2. 河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002;
3. CAAS-ICRAF农用林业与 可持续畜牧业联合实验室, 北京 100193;
4. 东北农业大学, 食品安全与营养协同创新中心, 哈尔滨 150030
2. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
3. CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandr, Beijing 100193, China;
4. Synergetic Innovation Center of Safety and Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
microRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNAs，它能够在转录后调节基因表达，从而影响多种生物学过程，包括细胞增殖[1]、分化[2]、凋亡[3]、发育[4]。microRNA-145(miR-145)由于其在肿瘤和癌症方面的抑制作用而引起人们的关注。在许多人类癌症中都观察到miR-145表达的下调，包括前列腺癌[5]、膀胱癌[6]、结肠癌[7]。2007年Gu等[8]首次在荷斯坦奶牛乳腺组织中发现了miR-145的存在。Wang等[9]在对不同泌乳阶段乳腺组织中miRNAs的表达谱进行检测时发现，miR-145在分娩前后，即泌乳启动阶段，表达变化差异显著。这提示bta-miR-145可能在奶牛泌乳启动或乳成分合成过程中发挥一定作用。
目前，对bta-miR-145靶基因的研究甚少，没有明确得到鉴定的靶基因的信息。为了研究bta-miR-145在泌乳过程中的功能，本研究首先使用TargetScan 6.2软件预测bta-miR-145潜在的靶基因，结果发现与乳蛋白合成相关的胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、胰岛素受体底物1(IRS1)和β-酪蛋白(CSN2)位列其中。Shi等[10]研究证明，hsa-miR-145可以通过靶向人的IGF1R和IRS1基因发挥功能。miRNAs常常靶向同一信号通路中的多个靶基因[11]，IGF1R、IRS1和CSN2都位于胰岛素样生长因子1受体-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(IGF1R-PI3K-Akt/mTOR)信号通路。在正常情况下，PI3K-Akt/mTOR信号通路受上游酪氨酸激酶受体调节，尤其是IGF1R[12]，而下游mTOR信号通路对乳蛋白合成起着核心作用[13]。因此，有必要开展bta-miR-145对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路作用的研究。本试验选择原代奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，通过转染bta-miR-145过表达模拟物(mimic)取得bta-miR-145过表达作用，转染bta-miR-145抑制表达模拟物(inhibitor)取得bta-miR-145抑制表达作用，研究bta-miR-145对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路相关基因表达的影响，为bta-miR-145的功能研究奠定基础，同时为从miRNAs的角度研究奶牛的泌乳调控提供依据。
1 材料与方法 1.1 细胞处理将原代奶牛乳腺上皮细胞以1×105个/mL接种于6孔板，用DMEM/F12(Gibco公司)+10%胎牛血清(FBS，Gibco公司)培养基培养24 h。然后用DMEM/F12的无血清培养基处理12 h，再用诱导培养基，即在DMEM/F12基础培养基中添加1 μg/mL地塞米松(Sigma公司)、5 μg/mL催乳素(Sigma公司)、5 μg/mL胰岛素(Sigma公司)和100 ng/mL胰岛素样生长因子-1(IGF-1，Sigma公司)，继续培养12 h，之后进行瞬时转染。
1.2 瞬时转染试验设置5个组，对照组为非转染空白对照；bta-miR-145过表达组(Mimic组)，转染mimic 150 pmol/孔(上海吉玛公司)；mimic阴性对照组 (Mimic-NC组)，转染mimic-NC 150 pmol/孔(上 海吉玛公司)；bta-miR-145抑制表达组(Inhibitor组)，转染inhibitor 300 pmol/孔(上海吉玛公司)；inhibitor阴性对照组(Inhibitor-NC组)，转染inhibitor-NC 300 pmol/孔(上海吉玛公司)，每组3个重复。以LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)为转染试剂，转染的具体操作参照说明书。转染处理细胞24 h后，去除上清，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，然后用Trizol试剂1 mL/孔裂解细胞，提取RNA。
1.3 样品RNA提取样品RNA的提取参考Trizol试剂盒说明书，具体的操作步骤为：每个直径为3.5 cm的培养板添加1 mL Trizol，反复吹打细胞，之后全部移入1.5 mL的离心管中，室温裂解细胞10 min；然后加氯仿0.2 mL，摇振15 s，置室温2~3 min，4 ℃以下1 000×g离心5 min，吸上层水相，移至另一离心管中，加0.5 mL异丙醇，置室温10 min；之后，4 ℃以下1 000×g离心5 min，弃上清，加1 mL 75%乙醇至离心管中，摇振，充分洗涤沉淀，4 ℃以下1 000×g离心5 min，再次弃上清，真空干燥，将沉淀重悬于无RNase的水中。
应用紫外分光光度计检测RNA的浓度，样品的1.8＜(OD260 nm/OD280 nm)＜2.0可用于后续的反转录反应。
1.4 反转录按照TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书进行反转录操作。
首先，进行基因组DNA的去除反应，见表1。
 | 表1 基因组DNA的去除反应 Table 1 Reaction of genome DNA removing |
将上述混合液标记为①，置于PCR仪上42 ℃ 2 min，4 ℃保存。接着，反转录操作见表2。
| 表2 反转录反应 Table 2 Reverse transcription reaction μL |
将上述混合液标记为②，置于PCR仪上，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。这样就得到了cDNA第一链，样品长期保存可放-20 ℃。
1.5 实时定量PCR引物设计与合成表3为本试验所检测基因在细胞信号通路中的作用。
| 表3 基因及所属的信号通路 Table 3 Genes and their signal pathways |
应用Primer Primier 5.0软件进行16个基因的引物设计，引物均由北京六合华大基因有限公司合成。引物序列如表4所示。
| 表4 引物序列 Table 4 Primer sequence |
根据TaKaRa的SYBR Green说明书进行实时定量PCR，见表5。
| 表5 实时定量 PCR体系 Table 5 Real-time qPCR system μL |
实时定量PCR在ABI 7500上进行，反应程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，重复40个循环；增加熔解曲线。荧光定量的最后获得的循环阈值(Ct)用2-ΔΔCt方法进行数据计算，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参。
1.7 潜在靶基因与bta-miR-145结合位点的分析对上述基因表达的结果进行分析，找到bta-miR-145过表达时有显著下调的基因与抑制表达时有显著上调基因的交集，此交集即为bta-miR-145潜在的靶基因。在NCBI核酸数据库中找到该基因的3′非翻译区(3′UTR)。通过 RNAhybrid数据库(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)找到潜在的bta-miR-145结合位点，并分析结合位点的最小自由能。
1.8 数据统计数据采用SAS 9.0的one-way ANOVA程序进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 bta-miR-145过表达对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路相关基因表达的影响从表6可知，bta-miR-145过表达后引起蛋白激酶B3(Akt3)、真核生物翻译起始因子4E(EIF4E)基因mRNA表达量发生显著下调(P＜0.05)。miRNA的过表达会引起它所靶向基因的mRNA表达下调[10]，因此这个结果说明bta-miR-145可能靶向Akt3、EIF4E基因。
| 表6 bta-miR-145过表达对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路相关基因表达的影响 Table 6 Effects of bta-miR-145 over-expression on IGF1R-PI3K-Akt/mTOR signal pathway related gene expressions |
从表7可知，bta-miR-145抑制表达后引起EIF4E、溶解物载体家族3成员2(SLC3A2)、溶解物载体家族7成员1(SLC7A1)基因mRNA表达量发生显著上调(P＜0.05)。一种miRNA会引起它所靶向基因的mRNA表达下调，同样，如果抑制这个miRNA的表达，会相应引起它所靶向基因的mRNA发生相应上调[10]。表7的结果说明bta-miR-145可能靶向EIF4E、SLC3A2、SLC7A1基因。而薯球蛋白(TSC2)这个基因在Inhibitor组与对照组相比显著上调(P<0.05)，但与Inhibitor-NC组相 比差异不显著(P＞0.05)，因此TSC2基因不能作为bta-miR-145的备选靶基因。
| 表7 bta-miR-145抑制表达对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路相关基因表达的影响 Table 7 Effects of bta-miR-145 down-expression on IGF1R-PI3K-Akt/mTOR signal pathway related gene expressions |
从图1可知，bta-miR-145过表达引起显著下调的基因有：Akt3、EIF4E，bta-miR-145抑制表达引起显著上调的基因有：SLC3A2、SLC7A1、EIF4E，它 们的交集为EIF4E。根据miRNA在转录后调节 基因表达，可以引起靶基因mRNA降解的特性[10]，EIF4E基因最有可能是bta-miR-145的靶标。
没有基因在bta-miR-145过表达时显著上调，抑制表达时显著下调。
 | 图1 bta-miR-145过表达和抑制表达后有显著影响的基因分析 Fig. 1 Analysis for significant effect of gene after bta-miR-145 over-expression and down-expression |
牛的EIF4E在NCBI中的序列号为：NM_174310.3，下载其3'UTR，长度为971 bp，将其输入到RNAhybrid数据库，分析结果见表8。
| 表8 潜在结合位点的最小自由能及其二级结构 Table 8 Minimum free energy and secondary structure of potential binding site |
由表8可知bta-miR-145与EIF4E的结合位点的最小自由能为-0.083 6 kJ/mol，一般认为最小自由能(△G)≤-0.062 7 kJ/mol是可以结合的[14]。
3 讨 论一些研究学者在做miRNA的靶基因研究时会采用芯片的检测方式，这种检测方式最大的优点是高通量，但是试验成本比较大[15]。本研究采用生物信息学分析、文献检索和实时定量PCR相结合的方式进行miRNA的靶基因研究，试验的成本低、针对性强。miRNA的作用方式主要是转录后调控，即引起靶基因mRNA的降解，或者翻译的抑制[2, 16]。本试验在mRNA水平主要检测bta-miR-145引起降解的部分靶基因。
常用的知名的miRNA靶基因预测软件主要包括TargetScan、TargetScanS、miRanda、PicTar、rna22，万季[17]对这些软件的敏感度、假阳性率、信噪比等进行测评，发现TargetScan的敏感度最高。因此，本研究选取TargetScan作为预测软件。由于没有专门用于牛物种的靶基因预测软件，我们收集了PubMed上的文献报道，来提高试验的可行性。Shi等[10]报道hsa-miR-145靶向人的IGF1R和IRS1基因。本试验中bta-miR-145对牛IGF1R和IRS1基因的mRNA表达没有显著的影响，说明bta-miR-145对这2个基因的mRNA没有明显的调节作用。
CSN2是牛奶中丰度最高的蛋白质之一，平均含量达到37%[18]。在牛乳腺上皮细胞中，CSN2基因的表达受泌乳类激素及启动子区多种调节元件的控制[18]。目前没有转录后水平，尤其是miRNA水平，调节CSN2基因表达的报道。鉴于CSN2的重要作用，根据TargetScan预测，本试验也研究了bta-miR-145对CSN2基因mRNA的调节作用，结果表明在mRNA水平bta-miR-145并没有调节CSN2基因的表达。
本试验的意外收获是发现了bta-miR-145过表达时显著下调而抑制表达时显著上调的基因——EIF4E。EIF4E是一种帽子结合蛋白，可以特异性地识别mRNA的5′端帽子结构，在真核生物翻译起始过程中发挥重要作用[19]。研究人员[20, 21]认为PI3K-Akt/mTOR信号通路调节可以通过EIF4E来提高mRNA的翻译起始效率。尽管EIF4E基因不在TargetScan 6.2预测的bta-miR-145的靶标范围，但是通过RNAhybrid数据库现bta-miR-145与EIF4E存在潜在结合位点，其结合位点的最小自由能小于-0.062 7 kJ/mol。Chen等[22]已用试验证实hsa-miR-145靶向人EIF4E基因。本试验结果表明bta-miR-145对牛EIF4E基因的mRNA表达有显著的调控作用，再根据结合位点的分析结果，EIF4E很有可能是bta-miR-145的靶基因。miRNA靶基因的确定需要进行一系列的生物学试验，本研究为后续bta-miR-145靶向EIF4E基因的研究奠定了基础，为bta-miR-145调控奶牛泌乳及乳蛋白合成提供了一定的依据。
4 结 论bta-miR-145过表达和抑制表达对IGF1R-PI3K-Akt/mTOR信号通路相关基因表达产生一定影响，但并没有引起bta-miR-145预测靶标IGF1R、IRS1、CSN2基因的mRNA发生显著变化；bta-miR-145过表达可引起EIF4E基因mRNA的显著下调，抑制表达引起EIF4E基因mRNA的显著上调，并且通过生物信息学分析发现牛EIF4E基因3′UTR上存在bta-miR-145的结合位点，以上结果提示EIF4E基因为bta-miR-145的潜在靶标。
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