱼体肠道黏膜状态[22, 23]，修复肝胰脏损伤[24]以及促进肠道有益菌的增殖[25]的作用。
目前，对酵母培养物保护作用的研究主要依靠养殖试验平台[22, 23, 24, 25]，同时酵母培养物对脂质过氧化产物MDA损伤细胞的保护作用尚未见报道。在本实验室成功建立草鱼肠道黏膜细胞分离和原代培养方法[26]的基础上，本试验通过在培养液中添加酵母培养物水溶物及MDA，研究酵母培养物水溶物对MDA导致的细胞损伤的保护作用，旨在从细胞平台上研究酵母培养物水溶物的作用机制，为进一步研究酵母培养物对动物肠道保护机制提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 离体草鱼肠道黏膜细胞分离、培养 1.1.1 试验鱼获取肠道黏膜细胞的草鱼平均体重为(22.0±5.0) g，来自苏州相城新时代养殖场。将草鱼饲养于苏州大学鱼类循环养殖系统中，使用自制的强化饲料(中国发明专利《一种强化鱼类肠道黏膜和肝胰脏细胞生理功能的配合饲料》，专利号ZL 2010 1 0585756.9)强化饲养2周后用于肠道黏膜细胞的采集。养殖期间投喂的配合饲料含蛋白质28%、油脂4%。每天投喂饲料2次，水温为(24±4) ℃、溶解氧浓度＞6 mg/L。
1.1.2 离体肠道黏膜细胞的获取与培养方法草鱼肠道黏膜细胞(细胞团)获取及其培养方法参照本实验室建立的方法[26]。主要操作方法为：试验草鱼用超纯水冲洗体表2次，捣碎脑部处死，迅速置于75%乙醇中浸泡5～10 s。超净工作台上解剖鱼体，取出肠道中段，去除肠系膜脂肪，用注射器(10 mL)吸取D-Hanks清洗液冲洗肠段内腔3～4次；采用机械刮取获得肠道黏膜组织，加入胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液(含有胶原酶Ⅰ、Ⅳ各0.1 mg/mL的D-Hanks液，0.22 μm过滤，-20 ℃贮存)，28 ℃振荡消化30 min后，立即加入终止液(按消化液 ∶ 胎牛血清=19 ∶ 1的比例配制而成)终止消化，玻璃吸管反复吹打5 min后，静止1 min，吸取上层细胞悬液为原代黏膜细胞(细胞团)液。原代黏膜细胞(细胞团)液经过400 r/min离心7 min，加入完全培养液(添加15%胎牛血清的M199培养液)悬浮沉淀，再离心(400 r/min、7 min)2次，取细胞(细胞团)悬浮液接种于96孔细胞培养板(鼠尾胶原Ⅰ型包被)。细胞(细胞团)接种数量保持在2×103个/孔，使用完全培养液，在27 ℃、6% CO2条件下培养36 h后进行试验。
1.2 酵母培养物水溶物制备制备酵母培养物水溶物原料为达农威水产益康(DV AQUA，美国达农威生物发酵工程技术有限公司，有效成分为酵母细胞外代谢产物)。酵母培养物水溶物制备方法：室温下使用完全培养液将酵母培养物溶解10 min，超净工作台中0.22 μm过滤，制得无菌含酵母培养物水溶物的完全培养液。分别制成含酵母培养物水溶物50、100、200 mg/L的完全培养液，调整pH至7.3。试验开始后直接使用含不同浓度酵母培养物水溶物的完全培养液。
1.3 MDA的制备与添加制备MDA原料为1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane)(Sigma-Aldrich公司产品，浓度≥96%)。参照文献[27]的方法制备MDA贮备液，具体制备方法为：取3 mL 1,1,3,3-四乙氧基丙烷到100 mL 0.01 mol/L的HCl中，搅拌6 h，4 ℃避光放置2周后0.22 μm过滤分装，-20 ℃冷冻保存。使用MDA测试盒(南京建成生物工程研究所产品)测得MDA浓度为(44 545.46±539.25) μmol/L。MDA的添加：在试验前，将MDA贮备液用各组对应的完全培养液稀释530倍后制成MDA应用液，按试验要求添加到96孔培养板中。
1.4 试验设计本试验设正常组、MDA模型组(MDA-1~2组)及酵母培养物水溶物组(YC-1~6组)，其中酵母培养物水溶物组是在含有酵母培养物水溶物的完全培养液中添加不同浓度的MDA。各组均为96个重复，每个重复为1个培养孔。
当细胞生长36 h后，各组更换培养液，其中酵母培养物水溶物组中YC-1、YC-4组使用含50 mg/L酵母培养物水溶物的完全培养液，YC-2、YC-5组使用含100 mg/L酵母培养物水溶物的完全培养液，YC-3、YC-6组使用含200 mg/L酵母培养物水溶物的完全培养液；其余各组使用正常的完全培养液。更换培养液后各组按表1剂量要求添加MDA应用液。最后使细胞培养液中MDA达到4.94、9.89 μmol/L 2个浓度梯度，酵母培养物水溶物达到50、100、200 mg/L 3个浓度梯度。具体试验设计见表1。
 | 表1 试验设计 Table 1 Experimental design |
分别在试验开始后3、6、9、12 h时取出培养板进行观察。培养的活体细胞直接用IX70荧光倒置显微镜(奥林巴斯公司)进行观察和照相。每组随机选择8个培养孔，经Giemsa染色[28]，观察细胞集落的生长状态。
1.5.2 细胞活性测定在不同培养时间，从各组随机选取8个培养孔，采用噻唑蓝(MTT)法[29]测定培养液中细胞活性。所用试剂MTT(Sigma-Aldrich公司产品)浓度为5 mg/mL，0.22 μm过滤，-20 ℃贮存。
1.5.3 主要生化指标的测定在不同培养时间，从各组随机选取8个培养孔，吸取培养液保存于1支1.5 mL的EP管中，-80 ℃冷冻保存，用于测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(GPT)活力及MDA浓度；将上述各组8个培养孔每孔加入含0.5% Triton的Tirs-HCl溶液200 μL，在室温下溶解30 min，收集细胞裂解液[30]，各组细胞裂解液混合均匀后转移至1支1.5 mL的EP管中，-80 ℃冷冻保存以测定细胞总蛋白(TP)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及总抗氧化能力(T-AOC)。上述指标测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所生产，按照试剂盒说明书方法测定。
1.6 数据处理数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，结果用SPSS 17.0软件进行统计分析，用Duncan 氏法进行多重比较，差异显著水平为P＜0.05。
由表2中细胞活性的变化结果可知，与正常组相比，MDA模型组均有降低趋势，其中MDA-1组在9 h时显著降低(P＜0.05)，MDA-2组在6、9、12 h时均显著降低(P＜0.05)。与MDA-1组相比，YC-1组在6、9 h时显著升高(P＜0.05)，YC-2组在6、9、12 h时均显著升高(P＜0.05)，YC-3组在6、9 h时有升高趋势，但并不显著(P＞0.05)。与MDA-2组相比，YC-4组在9 h时显著升高(P＜0.05)，YC-5、YC-6组均在9、12 h时显著升高(P＜0.05)。同时，YC-1~3组间在6、9 h时差异不显著(P＞0.05)，YC-4~6组间在各时间点均差异不显著(P＞0.05)。
| 表2 各组不同培养时间时细胞活性变化(结果以噻唑蓝的吸光度值表示) Table 2 Change of cell activity at different culture time in different groups (results were expressed by OD value of MTT) |
由表3中细胞中TP含量变化结果可知，与正常组相比，MDA模型组均有下降趋势，其中MDA-1组在6、9、12 h时显著降低(P＜0.05)，MDA-2组在3、6、9、12 h时均显著降低(P＜0.05)。与MDA-1组相比，YC-1组在6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)，YC-2组在3、6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)，YC-3组仅在9 h时显著升高(P＜0.05)。与MDA-2组相比，YC-4组在6、9 h时显著升高(P＜0.05)，YC-5、YC-6组均在6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)。同时，YC-2组在3、6、9 h时较YC-3组显著升高(P＜0.05)，在3 h时较YC-1组显著升高(P＜0.05)；YC-4~6组在3、6 h时无显著差异(P＞0.05)，YC-5组在9 h时较YC-6组显著升高(P＜0.05)，与YC-4组无显著差异(P＞0.05)，YC-5、YC-6组在12 h时较YC-4组显著升高(P＜0.05)。
| 表3 各组不同培养时间时细胞中TP含量变化 Table 3 Change of TP content in cell at different culture time in different groups |
上述结果显示，MDA对细胞生长及存活均产生抑制作用，抑制作用强度与浓度、时间呈正相关。培养液中添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物能一定程度地消除4.94、9.89 μmol/L MDA对细胞生长及存活产生的抑制作用，保护细胞正常生长；同时，随着MDA浓度的加大，酵母培养物水溶物对细胞生长保护作用的时间点有延迟的趋势。从细胞活性及细胞TP含量变化看，添加100 mg/L酵母培养物水溶物对4.94 μmol/L MDA损伤细胞的保护作用较为明显，对于9.89 μmol/L MDA损伤细胞，100、200 mg/L酵母培养物水溶物在9、12 h时保护作用较明显。
2.2 对细胞生长状态的影响在试验开始后的不同时间点，通过荧光倒置显微镜、Giemsa染色后显微镜观察培养的试验细胞的生长状态变化过程(图1)。结果发现，正常组细胞生长正常，细胞贴壁且胞浆丰富，细胞界限清晰(图1-A、图1-F)；MDA模型组随MDA浓度增加，游离细胞增多，且细胞折光性差(图1-B、图1-C)，同时细胞界限模糊(图1-G、图1-H)，MDA-2组黏膜细胞集落中12 h时贴壁细胞数量较少，集落面积小(图1-I)。6 h时YC-5组细胞生长及形态没有明显改善(图1-H、图1-N)；9 h时添加酵母培养物水溶物组中贴壁细胞较多，游离性细胞较少(图1-D、图1-E)，细胞界限较为清晰(图1-J、图1-K)，YC-3组细胞生长不及YC-2组(图1-K、图1-L)；12 h时添加酵母培养物对MDA损伤细胞的保护作用较理想，其中以YC-2、 YC-5组细胞状态较好(图1-L、图1-O)，YC-2组细胞生长状态最优且接近正常组水平(图1-F、图1-M)。
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A：正常组，9 h，细胞胞浆丰富（↑）；B：MDA-1组，9 h，折光性差、游离细胞（↑）；C：MDA-2组，9 h，折光性差、游离细胞（↑）；D：YC-2组，9 h，细胞生长正常，贴壁细胞（↑）；E：YC-5组，9 h，贴壁细胞（↑）；F：正常组，9 h，生长正常，细胞胞浆丰富；G：MDA-1组，12 h，细胞轮廓、界限模糊（↑）；H：MDA-2组，6 h，细胞轮廓、界限模糊（↑）；I：MDA-2组，12 h，大片细胞凋亡；J：YC-1组，9 h，细胞生长较正常，部分细胞界限不清晰（↑）；K：YC-2组，9 h，贴壁细胞较少；L：YC-3组，9 h，细胞生长差，细胞轮廓、界限模糊（↑）；M：YC-2组，12 h，细胞生长正常，铺展正常（↑）；N：YC-5组，6 h，细胞生长差，细胞界限模糊（↑）；O：YC-5组，12 h，细胞生长较正常，部分细胞界限模糊（↑）。
A: normal group, 9 h, cells with abundant cytoplasm (↑); B: MDA-1 group, 9 h, weak refraction and inadherent cells (↑); C: MDA-2 group, 9 h, weak refraction and inadherent cells (↑); D: YC-2 group, 9 h, normal growth and adherent cells (↑); E: YC-5 group, 9 h, adherent cell (↑); F: normal group, 9 h, cells with normal growth and abundant cytoplasm; G: MDA-1 group, 12 h, cells boundaries were not clearly defined (↑); I: MDA-2 group, 12 h, serious anoikis of most cells; J: YC-1, 9 h, cells growth normal, part of cells boundaries were not clearly defined (↑); K: YC-2 group, 9 h, fewer adherent cells; L: YC-3 group, 9 h, cells grew worse, cells boundaries were not clearly defined (↑); M: YC-2 group, 12 h, normal growth and adherent cells (↑); N: YC-5 group, 6 h, cells grew worse, cells boundaries were not clearly defined (↑); O: YC-5 group, 12 h, cells growth normal, but part of cells boundaries were not clearly defined (↑). 图1 不同条件下肠道黏膜细胞生长及形态(A～E：倒置荧光显微镜观察，200×；F～O：Giemsa染色观察，200×) Fig. 1 Growth and morphology of intestinal mucosal cells in different conditions (A-E: observed by inverted flulrescence microscope,200×; F-O: observed by staining with Giemsa,200×) |
上述结果表明，培养液中添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物对MDA损伤细胞有改善其生长状态的作用，其中以添加100 mg/L酵母培养物水溶物对4.94 μmol/L MDA损伤细胞的保护效果较好。
2.3 培养液MDA浓度变化由表4中培养液MDA浓度变化结果可知，与正常组相比，MDA模型组显著增加(P＜0.05)。与MDA-1组相比，YC-1组在3、6、9 h时显著降低(P＜0.05)，YC-2组在3、6、9、12 h时显著降低(P＜0.05)，YC-3组仅在3 h时显著降低(P＜0.05)。与MDA-2组相比，仅YC-5组在3 h时 显著降低(P＜0.05)，其余时间点各组降低均不显 著(P＞0.05)。同时，Y-1组在3、6、9 h时较YC-3组显著降低(P＜0.05)，Y-2组在3、6、9 h时较YC-3组显著降低(P＜0.05)；YC-5组在9 h时较YC-4组显著降低(P＜0.05)，其他时间点YC-4、YC-5、YC-6组之间无显著差异(P＞0.05)。
| 表4 各组不同培养时间时培养液中MDA浓度变化 Table 4 Change of MDA content in culture solution at different culture time in different groups μmol/L |
以上结果表明，培养液中添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物有降低4.94 μmol/L MDA导致的培养液中MDA浓度升高的趋势，添加100 mg/L酵母培养物水溶物的降低效果较好，持续降低作用时间较长。在9.89 μmol/L MDA浓度下，仅添加100 mg/L酵母培养物水溶物的组在3 h时稍有降低，其余组降低作用并不明显。 2.4 细胞结构通透性变化
通过测定培养液中LDH、GPT活力，观察细胞内酶漏出情况，从而了解细胞膜结构通透性变化[31, 32]，结果见表5。
| 表5 各组不同培养时间时培养液中LDH、GPT活力的变化 Table 5 Changes of LDH and GPT activities in culture solution at different culture time in different groups |
由LDH活力变化可知，与正常组相比，MDA模型组呈升高趋势，在3、6、9 h时显著升高(P＜0.05)；与MDA-1组相比，YC-1~3组在6、9 h时显著降低(P＜0.05)；与MDA-2组相比，YC-4~6组在9、12 h时显著降低(P＜0.05)。同时，YC-2组在9 h时显著低于YC-1、YC-3组(P＜0.05)；YC-4组在9 h时显著低于YC-5、YC-6组(P<0.05)。
由GPT活力变化可知，仅MDA-2组在3 h时较正常组显著升高(P＜0.05)，其余时间点MDA模型组与正常组之间均无差异不显著(P＞0.05)；YC-1~3组与MDA-1组、YC-4~6组与MDA-2组在各时间点均无显著差异(P＞0.05)。同时，YC-2组在6 h时显著高于YC-1、YC-3组(P＜0.05)；YC-5组在3、9、12 h时显著高于YC-4组(P＜0.05)。
上述结果表明，培养液中添加MDA增加了细胞膜的通透性，细胞内酶漏出严重。在培养液中添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物能保护细胞膜完整，从而降低MDA导致的细胞内酶漏出。从LDH活力变化看到，对于4.94 μmol/L MDA造成的细胞膜通透性增加，50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物的保护作用主要是在6、9 h时，而对于9.89 μmol/L MDA，保护作用主要是在9、12 h时。同时，培养液中LDH活力变化较GPT活力变化更为敏感。 2.5 细胞中GSH-Px、SOD活力和T-AOC变化
各组不同培养时间时细胞中GSH-Px、SOD活力及T-AOC的变化结果见表6。
| 表6 各组不同培养时间时细胞中GSH-Px、SOD活力及T-AOC的变化 Table 6 Changes of GSH-Px and SOD activities and T-AOC in cell at different culture time in different groups |
由GSH-Px活力变化可知，与正常组相比，MDA模型组在3 h时显著降低(P＜0.05)；与MDA-1组相比，YC-1~3组均在6、12 h时显著升高(P＜0.05)。与MDA-2组比较，YC-4~6组在6、9、12 h时均显著升高(P＜0.05)，YC-5组在3 h时显著升高(P＜0.05)。同时，YC-2组在9 h时较YC-1、YC-3组显著升高(P＜0.05)；YC-5组在3 h时较YC-4、YC-6组显著升高(P＜0.05)，YC-4组在9、12 h时较YC-6组显著升高(P＜0.05)。
由SOD活力变化可知，与正常组相比，MDA-1组在9 h时显著降低(P＜0.05)，MDA-2组在3、9 h时显著降低(P＜0.05)。与MDA-1组相比，YC-1、YC-2组在6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)，YC-3组在9、12 h时显著升高(P＜0.05)。与MDA-2组相比，YC-4组在9 h时显著升高(P＜0.05)，YC-5、YC-6组在9、12 h时显著升高(P＜0.05)。同时，YC-2组在6、9 h时显著高于YC-3组(P＜0.05)；YC-6组在3 h时显著高于YC-5组(P＜0.05)，YC-4组在12 h时显著低于YC-5、YC-6组(P＜0.05)。
由T-AOC变化可知，与正常组相比，MDA-1组在3、6、9、12 h时显著降低(P＜0.05)，MDA-2组在9、12 h显著降低(P＜0.05)。与MDA-1组相比，YC-1组在6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)，YC-2组在3、6、9、12 h时显著升高(P＜0.05)，YC-3组在各时间点均无显著变化(P＞0.05)。与MDA-2组相比，YC-4~6组在3、6 h时无显著变化(P＞0.05)，在9、12 h时显著升高(P＜0.05)。同时，YC-2组在9 h时显著高于YC-1、YC-3组(P＜0.05)，YC-2组在12 h时显著高于YC-1组(P＜0.05)；YC-4~6组之间各时间点均无显著差异(P＞0.05)。
上述结果表明，培养液中添加MDA有降低细胞中GSH-Px、SOD活力及T-AOC的趋势；添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物后有提高上述酶活力及T-AOC的趋势。从持续时间上看，对于4.94 μmol/L MDA，添加100 mg/L酵母培养物水溶物对于提高细胞抗氧化能力效果较好，作用时间主要集中在6、9、12 h；对于9.89 μmol/L MDA，添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物 有较好效果，作用时间主要集中在9、12 h。此外，GSH-Px活力变化较SOD活力、T-AOC敏感。 3 讨 论
酵母培养物主要成分包括酵母细胞代谢产物、经发酵后变异的培养基及少量的无活性酵母细胞，其中有效成分为酵母细胞代谢产物，由于细胞培养的无菌环境要求导致酵母培养物无法直接添加于细胞培养液中。使用过滤除菌手段分离得到酵母培养物水溶物，主要为肽、寡糖、氨基酸、有机酸、酯类、醇类等酵母细胞外代谢产物。因此，本试验结果反映了酵母培养物水溶物作为一个整体对MDA损伤的草鱼肠道黏膜细胞生长、细胞结构的保护作用。
3.1 对细胞生长及状态的影响膜脂质过氧化产物MDA、4-羟基壬烯醛(HNE)等不饱和醛酮类的代谢路径之一为被谷胱甘肽和其他含巯基氨基酸还原，或是被醛氧化酶氧化[33, 34]，但主要代谢途径还是通过MDA与蛋白质氨基残基结合从而消除[35, 36]，因此，本试验中MDA模型组中细胞界限模糊可能是MDA与膜蛋白结合导致的。添加100 mg/L酵母培养液水溶物于4.94 μmol/L MDA致损伤的细胞培养液中，12 h内能使细胞生长恢复接近至正常水平，说明酵母培养物水溶物可能通过增强细胞生长能力以代谢培养液中的MDA，从而对细胞起到一定的保护作用。
M199培养液中本身含有无机盐、氨基酸、维生素等组分，对细胞生长起到基础的营养支持作用。在细胞生长中，小分子肽类能以完整形式被细胞吸收并水解的效率明显高于游离氨基酸[37]，进而提高细胞活力[38]。从本试验中添加酵母培养物水溶物后细胞活性与细胞TP含量的变化可以看到，酵母培养物水溶物组较MDA模型组细胞生长好，可能原因是在细胞生长过程中酵母培养物中游离氨基酸、多肽类物质的营养补充作用促进了细胞增殖，亦或是酵母培养物水溶物提高了细胞的抗氧化能力，使得细胞对MDA损伤的消除能力增强，这还有待进一步研究。此外，在4.94 μmol/L MDA损伤条件下，添加50、100 mg/L酵母培养液水溶物较添加200 mg/L酵母培养液水溶物对细胞的保护作用要好，可能是酵母培养物中含有的有机酸物质如苹果酸、甲酸、琥珀酸、天冬氨酸等[39]对细胞产生了一定程度的负面作用。
3.2 对培养液中MDA浓度及细胞膜结构完整性的 影响相比添加4.94 μmol/L MDA的模型组，添加50、100 mg/L酵母培养物水溶物后培养液中MDA浓度显著下降，表明酵母培养物水溶物能增强肠道黏膜细胞清除MDA的能力，从而使MDA浓度下降。然而，培养液中添加9.89 μmol/L MDA后，再添加50、100、200 mg/L酵母培养物水溶物并没有使MDA浓度显著下降，可能原因是高浓度MDA损伤下黏膜细胞清除MDA的能力受到抑制，酵母培养物水溶物对此状态下的黏膜细胞清除MDA能力的增强作用有限。本试验中，培养液中添加MDA增加了细胞通透性，在本实验室早期研究中发现MDA可能对细胞抗氧化能力有影响，进而引起细胞膜通透性的变化，同时MDA本身可能也会降低细胞膜流动性，影响细胞膜功能[12]。酵母培养物代谢物中除有促进细胞增殖的营养物质外，还存在多糖、谷胱甘肽、SOD等物质，能提高细胞的抗氧化能力[40, 41, 42, 43, 44, 45]。本试验中酵母培养物水溶物组培养液中LDH活力在6~12 h时有下降趋势，表明酵母培养物水溶物能保护细胞膜的完整性，维护细胞功能正常，可能是因为酵母培养物水溶物能提高细胞的抗氧化能力，从而提升细胞清除MDA的能力，进而保护细胞膜结构的完整性，降低细胞内酶的漏出。
3.3 对细胞抗氧化能力的影响本试验结果发现，培养液中添加4.94、9.89 μmol/L MDA后在部分时间点显著降低了细胞中GSH-Px、SOD活力及T-AOC，表明此时MDA导致细胞抗氧化能力下降。有文献报道，酵母培养物的营养活性物质能提高山羊血液中GSH-Px、SOD活力及T-AOC，有效清除自由基[41]。本试验中，添加50~100 mg/L酵母培养物水溶物对细胞的抗氧化能力有提升作用，可能是酵母培养物水溶物中存在的多糖、谷胱甘肽、SOD等物质增强了细胞的抗氧化能力。本试验中，酵母培养物水溶物组细胞抗氧化能力的提升主要在集中9、12 h时，可能是随着MDA作用时间的延长及细胞对MDA的清除，在酵母培养物水溶物的促生长作用下细胞状态逐渐得到恢复的结果。
4 结 论在本试验条件下，12 h内50、100、200 mg/L的酵母培养物水溶物对4.94、9.89 μmol/L MDA损伤的细胞均有保护作用，主要表现在促进细胞生长，改善细胞生长状态及保护细胞结构的完整性，提高细胞的抗氧化能力。其中，以培养液中添加100 mg/L酵母培养物水溶物对4.94 μmol/L MDA损伤细胞的保护作用最佳，使细胞生长状态接近正常水平。酵母培养物水溶物可能通过增强细胞抗氧化能力途径起到对离体草鱼肠道黏膜细胞的保护作用。
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