蜜蜂是全变态发育的昆虫，个体发育需经过卵、幼虫、蛹和成虫4个时期，其中幼虫期营养尤其是粗蛋白质营养对蜜蜂的生长发育和健康至为关键。人工饲养蜜蜂幼虫技术能够排除哺育蜂的干扰并可人为控制幼虫饲粮成分，因此，探究人工饲养条件下蜜蜂幼虫饲粮的适宜粗蛋白质水平具有重要意义。1987年，Vandenberg等^[1]利用蜂王浆(50%)、葡萄糖(6%)、果糖(6%)、酵母提取物(1%)和无菌水(37%)配制成幼虫基础饲粮(basic larval diet，BLD)饲喂幼虫，成功建立了人工饲养蜜蜂幼虫技术。如今，这项技术进一步完善^{[2, 3, 4, 5, 6]}，并广泛应用在幼虫病菌感染、杀虫剂风险评估、级型分化以及基础研究等领域^{[7, 8, 9, 10, 11]}。但是，上述研究所用的幼虫饲粮配方都是在BLD基础上进行微调，人工饲养条件下的幼虫营养研究甚少，幼虫饲粮适宜粗蛋白质水平的研究更是未见报道。酶水解酪蛋白较易溶于水，富含蛋白质及氨基酸，因此，本研究选用酶水解酪蛋白为外源粗蛋白质，以人工饲养的意大利蜜蜂幼虫为研究对象，通过探究不同粗蛋白质水平对幼虫生长发育、抗氧化活性和卵黄原蛋白(vitellogenin，Vg)基因表达的影响，以期改进幼虫饲粮配方，明确意大利蜜蜂幼虫饲粮的适宜粗蛋白质水平，从而填补蜜蜂幼虫营养研究的空白，进一步丰富蜜蜂营养学研究。

对照组参照Vandenberg等^[1]的配方配制 BLD，粗蛋白质水平为8%，试验组在其基础上分 别添加不同剂量的酶水解酪蛋白(粗蛋白质水平为77.83%)，使各组粗蛋白质水平为9%、10%、11%和12%。幼虫饲粮组成及营养水平见表1。配制好的幼虫饲粮4 ℃保存，3 d内使用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 幼虫饲粮组成及营养水平(鲜重基础) Table 1 Composition and nutrient levels of larval diets (fresh basis) % 项目Items 粗蛋白质水平 Crude protein level/% 8 9 10 11 12 原料 Ingredients 蜂王浆 Royal jelly 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 葡萄糖 Glucose 6.0 5.6 4.9 4.2 3.6 果糖 Fructose 6.0 5.6 4.9 4.2 3.6 酵母提取物 Yeast extract 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 酶水解酪蛋白 Casein enzymatic hydrolysate 0.8 2.0 3.3 4.5 无菌水 Sterile water 37.0 37.0 37.2 37.3 37.3 合计 Total 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 营养水平 Nutrient levels 总能 GE/(kJ/g) 6.36 6.38 6.37 6.38 6.40 粗蛋白质 CP 8.44 9.06 9.99 11.00 11.94 营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

表1 幼虫饲粮组成及营养水平(鲜重基础) Table 1 Composition and nutrient levels of larval diets (fresh basis)

试验材料为48孔细胞培养板，每个孔中放入灭菌的塑料人工王台。试验对象为1日龄意大利蜜蜂幼虫960只，共分5组，每组4个重复，每个重复48只幼虫。试验所选用蜂群均为双王群，蜂王为浆王。试验前向双王群巢箱2个室的中间部位分别插入1张空脾，将蜂王限定在此区域产卵。12~18 h后，检查产卵情况，并将产卵巢脾移入继箱孵化。蜂卵孵化期一般为3 d^[12]，因此，在第4天即可将孵化的1日龄幼虫移至盛有100 μL预热饲粮的人工王台中，次日转移幼虫。幼虫期温度为34.5 ℃，相对湿度为95%。在人工饲养的第6天末或第7天初，开始有幼虫直立于王台中或观察到排便现象时，将幼虫转移至铺有灭菌纸的24孔细胞培养板中准备化蛹。蛹期温度不变，相对湿度为75%。预蛹期3 d排便后，更换新的化蛹板直至发育成新出房工蜂(图1)。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 意大利蜜蜂幼虫人工饲养条件下各发育阶段图 Fig. 1 Images of honey bee larvae reared in vitro in each development stage

试验开始后，每天检查并记录幼虫或蛹的成活情况，将死亡的个体及时移出，直至未死亡的蛹全部羽化出房为止，统计幼虫化蛹率和蛹羽化率。

每个组随机选取6日龄幼虫、3日龄蛹和新出房工蜂各8只放入已称重的1.5 mL离心管中，每个组共计8个重复，用电子天平称重并记录数据。之后，将样品贮存于-80 ℃，用于后续指标的测定。

将6日龄幼虫、3日龄蛹和新出房工蜂按重量体积比加入生理盐水制备成10%的组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清备用，再按测定需要稀释为相应浓度的组织匀浆。分别选用黄嘌呤氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；Fe³⁺还原法测定总抗氧化能力(T-AOC)，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用UV-2450紫外分光光度计测定吸光度。

6日龄幼虫和3日龄蛹样品用匀浆机打碎，新出房工蜂样品用液氮研磨后，采用Trizol法提取总RNA，并用微量分光光度计检测浓度和纯度。根据PrimeScript^TM RT reagent Kit [Perfect Real Time] TaKaRa Code:DRR037A试剂盒，将总RNA反转录为cDNA。采用20 μL体系进行反转录，37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 s，1个循环。反转录产物保存于-20 ℃。参照GenBank上已发表的 基因序列，采用DNAMAN 6.0设计引物(表2)，由上海生工生物工程公司合成。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实时定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time qPCR 基因 Genes 引物序列 Primer sequences (5′—3′) 产物长度 Product length/bp GenBank登录号 GenBank accession No. 卵黄原蛋白Vg F:CCAGCAGCGAGGAGAACGR:TTGCGTGAACGGGGATGT 204 NM_001011578 β-肌动蛋白β-actin F:CCGTGATTTGACTGACTACCTR:AGTTGCCATTTCCTGTTC 142 NM_001185145

表2 实时定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time qPCR

采用SYBR Premix Ex Taq^TM [Perfect Real Time] TaKaPa Code:DRR420A试剂盒，反应体系为20 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 s，循环数为1；95 ℃变性5 s，60 ℃退火40 s，循环数为40；添加熔解曲线，循环数为1。在制作的标准曲线基础上，选定适宜的稀释倍数，进行目的基因扩增。每个样品做3次重复，利用2^-ΔΔCt计算Vg基因与内参基因β-肌动蛋白的相对表达量，确定Vg基因的相对表达量。

采用SAS 9.2软件进行统计学分析，结果以平均值±标准差表示。方差分析使用one-way ANOVA,多重比较采用Duncan氏法,显著性水平为P<0.05 。

由表3可知，幼虫饲粮粗蛋白质水平对化蛹率和羽化率影响显著(P<0.05)。粗蛋白质水平8%~10%组的化蛹率显著高于11%和12%组(P<0.05)，粗蛋白质水平9%、10%组与对照组差异不显著(P>0.05)。粗蛋白质水平为12%时，蛹不能成功羽化，且粗蛋白质水平11%组的羽化率显著低于8%~10%组(P<0.05)。此外，粗蛋白质水平为9%时，化蛹率和羽化率均最高。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 幼虫饲粮粗蛋白质水平对化蛹率和羽化率的影响 Table 3 Effects of crude protein level in larval diets on the percentages of pupation and eclosion % 粗蛋白质水平 Crude protein level/% 化蛹率 Percentage of pupation 羽化率 Percentage of eclosion 8 86.81±3.42a 71.18±5.59a 9 89.58±2.76a 75.00±4.34a 10 85.42±1.20a 65.28±6.26a 11 60.07±5.46b 28.13±5.14b 12 29.86±4.67c 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05). The same as below.

表3 幼虫饲粮粗蛋白质水平对化蛹率和羽化率的影响 Table 3 Effects of crude protein level in larval diets on the percentages of pupation and eclosion

由表4可知，幼虫饲粮粗蛋白质水平对6日龄幼虫体重影响显著(P<0.05)。随粗蛋白质水平升高，幼虫体重呈现先上升后下降的趋势，且粗蛋白 质水平为9%~11%时，幼虫体重相当并显著高于 12%组(P<0.05)；对照组与各试验组之间差异不显著(P>0.05)。3日龄蛹体重表现为粗蛋白质水平9%~11%组显著高于对照组(P<0.05)。幼虫饲粮粗蛋白质水平对新出房工蜂的体重影响不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 幼虫饲粮粗蛋白质水平对幼虫、蛹、新出房工蜂体重的影响 Table 4 Effects of crude protein level in larval diets on body weight of larvae,pupae and newly emerged workers mg 粗蛋白质水平 Crude protein level/% 体重 Body weight 6日龄幼虫 Larvae at 6 days of age 3日龄蛹 Pupae at 3 days of age 新出房工蜂 Newly emerged workers 8 136.30±6.39ab 133.36±2.17b 118.63±6.82 9 152.74±5.15a 142.93±1.68a 118.21±3.92 10 153.24±5.49a 144.36±2.51a 136.57±3.59 11 151.78±5.92a 144.68±2.86a 123.75±5.25 12 132.73±6.06b

表4 幼虫饲粮粗蛋白质水平对幼虫、蛹、新出房工蜂体重的影响 Table 4 Effects of crude protein level in larval diets on body weight of larvae,pupae and newly emerged workers

由表5可知，粗蛋白质水平影响6日龄幼虫虫体SOD活性。随粗蛋白质水平升高，SOD活性呈现先上升后降低的趋势，且粗蛋白质水平10%组SOD活性最高，显著高于对照、9%和12%组(P<0.05)；粗蛋白质水平11%组与各组差异不显著(P>0.05)。T-AOC活性表现为除9%组外，其他各组显著高于对照组(P<0.05)。3日龄蛹SOD活性随粗蛋白质水平升高而降低，对照组与9%组差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他试验组(P<0.05)。3日龄蛹各组T-AOC差异不显著(P>0.05)。新出房工蜂的T-SOD活性与3日龄蛹相似，随粗蛋白质水平升高而降低，且对照组与9%组差异不显著(P>0.05)。新出房工蜂的T-AOC也受粗蛋白质水平的影响，表现为9%组T-AOC最高，显著高于11%组(P<0.05)，但与其他组差异不显著(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 幼虫饲粮粗蛋白质水平对幼虫、蛹和新出房工蜂的抗氧化活性的影响 Table 5 Effects of crude protein level in larval diets on antioxidant activities of larvae,pupae and newly emerged workers U/mg port 粗蛋白质水平 Crude protein level/% 6日龄幼虫 Larvae at 6 days of age 3日龄蛹 Pupae at 3 days of age 新出房工蜂 Newly emerged workers 超氧化物歧化酶SOD 总抗氧化能力 T-AOC 超氧化物歧化酶SOD 总抗氧化能力 T-AOC 超氧化物歧化酶SOD 总抗氧化能力 T-AOC 8 62.58±2.81b 41.68±2.92c 91.51±2.22a 79.27±2.94 123.07±5.08a 178.24±11.65a 9 64.74±3.20b 47.69±6.10bc 84.26±2.30ab 83.05±2.78 110.23±4.23ab 186.85±2.98a 10 75.17±2.01a 57.43±3.64ab 80.26±2.65bc 78.25±0.81 88.39±11.44bc 153.66±15.97ab 11 69.23±2.95ab 61.69±4.02a 74.65±0.88c 77.57±2.04 81.90±4.60c 132.09±10.92b 12 64.23±2.92b 59.03±4.09ab

表5 幼虫饲粮粗蛋白质水平对幼虫、蛹和新出房工蜂的抗氧化活性的影响 Table 5 Effects of crude protein level in larval diets on antioxidant activities of larvae,pupae and newly emerged workers

由表6可知，Vg基因在幼虫和蛹的相对表达量很低，在新出房工蜂急剧升高。粗蛋白质水平显著影响6日龄幼虫Vg基因相对表达量(P<0.05)，表现为粗蛋白质水平9%、10%组显著高于对照组与12%组(P<0.05)，11%组与各组差异不显著(P>0.05)。3日龄蛹粗蛋白质水平9%组显著高于对照组与11%组(P<0.05)，但与10%组差异不显著(P>0.05)。新出房工蜂的Vg基因表达量是幼虫和蛹的上千倍，但是各组之间差异不显著(P>0.05)。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 幼虫饲粮粗蛋白质水平对不同发育阶段蜂体Vg基因相对表达量的影响 Table 6 Effects of crude protein level in larval diets on Vg gene relative expression level in different development stages 粗蛋白质水平 Crude protein level/% Vg基因相对表达量 Vg gene relative expression level 6日龄幼虫 Larvae at 6 days of age 3日龄蛹 Pupae at 3 days of age 新出房工蜂 Newly emerged workers 8 1.00±0.14b 0.31±0.04b 903.21±23.72 9 1.50±0.17a 0.47±0.04a 1 177.73±148.54 10 1.48±0.11a 0.34±0.06ab 1 181.87±148.04 11 1.23±0.16ab 0.25±0.02b 1 098.08±172.46 12 0.97±0.13b

表6 幼虫饲粮粗蛋白质水平对不同发育阶段蜂体Vg基因相对表达量的影响 Table 6 Effects of crude protein level in larval diets on Vg gene relative expression level in different development stages

蜜蜂与其他动物一样，需要摄入蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、矿物质和水等营养物质以满足个体正常生长发育所需^[6]。李成成等^[13]通过大群试验发现，不同粗蛋白质水平的人工代用花粉影响蜂群的蜂卵孵化率和幼虫化蛹率，且饲粮粗蛋白质水平占代用花粉干重的30%~35%时，孵化率和化蛹率达到最佳水平。Aupinel等^[3]通过人工饲养幼虫技术，每天饲喂1~2日龄幼虫10 μL饲粮，之后每天递增10 μL并在一定范围内提高饲粮中糖和酵母提取物的含量，由此化蛹率和羽化率得到提高。Huang^[4]较为系统地阐述了室内饲养幼虫的具体方法，且此方法的幼虫化蛹率可达92.9%，羽化率可达79.2%。本试验中粗蛋白质水平8%、9%组的试验结果与之接近，化蛹率和羽化率相对偏低与环境条件的制约及操作的熟练程度等有关。此外，当粗蛋白质水平超过10%时，化蛹率和羽化率显著降低，说明粗蛋白质水平过高时不利于幼虫的健康生长，甚至导致幼虫不能成功羽化。

幼虫阶段是采食和生长的关键阶段，幼虫蜕皮时，粗蛋白质可为新表皮的产生提供物质基础；幼虫后期开始的变态发育过程也必须从饲粮或其他组织中获取粗蛋白质^[14]。试验结果显示，人工饲养条件下6日龄幼虫的体重在132.73~153.24 mg，这与文献中工蜂幼虫最大体重为144~162 mg的试验结果相符^[15]。幼虫在排便后进入预蛹期，此后不再有饲粮供给，且发育过程中离不开新陈代谢，所以蛹期体重在一定程度上下降，试验结果符合预期及生物学规律。

相关研究表明，蜜蜂体重尤其是新出房工蜂的体重，明显受蜂群营养状态的影响^[16]。因此，工蜂初生重是衡量个体质量的重要指标。本试验结果显示，人工饲养条件下新出房蜜蜂体重在118.21~136.57 mg，而自然蜂群的工蜂初生重范围是81~151 mg^{[17, 18]}，结合形态学观察，进而验证了此方法培育的新出房蜜蜂全部为工蜂。幼虫饲粮粗蛋白质水平对新出房工蜂的体重影响不显著，原因可能是经过了较长时间的蛹期，蜂体已适应相应的粗蛋白质水平，只要能够成功羽化，就说明此粗蛋白质水平可被蜜蜂接受。

动物机体在正常代谢时会产生氧自由基，但体内抗氧化酶能迅速清除这些有害物质以保证动物健康^[19]。SOD作为机体一类重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子转化为过氧化氢和分子氧，从而抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应^[20]。T-AOC代表了机体防御体系中各种抗氧化酶共同作用的强弱程度。一般认为，蜜蜂机体抗氧化能力的降低是导致其行为衰老和寿命缩短的重要原因^[21]。

本试验结果显示，机体的抗氧化能力受到幼虫饲粮粗蛋白质水平的影响。6日龄幼虫饲粮粗蛋白质水平为10%或11%组有更高的SOD活性和T-AOC。但对3日龄蛹和新出房工蜂而言，均表现为对照组SOD活性最高，粗蛋白质水平9%组T-AOC最高，且对照组与9%组在抗氧化能力方面没有显著差异。由此说明，对6日龄幼虫而言，饲粮中添加一定外源粗蛋白质提高粗蛋白质水平后，幼虫虫体的抗氧化活性增强。但随着机体的发育，过高的粗蛋白质水平对蜂体的不利影响逐渐显现，表现为粗蛋白质水平在8%~9%时，机体能更好地发挥抗氧化作用。推测原因，可能是适量的蛋白质供给能使机体更有效地清除自由基，以调节机体正常的氧化还原反应^[13]。表5中还可以看出，3日龄蛹的T-AOC高于6日龄幼虫，而新出房工蜂的活性最高。而一些研究显示，相关抗氧化酶活性在个体发育中呈现先降低后升高的趋势，且蜜蜂的抗氧化酶基因在蛹期表达量最低^{[22, 23]}。本试验结果与之有出入，这可能与各阶段不同的取样日龄、不同的饲养方式和个体生理代谢等因素有关。

在昆虫中，Vg由脂肪体合成后释放入血淋巴，并通过内吞作用被卵母细胞摄取，最终转化为卵黄蛋白，为胚胎发育供能^[24]。对蜜蜂而言，Vg不仅可以在蜂王体内合成，在工蜂和雄蜂体内也能合成^[25]。由此说明，Vg除与繁殖有关外，还具有其他功能。随着分子生物学的发展和广泛应用，大量研究发现，Vg还具有气候适应、生殖竞争、劳动力分化、行为构建和延长生命等多种功能^[26]。

本试验中，幼虫和蛹Vg基因相对表达量很低，而新出房工蜂期急剧升高，这与前人利用Northern-blot得到的试验结果相符^{[27, 28]}。这可能与保幼激素和蜕皮激素的调节有关。有研究显示，工蜂体内低剂量的保幼激素是导致Vg水平升高的原因之一。此外，蜕皮激素在蛹期下降，能够抑制Vg的合成，使蛹期Vg基因相对表达量显著降低^[29]。本试验结果表明，粗蛋白质水平影响幼虫和蛹的Vg基因相对表达量，但对新出房工蜂没有显著影响。不过，在蜂体发育的各阶段，均表现为粗蛋白质水平9%、10%组Vg基因相对表达量较高。由此说明，营养状况会影响蜜蜂Vg基因相对表达量，Vg的合成与粗蛋白质的摄入相关^[30]，且适宜的粗蛋白质水平能够提高蜂体Vg基因相对表达量。

① 人工饲养条件下，幼虫饲粮粗蛋白质水平影响幼虫化蛹率、蛹羽化率以及蜜蜂不同发育阶段的体重、抗氧化活性和Vg基因相对表达量。

② 当添加酶水解酪蛋白作为外源粗蛋白质时，意大利蜜蜂幼虫能够健康生长发育的适宜幼虫饲粮粗蛋白质水平为8%~10%。