2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306
2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
维生素C，又名L-抗坏血酸，为水溶性维生素，具有较强的还原性，是天然的抗氧化剂。它可以与机体内的自由基发生氧化还原反应，生成半脱氢抗坏血酸，还原硫自由基，从而有效地清除机体内多余的活性氧和有害自由基[1]。维生素C作为抗氧化剂被广泛地应用于鱼类营养研究中，在亲鱼营养研究中维生素C是评价鱼卵和精液质量以及胚胎发育的重要指标[2, 3]。鱼类在不同的生理阶段对维生素C的需求量有很大差异，例如：NRC(1993)对虹鳟维生素C的推荐量为50 mg/kg，但Blom等[4]对虹鳟亲鱼的研究表明这个量远远低于亲鱼的需要量，大约要提高8倍才能满足亲鱼的需求。有关鱼类维生素C需求量的研究主要集中在仔幼鱼和养成鱼上，而关于维生素C对亲鱼繁殖性能及后代质量的影响等方面的研究较少。目前，只在虹鳟[5, 6]、黄河鲈[2, 7]、日本鳗鱼[8]等几种鱼类上有了部分的研究成果。而有关维生素C在亲鱼繁殖过程中的作用机理，以及不同鱼类亲鱼的维生素C最适需求量，还需要广大的学者进行大量的研究工作。
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther,1873)，属鲽形目舌鳎科舌鳎属，主要分布于渤海、黄海，是我国重要的名贵海水鱼类，也是近海增养殖对象[9]。自2002—2003年首次完成了半滑舌鳎规模化人工繁育技术的研究以来，半滑舌鳎被广泛的用于人工工厂化养殖[10]，2013年我国半滑舌鳎的总产量已达到10 000 t，产值近20亿元，是我国北方重点的海水养殖品种。近年来，在半滑舌鳎人工育苗过程中亲鱼的繁殖性能较差，以及仔稚鱼质量降低的问题越来越严重，人工育苗出苗率仅在30%左右[10, 11, 12]，并且苗种质量较差，成为制约其养殖业进一步发展的瓶颈。到目前为止，我国半滑舌鳎亲鱼养殖所用的饵料主要是冰鲜杂鱼，还没有专门的半滑舌鳎亲鱼饲料。本试验拟以3.5龄滑舌鳎亲鱼为研究对象，研究饲料中添加不同水平的维生素C对半滑舌鳎亲鱼繁殖性能及后代质量的影响，为半滑舌鳎人工育苗和亲鱼饲料配制提供技术依据。
1 材料与方法 1.1 试验用鱼本试验在海阳市黄海水产有限公司进行，试验用的3.5龄滑舌鳎亲鱼也来源于该公司。在亲鱼繁殖产卵季节前2～3个月(7月初)从亲鱼培育池中随机选出45尾性腺未明显发育的雌性亲鱼[(1.15±0.11) kg/尾)]和60尾雄性亲鱼[(0.25±0.05) kg/尾]，随机分配到3个水泥池(3.0 m×2.5 m×1.2 m)中，每个水泥池中雌鱼15尾和雄鱼20尾。
1.2 试验饲料亲鱼基础饲料以鱼粉、南极鳞虾粉为主要蛋白质源，鱼油、豆油为主要脂肪源，分别在基础饲料中添加0.5%(C0.5组)、1.0%(C1.0组)和1.5%(C1.5组)的L-抗坏血酸-2-磷酸酯(L-ascorbate-2-phosphate，作为维生素C添加剂，购于河北天寅生物技术股份有限公司,商品名“天寅-35”，有效物质含量为35%)，制成维生素C添加量分别为0.175%、0.350%和0.525%的3种试验饲料。试验饲料组成及营养水平见表1。饲料在制备前固体原料均过60目筛，L-抗坏血酸-2-磷酸酯以小料形式与预混料一起直接添加到原料中，所有原料按比例充分混匀后压制成直径为6 mm的颗粒饲料，低温烘干后储存在4 ℃冰箱中备用。
1.3 亲鱼饲养管理亲鱼池培育水深80 cm，培育用水为砂滤海水；流水培育，日换水量为培育水体的2～5倍，连续充气，培育盐度30‰～33‰，pH 7.6～8.2，溶解氧浓度≥6 mg/L，总氨氮浓度≤0.2 mg/L，水温控制在19～25 ℃；用遮光布和白炽灯调控光照强度和光照节律，光照时间由8 h逐渐变长至12 h[13]。试验开始前先暂养1周，暂养期间各试验组均投喂C0.5组饲料，暂养结束后分别投喂对应试验饲料，初期投喂量为体重的2%～3%[13]，随后观察亲鱼实际摄食量后确定最终的投喂量。试验期间每天饱食投喂2次(07:00、19:00)，投食前2.0 h和投食结束0.5 h后各排水1次，排水量约为池水的2/3，再加入砂滤海水继续流水培育，亲鱼培育期持续2个月(2013-07-01—2013-09-01)。待亲鱼培育期结束，统计出各试验组亲鱼的成活率。亲鱼培育期结束后，每个试验组选取发育良好的雌性亲鱼6尾注射促黄体素释放激素A2(LRH-A2)和雄性亲鱼10尾人工催产，统计所有产卵亲鱼的相对产卵量和雄性亲鱼的精液浓度。每个试验组取500 mL鱼卵人工受精后加入海水静置10～15 min，待卵子上下分层后，取上浮卵布入大水泥池中的3～5个孵化网箱中孵化[14]。
1.4 仔鱼培育受精卵孵化期间采用静水培育，24 h连续充气，水温控制在22～24 ℃，盐度30‰～33‰，pH 8.0～8.2，溶解氧浓度≥5 mg/L，总氨氮浓度≤0.1 mg/L，光照强度100～500 lx[14]。孵化期间每12 h吸底1次，清除沉卵。在孵化网箱中孵化30～32 h后，取上浮卵60 mL分别布入4个圆形玻璃缸(直径100 cm、高80 cm)中，每个缸布15 mL。圆形玻璃缸中培育水为砂滤海水，水深60 cm，微充气，水温控制在22～24 ℃，盐度30‰～32‰，pH 7.9～8.2，溶解氧浓度≥6 mg/L，总氨氮浓度≤0.1 mg/L；光照强度控制在500 lx以内，光线均匀、柔和[14]。再经过3～4 h后仔鱼开始破膜而出。破膜后前5天每天添加适量的海水，直至加满，之后采用流水培育；根据仔鱼的生长情况合理的控制换水率，第10天换水率约为50%， 到第20天时达到100%[13]。开口前加入小球藻保持浓度为3×108个/L左右[11]；3～15日龄投喂轮虫，每次投喂量在10个/mL左右；16～20日龄投喂卤虫无节幼体，每次投喂量为0.5～1.0个/mL，每日投喂3次[14]。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
人工催产期间取每尾产卵亲鱼产出的卵子1 mL于培养皿中，加海水统计每尾亲鱼所产卵子的上浮卵率，每尾测3次。待卵子人工受精2 h后从每个孵化网箱取100粒上浮卵统计受精率，并随机挑选10粒测量卵径及卵中大油球直径[15]，每个孵化网箱测3次。在仔鱼出膜前从孵化网箱中分别取1 mL上浮卵于加有海水的烧杯(1 L)中，3个重复，待所有仔鱼完全出膜后统计出每个烧杯中的孵化率和初孵仔鱼畸形率，每个烧杯随机挑选10尾初孵仔鱼测量体长。初孵仔鱼畸形通常是指仔鱼脊柱或尾部弯曲变形的个体[16]。
1.6 样品收集亲鱼培育期结束后，每个试验组分别取3尾雌性亲鱼和3尾雄性亲鱼称重后，采集亲鱼血液，在3 000 r/min下离心10 min后，每尾雌鱼取3 mL血清，雄鱼取2 mL血清，保存于-80 ℃待测。再将所选亲鱼解剖取性腺称重后，采集部分卵巢、精巢以及雌鱼全部肝脏保存于-80 ℃待测。人工催产期间取每尾雌鱼所产卵子10 mL和上浮卵50 mL存储于液氮中待测。
1.7 指标测定 1.7.1 常规营养成分分析干物质含量参照GB/T 6435—1986，在105 ℃烘干至恒重后通过失重法测定；粗蛋白质含量参照GB/T 6432—1994，采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量参照GB/T 6433—1994，采用索氏抽提法以石油醚为抽提液进行测定；粗灰分含量参照GB/T 6438—1992，在低温度下加热灼烧至无烟后，升温灼烧至无炭粒，然后在550 ℃的马福炉中灼烧至恒重测定；能量采用美国PARR-6100氧弹量热仪测定。
1.7.2 维生素C含量测定饲料和组织中维生素C含量测定参照Ai等[17]所述的高效液相色谱(HPLC)法测定。
饲料中维生素C含量测定前处理：取饲料5 g，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸馏水和25 mL氯仿后机械振荡25 min。取上清液30 mL移至塑料离心管中，离心5 min(2 739×g)。取1 mL上清液加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液[pH=4.8，含二硫苏糖醇(DTT)0.2%]，再加入5 mg酸性磷酸酶混匀，37 ℃水浴加热2 h后离心6 min(2 739×g)。
组织和卵子中维生素C含量测定前处理：取组织或卵约2 g放到装有9倍体积的预冷5%偏磷酸溶液的离心管中，在冰浴状态下匀浆2 min，然后离心6 min(2 739×g)。
样品中维生素C含量的测定：上清液用0.22 μm的滤膜过滤后进行HPLC分析。仪器为Agilent1-200型HPLC仪，Zobar-C18反相色谱柱，4.6 mm×250.0 mm。流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸将pH调至3.0)，流速为0.6 mL/min，检测波长为254 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL。测定前绘制好维生素C标准工作曲线。
1.7.3 酶活性和激素含量测定血清中雌二醇和睾酮含量在青岛大学附属医院检验科测定，采用罗氏Cobas-6000全自动电化学发光仪检测。血清和组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒在瑞士Tecan Infinite-M200型多功能酶标仪上检测。
1.8 计算公式
成活率=100×投放亲鱼数/培育期结束时存活亲鱼数；
相对产卵量(粒/kg)=总产卵量/亲鱼体重；
精液浓度(个/mL)=精子数/精液体积；
性腺指数(%)=100×性腺重量/亲鱼体重；
肝脏指数(%)=100×肝脏重量/亲鱼体重；
上浮卵率(%)=100×上浮卵量/总产卵量；
受精率(%)=100×受精卵数/受精2 h后的上浮卵量；
孵化率(%)=100×初孵仔鱼数/受精卵数；
初孵仔鱼畸形率(%)=100×畸形仔鱼数/仔鱼总数。
除成活率外，数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA过程进行单因素方差分析，采用Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，P<0.05为差异显著。
2 结 果 2.1 维生素C对半滑舌鳎亲鱼成活率和性腺发育的影响试验期间亲鱼对各试验饲料的适应性均较好。由表2可知，亲鱼培育期结束时各试验组雌鱼成活率均在90%以上，其中C1.5组存活率是100%；各试验组雄鱼存活率则均在85%以上，C1.0和C1.5组存活率达到了90%。雌鱼性腺指数和肝脏指数在3个试验组之间无显著差异(P>0.05)；而C1.0和C1.5组雄鱼性腺指数要高于C0.5组，其中C1.0组要显著高于C0.5组(P<0.05)，其余试验组间无显著差异(P>0.05)。雌鱼的相对产卵量随饲料中维生素C添加量的增加呈上升趋势，在C1.5组达到最大值1.68×105粒/kg，但各试验组间无显著差异(P>0.05)。雄鱼精液浓度在3个试验组间无显著差异(P>0.05)，也没有明显的变化趋势。
| 表2 维生素C对半滑舌鳎亲鱼成活率和性腺发育的影响 Table 2 Effects of vitamin C on survival rate and gonad development of tongue sole broodstocks |
由表3可知，上浮卵率随饲料中维生素C添加量的增加呈显著上升(P<0.05)，C1.5组获得最大值，达到了95.82%；3个试验组的卵径均在1.10～1.20 mm之间，但C1.0和C1.5组的卵径要显著高于C0.5组(P<0.05)，C1.0与C1.5组之间差异不显著(P>0.05)；卵中大油球直径随饲料中维生素C添加量的增加呈上升趋势，其中C1.5组显著高于C0.5组(P<0.05)；受精率在C1.0组获得最大值，为89.33%，显著高于C0.5组的64.78%(P<0.05)，相比C1.5组的87.22%无显著差异(P>0.05)；孵化率随饲料中维生素C添加量的增加显著上升(P<0.05)，其中C1.0和C1.5组均超过90.00%，C0.5组只有77.46%；各试验组的初孵仔鱼体长均在3.20～3.35 mm之间，C1.0和C1.5组的初孵仔鱼体长显著高于C0.5组(P<0.05)，C1.0与C1.5组之间差异不显著(P>0.05)；初孵仔鱼畸形率随饲料中维生素C添加量的增加显著降低(P<0.05)，C1.5组获得最小 值，为1.66%。
| 表3 维生素C对半滑舌鳎亲鱼卵子和后代质量的影响 Table 3 Effects of vitamin C on egg and offspring quality of tongue sole broodstocks |
由表4可知，随饲料中维生素C添加量的增加，雌性亲鱼肝脏中干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量基本呈现上升趋势，其中C1.5组肝脏的干物质和 粗脂肪含量要显著高于C0.5组(P<0.05)，其余各 试验组间无显著差异(P>0.05)。3种物质中，粗脂肪含量增幅比干物质和粗蛋白质含量增幅要大，干物质和粗蛋白质含量相对稳定，3组雌性亲鱼肝脏中干物质含量约为20%，粗蛋白质含量约为14%。
| 表4 维生素C对半滑舌鳎雌性亲鱼肝脏组成的影响 Table 4 Effects of vitamin C on liver composition of female broodstocks of tongue sole |
由表5可知，雌性亲鱼血清中雌二醇含量随饲料中维生素C添加量的增加呈上升趋势，C1.5组获得最大值，为7.60 nmol/L，C0.5组获得最小值，为3.98 nmol/L，其中C1.0和C1.5组要显著高于C0.5组(P<0.05)，而C1.0与C1.5组之间无显著差异(P> 0.05)；雄性亲鱼血清中睾酮含量与雌性亲鱼血清中雌二醇含量的变化趋势一致，也是随饲料中维生素C添加量的增加呈上升趋势，C1.5组获得最大值，为2.53 nmol/L，C0.5组获得最小值，为1.39 nmol/L，C1.0和C1.5组要显著高于C0.5组(P<0.05)，而C1.0与C1.5组之间无显著差异(P>0.05)。
| 表5 维生素C对半滑舌鳎亲鱼血清中雌二醇和睾酮含量的影响 Table 5 Effects of vitamin C on serum estradiol and testosterone contents of tongue sole broodstocks |
由表6可知，随饲料中维生素C添加量的增加，上浮卵中干物质、粗脂肪和维生素C含量均无显著变化(P>0.05)，各试验组上浮卵中干物质含量在7.86%～8.12%之间，粗脂肪含量在1.14%～ 1.42%之间，维生素C含量随饲料中维生素C添加量的增加有上升趋势，C1.5组获得最大值，为15.64 μg/g。上浮卵中粗蛋白质含量在C1.5组获得最大值，为4.40%，显著高于C1.0组的4.02%(P<0.05)，其余各试验组间无显著差异(P>0.05)。
| 表6 维生素C对半滑舌鳎亲鱼上浮卵组成的影响 Table 6 Effects of vitamin C on buoyant egg composition of tongue sole broodstocks |
由表7可知，随饲料中维生素C添加量的增加，半滑舌鳎亲鱼各组织和卵子中维生素C含量均增加。其中，肝脏中维生素C含量只在C0.5与C1.5组之间表现出显著差异(P<0.05)；卵巢中维生素C含量表现为C1.5组显著高于C1.0和C1.5组(P<0.05)，而C1.0与C1.5组之间无显著差异(P>0.05)；精巢中维生素C含量在3个试验组之间均有显著差异(P<0.05)；卵子中维生素C含量在3个试验组之间无显著差异(P>0.05)。同组半滑舌鳎亲鱼的不同组织及卵子中维生素C含量不同，表现为精巢<卵巢<卵子<肝脏。
| 表7 维生素C对半滑舌鳎亲鱼肝脏、卵巢、精巢和卵子中维生素C含量的影响 Table 7 Effects of vitamin C on vitamin C content in liver,ovary,testicle and egg of tongue sole broodstocks |
由表8可知，各组织及卵子和精液中SOD活性随饲料中维生素C添加量的增加而增加。其中，肝脏和精液中SOD活性随饲料中维生素C添加量的增加显著上升(P<0.05)；血清和卵巢中SOD活性在C1.5组有最大值，并显著高于C0.5和C1.0组(P<0.05)，C0.5与C1.0组之间无显著差异(P>0.05)；精巢中SOD活性在C0.5组有最小值，显著低于C1.0和C1.5组(P<0.05)；卵子中最高的SOD活性出现在C1.0组，显著高于C0.5组(P<0.05)，但与C1.5组无显著差异(P>0.05)。同组半滑舌鳎亲鱼的不同组织及卵子和精液中SOD活性不同，血清和精液要高于其他组织和卵子。
| 表8 维生素C对半滑舌鳎亲鱼血清、肝脏、卵巢、精巢、卵子和精液中SOD活性的影响 Table 8 Effects of vitamin C on SOD activity in serum,liver,ovary,testicle,egg and seminal fluid of tongue sole broodstocks |
由表9可知，各组织及卵子和精液中MDA含量与SOD活性正好相反，表现为随饲料中维生素C添加量的增加而降低。其中，血清中MDA含量随饲料中维生素C添加量的增加显著降低(P<0.05)；肝脏和精巢中MDA含量在C0.5组有最大值，并显著高于C1.5组(P<0.05)，其余各试验组间无显著差异(P>0.05)；卵巢和精液中MDA含量在C1.5组有最小值，并显著低于C0.5和C1.0组(P<0.05)，C0.5与C1.0组之间无显著差异(P>0.05)；卵子中MDA含量在C0.5组有最大值，显著高于C1.0和C1.5组(P<0.05)，而C1.0与C1.5组之间无显著差异(P>0.05)。同组半滑舌鳎亲鱼的不同组织及卵子和精液中MDA含量不同，表现为肝脏<卵巢<精巢<精液<血清<卵子。
| 表9 维生素C对半滑舌鳎亲鱼血清、肝脏、卵巢、精巢、卵子和精液中MDA含量的影响 Table 9 Effects of vitamin C on MDA content in serum,liver,ovary,testicle,egg and seminal fluid of tongue sole broodstocks |
近些年的研究表明，维生素C能增加黄河鲈雄鱼的性腺指数[7]；提高罗非鱼卵子的上浮卵率和孵化率[18]；促进虹鳟受精卵的孵化[19]；促进遮目鱼受精卵孵化并改善其卵子和幼鱼质量[3]；饲料中缺乏维生素C会严重影响亲鱼的繁殖性能和后代质量[2]；饲料中添加4 800 mg/kg维生素C可显著提高大菱鲆亲鱼性腺指数、产卵次数、上浮卵率、受精率和孵化率[20]。本试验中，半滑舌鳎亲鱼经过2个月的培育，各试验组雌鱼性腺指数和相对产卵量没有显著差异，但维生素C添加量为0.350%的组雄鱼性腺指数较维生素C添加量为0.175%的组有显著提高。在其他相关研究上也发现，饲料中添加维生素C并不能影响遮目鱼亲鱼相对产卵量[3]，却能显著提高黄河鲈雄鱼的性腺指数[7]，可见维生素C比较侧重对雄性亲鱼繁殖性能产生影响。此外，本试验中的上浮卵率、卵径、卵中大油球直径、受精率、孵化率、初孵仔鱼体长等指标随饲料中维生素C的增加均有不同程度的提高，特别是上浮卵率、受精率和孵化率，其上升幅度较大，C1.5和C1.0组相比C0.5组提高了近20%，卵子质量得到显著改善，胚胎发育成功率大大提升。有关维生素C对提高亲鱼后代质量的研究虽然不多，但也有一些比较成功的研究成果。Sandnes等[19]在虹鳟亲鱼饲料中添加115 mg/kg维生素C后发现有50%以上的个体的孵化率大于90%，而对照组仅为30%，孵化率显著提升。Dabrowski等[21]在对虹鳟亲鱼的研究中也发现当饲料中缺乏维生素C时其受精卵的孵化率会大大降低，只有16%，而添加300 mg/kg抗坏血酸-单磷酸酯后的孵化率为36%。Terova等[22]在黑鲈和真鲷的亲鱼饲料中添加2 000 mg/kg的维生素C，通过对不同孵化阶段卵子体重和维生素C含量进行生化分析，发现饲料中添加维生素C组的胚胎和仔鱼的体重相比对照组显著增加，后代质量显著提高。Lee等[7]在黄河鲈亲鱼饲料中添加250 mg/kg维生素C，养殖32周后，其受精卵的孵化率[(82±7)%]要显著高于对照组[(59±7)%]。上述研究结果与本试验结果相似，均说明维生素C能改善亲鱼卵子和仔鱼质量，尤其是提高受精卵孵化率。
维生素C与类固醇激素的生成密切相关[23]，被认为是卵泡细胞合成分泌雌激素的一种辅助因子或者与之相应的调节器[24]，能调节机体雌激素的合成与分泌，影响性腺发育。Waagbø等[25]在对虹鳟亲鱼的研究中指出，在卵巢发育期缺少维生素C，血清中卵黄生成素和17b-雌二醇的含量减少。本试验中在对半滑舌鳎亲鱼血清性激素的测定中也发现这点，检测发现雌鱼血清中的雌二醇含量和雄鱼血清中的睾酮含量均随饲料中维生素C添加量的增加而上升，但在C1.5和C1.0组之间变化不显著。这可能与机体的反馈调节有关，以防止血清中性激素含量过高。机体性激素的分泌增加有利于亲本性腺的发育，提高繁殖性能。表2和表3中的数据显示，维生素C更侧重作用于半滑舌鳎雄性亲鱼性腺的发育，对雌性亲鱼性腺发育并无明显作用，即便是提高了机体合成雌二醇的能力，雌性亲鱼性腺指数和相对产卵量也没有显著提高，可能与雌性亲鱼性腺发育受多种激素共同调节有关。
半滑舌鳎属于硬骨鱼纲的鲽形目，而硬骨鱼类缺乏维生素C合成路径中的古洛糖酸内酯氧化酶，鱼体自身无法合成维生素C[26]，必须依赖外源性的维生素C，因此半滑舌鳎代谢过程中所需的维生素C主要来自于饵料的供给。饲料中维生素C的含量直接影响机体各组织中维生素C的含量[4]。本试验对半滑舌鳎亲鱼的各组织和卵子中维生素C含量的测定结果显示，半滑舌鳎亲鱼的肝脏、卵巢和精巢以及卵子中维生素C含量均随饲料中维生素C添加量的增加而增加，这一结果与其他学者在虹鳟上的研究结果[6, 26]一致。本试验中同组半滑舌鳎亲鱼的不同组织中维生素C的含量表现为精巢<卵巢<卵子<肝脏，说明肝脏是半滑舌鳎维生素C的主要沉积部位，而虹鳟维生素C的主要沉积部位是性腺[4]，这可能与不同鱼种对维生素C的利用和转运的途径不同有关。对半滑舌鳎亲鱼而言，机体过多的维生素C主要存储在肝脏，当其他组织中维生素C供应不足时，肝脏中维生素C会被转运到该组织，以保证机体正常运转。在亲本发育期间，性腺最需要供应维生素C的，为保证性腺正常发育，肝脏中的维生素C会大量转运到性腺，再由性腺转运给配子，在本试验中，饲料中添加0.175%的维生素C很显然已经满足半滑舌鳎亲鱼正常的发育。此外，虽然机体组织中维生素C的沉积量是有限的，但是饲料中高含量的维生素C在一定程度上还是有利于提高组织中维生素C的沉积量[6]。这也解释了表7中各试验组半滑舌鳎亲鱼的各组织及卵子中维生素C含量随饲料中维生素C添加量的增加呈现上升趋势，但肝脏中维生素C含量变化较大，而卵巢和精巢变化较小，卵子相对稳定。鱼类卵子和精液中维生素C含量是评价卵子和精液质量以及胚胎发育的重要指标[2, 3]，卵黄囊需储备充足的维生素C以满足仔鱼在开口前的营养需求，提高仔鱼质量[27]。本试验中，卵子和上浮卵中的维生素C含量虽然变化不显著，但随饲料中维生素C添加量的增加其卵子中维生素C含量呈上升趋势，并且从上浮卵率、卵径、卵中大油球直径、受精率、孵化率、初孵仔鱼体长等指标上看，随饲料中维生素C添加量的增加，C1.5和C1.0组相比C0.5组卵子质量确有明显提高。饲料中添加维生素C除了可提高卵子中维生素C沉积量外，还可能影响卵子中其他物质的组成。维生素E和脂肪酸是与亲鱼繁殖性能密切相关营养元素[2]，而维生素C与维生素E、脂肪酸等物质之间存在一定的相关性。维生素C与维生素E之间存在交互作用，维生素C在一定程度上对维生素E有节约作用[7]。本试验中，肝脏中粗脂肪含量随饲料中维生素C添加量的增加而显著上升，说明维生素C可提高机体脂肪沉积量，同时亲鱼必需营养元素的变化也会从一定程度上影响卵子质量。
维生素C作为天然的抗氧化剂，可以有效地清除机体内多余的活性氧和有害自由基，维持机体正常的代谢机制[1]。表8中的SOD的活性和表9中的MDA含量数据充分体现了维生素C的抗氧化作用。将肝脏、卵巢、精巢和卵子中SOD的活性与维生素C的含量进行相关性分析，其相关系数均大于0.9，均表现出极显著的相关性。在半滑舌鳎亲鱼血清、肝脏、卵巢、精巢、卵子中，血清和精液中的抗氧化活性最强，这可能与血清和精液中维生素C含量变化的敏感程度有关。Lee等[7]在对黄河鲈雄鱼的研究中就提出饲料中维生素C含量会对精液中维生素C含量产生显著影响，而维生素C对维持精子质量有重要作用[19]，精液中的高抗氧化性能够保护精子结构的完整性，使精子中DNA不被氧化损坏，保证遗传物质的完整，提高精子质量[7, 28]，从而提高受精率。Ciereszko等[29]研究发现，用缺乏维生素C的饲料饲喂虹鳟雄性亲鱼，发现虹鳟雄性亲鱼精子质量显著降低，仔鱼的畸形率显著增加；而在本试验中也发现初孵仔鱼畸形率随饲料中维生素C添加量的增加显著下降。此外，卵子中较高的抗氧化物质能够保护细胞免受氧化损伤，特别是维护卵膜结构的完整性，也能保护卵子DNA不被氧化损坏，保证遗传物质的完整，提高卵子质量[30, 31]。
维生素C还是脯氨和赖氨酰羟化酶的辅助因子，具有催化原骨胶原分子上赖氨酸和脯氨酸羟基化，促进骨骼和皮肤的形成，促进增长的作用[32]。在本试验中，卵子的孵化率和初孵仔鱼体长随饲料中维生素C添加量的增加而显著增加，符合上述理论，但是在对上浮卵组成分析中并没有发现粗蛋白质和粗脂肪含量有显著变化，这可能是因为维生素C只影响卵子中粗蛋白质和粗脂肪的物质组成，并没有引起其总量的变化，其内在的变化机理目前尚不清楚，还需要进一步的研究。
4 结 论① 半滑舌鳎亲鱼饲料中添加维生素C对雌性亲鱼性腺发育和产卵量并没有显著的促进作用，但对亲鱼性激素的合成和雄性亲鱼性腺发育有显著的促进作用。
② 半滑舌鳎亲鱼饲料中添加维生素C可显著提高受精卵的孵化率，同时还可降低初孵仔鱼畸形率，从而改善后代质量。
③ 在本试验条件下，半滑舌鳎亲鱼的繁殖性能和后代质量与饲料中维生素C的添加量呈正相关，高添加量(0.525%)试验组表现最佳。
致谢： 感谢中国水产科学研究院黄海水产研究所食品工程与营养研究室的老师和同学，以及海阳市黄海水产有限公司亲鱼培育车间的员工们对试验所给予的帮助和对文稿所提出的宝贵意见。
| [1] | BENDICH A,MACHLIN L J,SCANDURRA O,et al.The antioxidant role of vitamin C[J]. Advances in Free Radical Biology & Medicine,1986,2(2):419-444. ( 2)
|
| [2] | DABROWSKI K,CIERESZKO A.Ascorbic acid and reproduction in fish:endocrine regulation and gamete quality[J]. Aquaculture Research,2001,32(8):623-638. (5)
|
| [3] | EMATA A C,BORLONGAN I G,DAMASO J P.Dietary vitamin C and E supplementation and reproduction of milkfish Chanos chanos Forsskal[J]. Aquaculture Research,2000,31(7):557-564. (4)
|
| [4] | BLOM J H,DABROWSKI K.Reproductive success of female rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in response to graded dietary ascorbyl monophosphate levels[J]. Biology of Reproduction,1995,52(5):1073-1080. (3)
|
| [5] | BLOMJ H,DABROWSKI K.Dietary ascorbyl phosphate results in high ascorbic acid content in eggs of rainbow trout[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Physiology,1995,112(1):75-79. (1)
|
| [6] | FALAHATKAR B,DABROWSKI K,ARSLAN M.Ascorbic acid turnover in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss:is there a vitamin enrichment effect during embryonic period on the juvenile fish "sensitivity" to deficiency?[J].Aquaculture,2011,320(1/2):99-105. (3)
|
| [7] | LEE K J,DABROWSKI K.Long-term effects and interactions of dietary vitamins C and E on growth and reproduction of yellow perch,Perca flavescens[J]. Aquaculture,2004,230(1/2/3/4):377-389. (7)
|
| [8] | FURUITA H,ISHIDA T,SUZUKI T,et al.Vitamin content and quality of eggs produced by broodstock injected with vitamins C and E during artificial maturation in Japanese eel,Anguilla japonica[J]. Aquaculture,2009,289(3/4):334-339. (1)
|
| [9] | 李思忠,王惠民.中国动物志:硬骨鱼纲、鲽形目[M]. 北京:科学出版社,1995. (1)
|
| [10] | 柳学周,庄志猛,马爱军,等.半滑舌鳎苗种生产技术的开发研究[J]. 海洋水产研究,2006,27(2):17-24. (2)
|
| [11] | 刘振华,马峰,郑世竹.半滑舌鳎人工育苗技术研究[J]. 科学养鱼,2007(9):26-27. (2)
|
| [12] | 朱丽华,王君霞.半滑舌鳎人工繁殖试验[J]. 河北渔业,2011(5):51,68. (1)
|
| [13] | 柳学周,孙中之,马爱军,等.半滑舌鳎亲鱼培育及采卵技术研究[J]. 海洋水产研究,2006,27(2):25-32. (3)
|
| [14] | 柳学周,庄志猛,马爱军,等.半滑舌鳎繁殖生物学及繁育技术研究[J]. 海洋水产研究,2005,26(5):7-14. (4)
|
| [15] | 杨景峰,陈松林,翟介明,等.半滑舌鳎人工催产技术研究[J]. 内蒙古民族大学学报:自然科学版,2010,25(2):185-190. (1)
|
| [16] | 徐永江,柳学周,马爱军,等.半滑舌鳎胚胎发育及仔鱼生长与盐度的关系[J]. 海洋科学,2005,29(11):39-43. (1)
|
| [17] | AI Q H,MAI K S,TAN B P,et al.Effects of dietary vitamin C on survival,growth,and immunity of large yellow croaker,Pseudosciaena crocea[J]. Aquaculture,2006,261(1):327-336. (1)
|
| [18] | SOLIMAN A K,JAUNCEY K,ROBERTS R J.The effect of dietary ascorbic acid supplementation on hatchability,survival rate and fry performance in Oreochromis mossambicus (Peters)[J]. Aquaculture,1986,59(3/4):197-208. (1)
|
| [19] | SANDNES K,ULGENES Y,BRAEKKAN O R,et al.The effect of ascorbic acid supplementation in broodstock feed on reproduction of rainbow trout (Salmo gairdneri)[J]. Aquaculture,1984,43(1/2/3):167-177. (3)
|
| [20] | 张海涛,梁萌青,郑珂珂,等.饲料中维生素C对大菱鲆繁殖性能的影响[J]. 渔业科学进展,2013,34(2):73-81. (1)
|
| [21] | DABROWSKI K,BLOMJ H.Ascorbic acid deposition in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) eggs and survival of embryos[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology,1994,108(1):129-135. (1)
|
| [22] | TEROVA G,SAROGLIA M,PAPP Z G,et al.Ascorbate dynamics in embryos and larvae of sea bass and sea bream,originating from broodstocks fed supplements of ascorbic acid[J]. Aquaculture International,1998,6(5):357-367. (1)
|
| [23] | TOLBERT B M,DOWNING M,CARLSON R W,et al.Chemistry and metabolism of ascorbic acid and ascorbate sulfate[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,1975,258:48-69. (1)
|
| [24] | LEVINE M,MORITA K.Ascorbic acid in endocrine systems[J]. Vitamins & Hormones,1985,42:1-64. (1)
|
| [25] | WAAGBØ R,THORSEN T,SANDNES K.Role of dietary ascorbic acid in vitellogenesis in rainbow trout (Salmo gairdneri)[J]. Aquaculture,1989,80(3/4):301-314. (1)
|
| [26] | MOREAU R,DABROWSKI K.Body pool and synthesis of ascorbic acid in adult sea lamprey (Petromyzon marinus):an agnathan fish with gulonolactone oxidase activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(17):10279-10282. (2)
|
| [27] | COWEY C B,BELL J G,KNOX D,et al.Lipids and lipid antioxidant systems in developing eggs of salmon (Salmo salar)[J]. Lipids,1985,20(9):567-572. (1)
|
| [28] | 唐黎,李辉,牟洪民,等.鱼类维生素C营养的研究概况[J]. 饲料工业,2011,32(12):56-60. (1)
|
| [29] | CIERESZKO A,DABROWSKI K,LIN F,et al.Protective role of ascorbic acid against damage to male germ cells in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,1999,56(2):178-183. (1)
|
| [30] | 艾春香,陈立侨,周忠良,等.维生素C、E对中华绒螯蟹生殖性能的影响[J]. 水产学报,2003,27(1):64-68. (1)
|
| [31] | BROMAGE N,JONES J,RANDALL C,et al.Broodstock management,fecundity,egg quality and the timing of egg production in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[J]. Aquaculture,1992,100(1/2/3):141-166. (1)
|
| [32] | BARNES M J,KODICEK E.Biological hydroxylations and ascorbic acid with special regard to collagen metabolism[J]. Vitamins and Hormons,1972,30:1-43. (1)
|