2. 广东粤海饲料集团有限公司, 湛江 524002
2. Guangdong Yuehai Feed Group Co., Ltd., Zhanjiang 524002, China
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)原产于南太平洋沿岸的暖水水域，分类学上隶属节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)软甲亚纲(Malacostraea)十足目(Decapoda)游泳亚目(Natantia)对虾科(Penaidas)对虾属(Penaeus)白对虾亚属(Lito-peuaeus)，20世纪70年代初在厄瓜多尔正式饲养成功，中国科学院海洋研究所于1988年将凡纳滨对虾引进我国大陆，并于90年代成功实现了凡纳滨对虾的人工繁育[1]。随后在我国的沿海地区进行了大规模养殖，到2012年我国对虾养殖总产量已达145万t，而凡纳滨对虾约占对虾总产量的70%以上[2]，并已成为我国三大对虾的首选养殖品种，也是目前世界上养殖产量最高的的对虾品种[3, 4]。
脂肪是对虾生长发育所必需的主要营养物质之一，不仅提供了对虾生长所需的必需脂肪酸、胆固醇及磷脂等，还参与了脂溶性维生素的吸收和在体内的运输，并作为能量物质，起到提高饲料效率和节约蛋白质的作用[5, 6, 7]，此外，有研究表明，脂肪在甲壳类动物性腺成熟、生殖发育过程中起到重要作用，尤其是在甲壳动物蜕皮生长过程中成为限制性因素之一[8, 9, 10, 11]。同时，饲料中适宜的脂肪酸水平能够提高水生动物的免疫力[12]；向枭等[13]认为适宜的饲料脂肪水平能够显著提高白甲鱼的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶(AKP)活性；Zhang等[14]对凡纳滨对虾脂肪研究中发现粗脂肪水平能够显著提高血清过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和AKP的活性；陈彦良等[15]发现当饲料添加1.5%鱼油和4.5%的豆油时，显著提高中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血清AKP、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)活性。但当摄入的粗脂肪过量时，机体内脂肪酸重新合成将受到抑制，反而会影响正常的生长发育及免疫应答[13, 16]。因此，探究甲壳动物饲料中适宜的粗脂肪需求状况显得尤为重要。迄今，凡纳滨对虾饲料中粗脂肪需要量的研究由于受到虾体规格、养殖条件等因素的影响，最适水平的推荐范围(6%~10%)较为粗糙，不足以为养殖生产提供科学依据，极大地限制了凡纳滨对虾人工全价配合饲料的研发[17]。本研究以2种规格的凡纳滨对虾为研究对象，基于生长性能、饲料利用和非特异性免疫指标的检测，以期查明不同规格凡纳滨对虾饲料中适宜的粗脂肪水平，为凡纳滨对虾人工全价配合饲料的研发提供科学依据，促进凡纳滨对虾养殖业的可持续发展。
1 材料与方法 1.1 试验饲料配制以鱼粉、酪蛋白、明胶和小麦蛋白粉为主要蛋白质源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为主要脂肪源，用鱼油和豆油调整饲料中粗脂肪水平配制成6种不同粗脂肪水平的饲料，使饲料中粗脂肪水平分别为4.02%、5.98%、7.86%、10.13%、11.29%和13.99%。试验饲料组成及营养水平见表1。按照表1将各种固态原料混合后过80目筛，维生素和矿物质等微量原料采用逐级扩大法混合，再加入鱼油、豆油和磷脂以及水混合均匀，用双螺杆挤条机压制成粒径为1.0和1.5 mm的饲料，90 ℃烘箱中熟化30 min，自然风干，饲料密封后放入-20 ℃冰箱中保存。
1.2 饲养管理养殖试验于广东粤海饲料集团东海岛试验基地进行，虾苗来源于粤海虾苗场孵化的进口1代苗。正式试验前先将所需虾苗暂养于室外水泥池(2 m×2 m×1 m)中，待虾苗长至接近试验规格时，将其转入正式试验的室内养殖系统(300 L水体的圆桶型玻璃钢桶)中继续暂养1周。暂养期间幼虾根据虾苗规格先后投喂丰年虫、虾片、粤海牌南美白对虾开口料及0号料；大规格凡纳滨对虾投喂粤海牌南美白对虾2号料。试验分组前24 h虾苗停止喂食，挑选体质健壮、规格基本一致的虾苗。本研究包括2个试验：试验一，每桶随机放养40尾幼虾[(0.58±0.01) g]；试验二,每桶随机放养30尾大规格对虾[(7.93±0.03) g]；每个试验都设6个组，分别饲喂6个不同粗脂肪水平的饲料，每个组均设3个重复。根据生产中对虾的上市规格，养殖周期设置分别为：幼虾组8周，大规格组6周。试验期间每天于07:00、11:00、17:00和21:00投喂4次，投喂1 h后观察对虾摄食情况，并根据摄食情况适当调整。试验用水为经沙滤、沉淀后的海水，连续充气，每天记录水温，每周测盐度、溶解氧及pH。试验期间水温为(26.7±1.3) ℃，水体pH为7.7±0.1，盐度为(19.4±1.7)‰，溶解氧为6.0 mg/L以上，氨氮不高于0.05 mg/L。
1.3 样品采集及分析 1.3.1 生长性能和饲料利用试验结束时饥饿24 h，称重并记录尾数，计算增重率(WG)、特定生长率(SGR)、成活率(SR)及饲料系数(FCR)。每桶随机取10尾虾，单独量体长、称体重、取血后，剥离肝胰腺并称重、记录数据。计算公式如下：
WG(%)=(终末体重－初始体重)×100/初始体重；
SGR(%/d)=100×(ln终末均重－ln初始均重)/试验天数；
SR(%)=试验结束时虾尾数×100/试验开始时虾尾数；
蛋白质效率(PER)=(终末体重－初始体重)/(饵料摄食量×粗蛋白质含量)；
FCR=投饲总量×饲料干物质含量/(终末虾总重+死虾总重－初始虾总重)；
肝体比(%)=肝胰腺重量×100/终末体重；
肥满度(g/cm3)=虾体重/(虾体长)3。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
每桶随机取5尾虾，保存于-20 ℃冰箱，用于体成分分析。饲料、全虾及肌肉：干物质含量采用105 ℃常压干燥法，粗蛋白质含量采用微量凯氏定氮法，粗脂肪含量采用索氏抽提法，粗灰分含量采用550 ℃马弗炉灼烧法。
1.3.3 血清生化指标每桶随机取10尾虾，单独量体长、称体重后，于第5步足基部血窦取血，盛于1.5 mL离心管中于4 ℃冰箱放置过夜后，5 000 r/min离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱备用。
血清中总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量均在Olympus AU 600型(日本)全自动生化分析仪上测定。
天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和SOD活性均采用南京建成生物技术有限公司试剂盒，PO活性综合王建国等[18]和Huang等[19]的方法，以0.l mol/L的磷酸钾盐缓冲液[将61.9 mL 0.1 mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4)溶液和38.1 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾(K2HPO4)溶液混合，稀释至1 L，调pH=6.6]为溶剂，配制浓度为3 mg/mL的左旋多巴(L-DOPA)溶液。室温下将20 μL血清和980 μL L-DOPA溶液混匀，取300 μL于96孔板中， 准确测定6 min时在490 nm波长下吸光度(OD)值记为OD490 nm，同时取300 μL的L-DOPA液作为空白测其OD值记为OD0。PO活性定义为：每毫升样品每分钟OD值增加0.001为一个酶活力单位，PO活性计算公式为：
PO=[(OD490 nm-OD0)/6/0.001]×1 000/20。
1.4 数据统计分析试验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并结合Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05表示组间差异显著。基于SGR进行折线模型拟合，进而评估对虾的适宜脂肪需要量。
2 结 果 2.1 饲料粗脂肪水平对2种规格凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响基于SGR折线模型拟合获得，凡纳滨对虾养成期2个生长阶段获得最大SGR时，饲料中粗脂肪水平分别为4.83%(图1)和5.57%(图2)，基于生长性能，建议对虾2个生长阶段粗脂肪适宜需要量分别4.83%~5.98%和5.57%~7.86%。
 | 图1 饲粮粗脂肪水平与凡纳滨对虾幼虾特定生长率的拟合折线模型 Fig. 1 Fitting broken line model between dietary crude lipid level and SGR of juvenile Litopenaeus vannamei |
 | 图2 饲粮粗脂肪水平与大规格凡纳滨对虾特定生长率的拟合折线模型 Fig. 2 Fitting broken line model between dietary crude lipid level and SGR of large size Litopenaeus vannamei |
由表2、表3可知，凡纳滨对虾SR均在91.7%以上，且2个试验中饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾SR均无显著影响(P＞0.05)；幼虾组和大规格组中，WG和SGR随粗脂肪水平的增加先上升后下降，在5.98%粗脂肪组达到最大值，且显著高于10.13%、11.29%和13.99%粗脂肪组(P＜0.05)；饲料粗脂肪水平显著影响PER(P＜0.05)，均在5.98%粗脂肪组获得最大值；5.98%粗脂肪组幼虾FCR显著低于11.29%粗脂肪组(P＜0.05)，达到最小值，5.98%粗脂肪组大规格对虾FCR显著低于10.13%、11.29%和13.99%粗脂肪组(P＜0.05)，达到最小值；幼虾组饲料粗脂肪水平显著影响凡纳滨对虾肝体比和肥满度(P＜0.05)，在5.98%粗脂肪组达到肝体比最小值，并取得较高的肥满度；而大规格组中饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾肝体比和肥满度无显著影响(P＞0.05)。
| 表2 饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾幼虾生长性能和饲料利用的影响 Table 2 Effects of dietary crude lipid level on growth performance and feed utilization of juvenile Litopenaeus vannamei |
| 表3 饲料粗脂肪水平对大规格凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响 Table 3 Effects of dietary crude lipid level on growth performance and feed utilization of large size Litopenaeus vannamei |
由表4可知，幼虾组，饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾幼虾全虾干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量及肌肉干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量无显著影响(P＞0.05)，但是显著影响肌肉粗灰分含量(P<0.05)，并在4.02%粗脂肪组达到最大值。
| 表4 饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾幼虾全虾及肌肉主要成分的影响 Table 4 Effects of dietary crude lipid level on main composition of whole body and muscle of juvenile Litopenaeus vannamei |
由表5可知，大规格组，饲料粗脂肪水平对大规格凡纳滨对虾全虾粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分含量无显著影响(P＞0.05)，但显著影响全虾干物质含量(P<0.05)，并在10.13%粗脂肪组时出现最大值；饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾肌肉干物质、粗灰分含量无显著影响(P＞0.05)，但显著影响肌肉粗蛋白质含量(P＜0.05)，且肌肉粗蛋白质含量随饲料粗脂肪水平的升高呈先升高后降低的趋势，在10.13%粗脂肪组时达到最大值；饲料粗脂肪水平显著影响肌肉粗脂肪含量(P＜0.05)，并在4.02%粗脂肪组达到最小值。
| 表5 饲料粗脂肪水平对大规格凡纳滨对虾全虾及肌肉主要成分的影响 Table 5 Effects of dietary crude lipid level on main composition of whole body and muscle of larger size Litopenaeus vannamei |
由表6可知，幼虾组，饲料粗脂肪水平显著影响凡纳滨对虾幼虾血清TP含量和SOD活性(P＜0.05)，二者均随饲料粗脂肪水平的增加呈先升高后降低的趋势，血清TP含量在5.98%粗脂肪组达到最大值，SOD活性在7.86%粗脂肪组时达到最大值；饲料粗脂肪水平显著影响血清TC含量、ALT、AST和PO活性(P＜0.05)，其中PO活性随饲料粗脂肪水平升高呈下降趋势，ALT活性随饲料粗脂肪水平的增加呈先下降后上升趋势，在饲料10.13%粗脂肪组时达到最小值；饲料粗脂肪水平对血清TG含量无显著影响(P＞0.05)；
| 表6 饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾幼虾血清生化指标的影响 Table 6 Effects of dietary crude lipid level on biochemical indexes in serum of juvenile Litopenaeus vannamei |
由表7可知，大规格组，饲料粗脂肪水平显著影响大规格凡纳滨对虾血清SOD、ALT、AST、PO活性(P＜0.05)，其中在5.98%粗脂肪组中ALT活性达到最大值，PO活性随饲料粗脂肪水平的升高呈上升趋势。
| 表7 饲料粗脂肪水平对大规格凡纳滨对虾血清生化指标的影响 Table 7 Effects of dietary crude lipid level on biochemical indexes in serum of large size Litopenaeus vannamei |
本研究发现，饲料粗脂肪水平显著影响了不同生长阶段凡纳滨对虾的生长性能和饲料利用情况，基于SGR的折线模型拟合获得幼虾和大规格对虾饲料中粗脂肪的适宜需要量分别为4.83%~5.98%和5.57%~7.86%。对甲壳类动物脂肪需求的研究结果中，黄凯等[20]报道了体质量为9.8 g的凡纳滨对虾的粗脂肪需要量为8.47%；Sheen等[21, 22, 23, 24]研究罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeus chinensis)和锯缘青蟹(Scylla serrata)发现其粗脂肪适宜需要量介于2%~10%；Deshimaru等[25]发现日本对虾摄食含6%鱼油和豆油混合油组能够获得最大生长性能；Glencross等[26]认为在必需脂肪酸满足需求情况下，饲料中添加7.5%的脂肪斑节对虾即能达到最佳生长，本研究结果与已有的研究结果相似。但也有报道称，以含3%、6%和9%这3个不同粗脂肪水平的饲料投喂凡纳滨对虾，生长性能并未发现显著差异[27]。Kanazawa等[28]用含8%青鳕鱼油和菲律宾蛤仔油的饲料投喂日本对虾(Penaeus japonicus)，发现其生长性能显著优于其他组；此外，本研究还发现，当饲料粗脂肪水平在5.98%~13.99%时，凡纳滨对虾WG及SGR呈不断下降的趋势。Sheen等[24]认为下降趋势的出现可能是由于脂肪的过量摄入影响了蛋白质及其他营养素的摄入，从而导致饲料转化效率降低，影响对虾的生长。然而，也有报道与本研究的发现不完全一致。Zhang等[14]发现当饲料中粗脂肪水平为10%~12%时，凡纳滨对虾的免疫和生长性能显著提高，试验进行到30 d时WG和SGR最大组出现在粗脂肪水平为12%的试验组，到60 d时，WG和SGR最大组为粗脂肪水平10.13%的试验组。出现这些差异的原因可能与饲料脂肪源的选择有关。王恒等[29]研究结果表明在饲料中添加相同水平的不同脂肪源时，1.5%豆油+1.5%亚麻油组罗氏沼虾WG最大，但FCR却不是最小的；Lim等[30]对凡纳滨对虾脂肪源研究结果表明，不同脂肪源的促生长效果依次是鲱鱼油>亚麻籽油>豆油>玉米油>硬脂酸油>椰子油>红花油。此外，饲料配方、养殖环境、养殖方式等也会对试验结果造成不同程度的影响。
González-Félix等[31]研究结果认为，饲料中过高的粗脂肪添加水平(10.5%)并不会对凡纳滨对虾SR产生负面影响，这与本研究的结果是一致的。幼虾组和大规格组随着饲料粗脂肪水平的升高，对虾SR各组间无显著差异。然而，Akiyama等[32]报道，当饲料粗脂肪水平超过10%时，会造成对虾的SR下降。影响对虾SR的因素较多，包括饲养条件、饲料原料及养殖环境等，而饲料中粗脂肪水平只是诸多影响因素之一。本研究发现，幼虾组体脂肪含量并未受到饲料粗脂肪水平的影响，但大规格组虾体及肌肉粗脂肪含量随饲料粗脂肪水平的升高呈上升趋势。前人的研究发现，饲料粗脂肪水平并未对锯缘青蟹幼蟹体粗灰分造成显著影响[24]，也未影响对虾幼虾肌肉中粗脂肪含量[33]，但却在大规格的虾体中发现，过量的粗脂肪摄入会造成对虾肌肉中脂肪富集现象[27]。饲料粗脂肪水平对甲壳类幼体肌肉粗脂肪含量影响不显著，却能显著提高脂肪在大规格甲壳动物肌肉中的沉积。
3.2 饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾血清生化指标的 影响动物处于正常生理状态下，机体能够维持各项生理指标的动态稳定，而血液组成的变化在一定程度上能够反映出动物此时的健康状态[34]。本研究发现，试验一结果表明，血清中TP含量随着饲料粗脂肪水平的升高呈先上升后下降趋势，而下降趋势与粗脂肪的过量摄入有关，机体需要提供更多的载体蛋白转运多余的脂肪粒，会对正常的生理代谢造成一定的能量需求压力。此外，血清中TC含量随着饲料粗脂肪水平的升高呈上升趋势，Ding等[35]认为胆固醇和TG含量升高表明动物内生脂肪转运活跃，是脂肪运输系统对高脂饲料的应答反应。AST和ALT活性是反映肝脏损伤程度的指标，AST和ALT是机体代谢必不可少的酶类，在平衡机体氨基酸“池”以及蛋白质、脂肪与糖之间物质转化中发挥非常重要的作用[36]，血清中ALT和AST活性水平的高低可以敏感地反映肝细胞损伤的程度[37]。在本研究中，幼虾组和大规格组血清中AST活性呈逐渐升高的趋势，幼虾组血清中ALT活性随饲料粗脂肪水平的增加呈先下降后上升趋势，而大规格组血清中ALT活性在饲料粗脂肪为5.98%时最高。本研究提示，虽然不同规格的对虾生长最适粗脂肪水平为5.98%，但粗脂肪水平对健康的影响程度与表观生长性能指标并不完全一致，在考虑最适需要量的推荐范围时，应将健康指标也纳入参考范围。
PO是一种含铜的氧化还原酶，它在甲壳动物血细胞内以酚氧化物酶原的形式存在，能够被一些蛋白质或多糖激活而转变成活性的酚氧化物酶。PO活性是衡量甲壳类机体免疫功能的重要指标，PO除了参与机体的免疫机制以外，还参与甲壳动物蜕皮过程中的硬化作用及伤口新表皮的硬化[38, 39]。本研究中，饲料粗脂肪水平对幼虾和大规格凡纳滨对虾PO活性的影响不一致，幼虾组PO活性随着饲料粗脂肪水平的增加有下降的趋势，而大规格组PO活性随着饲料粗脂肪水平的增加有上升的趋势，该结果提示，饲料粗脂肪水平对不同规格对虾免疫应答能力的影响并不完全相同。Zhang等[14]发现凡纳滨对虾血清PO转录对饲料粗脂肪水平较敏感，并在饲料粗脂肪水平为13.75%时转录水平最大，这与大规格组试验得出的结果类似，大规格的对虾需要摄入更多的脂肪以提高其非特异性免疫能力。SOD具有催化超氧离子自由基歧化反应的功能，是机体清除氧自由基重要的抗氧化保护酶，促使自由基的形成和清除处于动态平衡，清除自由基对机体的危害，从而保护细胞免受损伤[40, 41, 42]。然而，当超氧阴离子的量超过一定阈值时，SOD活性将受到抑制，过量的自由基会造成过氧化损伤，影响机体的免疫应答能力[43]。本研究发现，对虾血清SOD活性随着饲料中粗脂肪水平的提高呈先升高后降低的趋势，其中活性下降可能是由于粗脂肪的过量摄入，导致机体发生了过氧化反应，过氧化产物如醛、酮类物质与细胞膜发生交联聚合反应，破坏细胞膜的通透性和黏附性，从而给机体免疫系统带来负面影响[44, 45]。
4 结 论本研究提示，饲料粗脂肪水平对凡纳滨对虾生长性能、饲料利用和非特异性免疫指标的影响显著，基于SGR与饲料粗脂肪水平的折线模型拟合后获得幼虾和大规格对虾生长适宜粗脂肪需要量分别为4.83%~5.98 %和5.57%~7.86%。
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