为了获得良好的生长和骨骼发育，仔猪通常需要从饲粮中采食足够的钙和磷，并充分考虑钙和磷的比例。蒋宗勇等^[1]认为，8～20 kg仔猪有效磷需要量为0.36%，总磷为0.58%，钙磷比例为1.21 ∶ 1.00。不同种类或来源的饲料，其磷有效率差异很大，原因是其中的磷一部分以植酸形式存在。植酸是由1分子肌醇与6分子磷酸结合而成，其化学名称是六磷酸肌醇。植酸自从被发现大量以植酸磷和植酸盐的形式存在于玉米、豆粕等植物籽实中以来，便受到动物营养学家们的广泛关注，原因是植酸本身毒性很小，但却与乙二胺四乙酸(EDTA)具有近似的超强螯合能力。许多研究表明，饲料中的植酸不仅可以与多种金属离子形成稳定的络合物，还能与饲料中蛋白质形成不能被直接利用的蛋白质复合物^{[2, 3]}。这些络合物(复合物)不仅影响单胃动物对矿物元素和蛋白质的吸收利用，而且还抑制机体的生产性能。植酸酶是一种具有特殊空间结构，能够将植酸和植酸盐分解为肌醇和无机磷并释放出被络合的营养物质的一种酶。早在20世纪初，人们便发现植酸酶广泛存在于谷物、麦麸中，但受限于适宜pH范围窄、耐热性差等原因，植酸酶的利用未能引起饲料界的足够重视，直到20世纪60年代从土曲霉中分离纯化出耐酸、碱、热的植酸酶，微生物中植酸酶的培养得到迅速发展，植酸酶逐步成为一种重要的饲料添加剂^{[4, 5, 6]}。研究发现，植酸酶不仅释放出了饲料中被络合的矿物元素和蛋白质，提高了饲料营养物质的利用率，还被证实有提高消化道内消化酶活性的作用，进而促进仔猪的生长性能。一般来说，植酸酶的活性或加工稳定性不同，其在饲料中的添加剂量也不同。虽然目前有不少研究提及植酸酶有提高断奶仔猪生长性能的作用，但鲜有从小肠黏膜发育角度阐述其作用机制的研究。本试验以断奶仔猪为研究对象，探讨低磷饲粮中添加新型耐热植酸酶(NHP)对仔猪生长性能和小肠黏膜形态结构的影响，研究结果可为新型耐热植酸酶在饲料工业中的科学应用提供理论依据。

试验用新型耐热植酸酶是从大肠杆菌来源普通植酸酶经设计、突变、筛选及高效定向后获得的阳性突变体。经筛选后的新型耐热植酸酶，最适pH 5.0，具有耐80 ℃制粒高温、常温下高活性、抗蛋白酶降解等性能，比活性为4 000 U/mg(而普通植酸酶最适温度为45 ℃，比活性为2 957 U/mg，热稳定性较差，60 ℃处理10 min后剩余酶活性为原来的40%。在制粒温度为80 ℃时，普通植酸酶活性存余率仅为10%～30%)。

选用遗传背景相同、初始体重为(8.37±0.97) kg、30日龄断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪256头，按照体重相近、性别比例一致的原则随机分为4个处理，每个处理设4个重复，每个重复16头仔猪。

试验的4个饲粮处理分别为基础饲粮(磷酸氢钙添加量为1.32%，有效磷含量为0.37%)、低磷饲粮(磷酸氢钙添加量为0.72%，有效磷含量为0.24%，同时调整石粉和沸石粉添加量以保持饲粮钙含量不变)、低磷饲粮+0.01%新型耐热植酸酶(植酸酶添加量为500 U/kg)、低磷饲粮+0.02%新型耐热植酸酶(植酸酶添加量为1 000 U/kg)。各饲粮要求正常条件下制粒，饲喂颗粒饲料。基础饲粮参照美国NRC(2012)猪饲养标准并结合生产实践配制，具体组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 60.00 发酵豆粕 Fermented soybean meal (50%) 2.00 豆油 Soybean oil 1.60 豆粕 Soybean meal (46%) 15.00 鱼粉 Fish meal 3.32 乳清粉 Whey powder 1.00 葡萄糖 Glucose 4.00 膨化大豆 Extruded soybean 8.00 石粉 Limestone 0.60 磷酸氢钙 CaHPO4 1.32 酸化剂 Acidifier 0.19 复合酶 Complex phosphoesterasum 0.03 赖氨酸 Lys (98%) 0.50 谷氨酸钠 Sodium glutamate 0.30 胆碱 Choline (50%) 0.10 甜菜碱 Glycine betaine (30%) 0.15 蛋氨酸 Met (98%) 0.24 苏氨酸 Thr (98%) 0.20 色氨酸 Trp (98%) 0.05 食盐 NaCl 0.40 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.18 粗蛋白质 CP 18.50 钙 Ca 0.72 总磷 TP 0.60 有效磷 AP 0.37 赖氨酸 Lys 1.37 蛋氨酸 Met 0.54 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.80 苏氨酸 Thr 0.90 色氨酸 Trp 0.24 1)预混料可为每千克饲粮提供The premix provided the following per kilogram of the diet: VA 10 000 IU，VD3 3 000 IU，VE 25 IU，VK 2 mg，VB1 2 mg，VB2 6 mg，VB6 2 mg，VB12 0.2 mg，泛酸 pantothenic acid 25 mg，烟酸 niacin 35 mg，生物素 biotin 0.15 mg，叶酸 folic acid 1 mg，Cu 10 mg，Fe 170 mg，Zn 130 mg，Mn 40 mg，Se 0.3 mg，I 0.6 mg。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

试验在封闭式仔猪舍内进行，采用地面平养。试验期内提供适宜温湿度，自由采食和饮水。免疫消毒程序按猪场常规方法进行，严格按照试验要求进行管理。饲养管理参照本品种猪的饲养管理规程进行。整个试验期为30 d。

试验开始后，每天07:00和14:00观察并记录仔猪腹泻情况。在试验第30天以重复为单位空腹称重，并记录各重复仔猪的耗料量，计算各组仔猪的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)；腹泻率及腹泻指数参照Kelly等^[7]方法进行统计：

腹泻率(%)=100×腹泻头次/

(本组供试猪总头数×腹泻天数)；

腹泻指数=∑(腹泻头次×相应的腹泻评分)/

(猪只数×天数)。

腹泻评分标准为：粪便条形或粒状为0分(正常)；软粪，能成形为1分(轻度腹泻)；稠状，不成形，粪水无分离为2分(中度腹泻)；液状，不成形，粪水无分离为3分(严重腹泻)。

于试验第30天，从每个重复选取1头中等体重、健康状况良好的仔猪屠宰，取十二指肠、空肠、回肠中段约3 cm肠段，用磷酸盐缓冲液(PBS)小心洗去食糜，用10%甲醛固定液固定，用于制作石蜡切片，观察绒毛形态，计算绒毛高度、隐窝深度及两者的比值。

基本数据处理采用Excel 2003，试验结果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序进行方差、线性和二次分析，多重比较用Duncan氏法。

由表2可知，低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg的新型耐热植酸酶对仔猪平均日增重、平均日采食量以及料重比均没有显著影响(P>0.05)，但新型耐热植酸酶添加组仔猪平均日增重相比较低磷饲粮组有增加的趋势，料重比相比较基础饲粮组和低磷饲粮组有减小的趋势。各组之间的腹泻率及腹泻指数差异均不显著(P>0.05)，但低磷饲粮组和新型耐热植酸酶添加组有线性降低仔猪腹泻率的趋势，新型耐热植酸酶添加组仔猪腹泻率分别为18.02%和18.54%，分别较基础饲粮组降低了35.34%和33.48%(P>0.05)，腹泻指数也分别降低了28.57%和19.05%(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 新型耐热植酸酶对断奶仔猪生长性能的影响Table 2 Effects of NHP on growth performance of weaner piglets 项目 Items 基础饲粮 Basal diet 低磷饲粮 Low phosphors diet 低磷饲粮+500 U/kg 新型耐热植酸酶 Low phosphors diet+ 500 U/kg NHP 低磷饲粮+1 000 U/kg 新型耐热植酸酶 Low phosphors diet+ 1 000 U/kg NHP SEM P值 P-value 线性 Linear 二次 Quadratic 平均日采食量 ADFI/g 691.10 663.18 648.08 658.15 16.54 0.491 0.606 平均日增重 ADG/g 398.02 378.98 390.05 390.89 8.50 0.903 0.603 料重比 F/G 1.74 1.76 1.66 1.69 0.03 0.426 0.904 腹泻率 Diarrhea ratio/% 27.87 21.67 18.02 18.54 1.85 0.064 0.352 腹泻指数 Diarrhea index 0.42 0.43 0.30 0.34 0.04 0.271 0.870 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05). The same as below.

表2 新型耐热植酸酶对断奶仔猪生长性能的影响Table 2 Effects of NHP on growth performance of weaner piglets

由表3可知，各组仔猪的十二指肠绒毛高度、空肠和回肠的隐窝深度及空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度差异均不显著(P>0.05)。1 000 U/kg新型耐热植酸酶添加组仔猪空肠在断奶30 d后绒毛高度达到402.53 μm，显著高于低磷饲粮组的344.03 μm(P<0.05)，对照组和2个新型耐热植酸酶添加组相比较低磷饲粮组，仔猪回肠绒毛高度分别增加了13.58%、20.14%和17.48%(P<0.05)，其余绒毛高度指标差异均不显著(P>0.05)。1 000 U/kg新型耐热植酸酶添加组十二指肠隐窝深度仅为122.63 μm，显著低于基础饲粮组、低磷饲粮组和500 U/kg新型耐热植酸酶 添加组(P<0.05)，但对照组、低磷饲粮组和 500 U/kg新型耐热植酸酶添加组之间差异不显著(P>0.05)。1 000 U/kg新型耐热植酸酶添加组十二指肠绒毛高度/隐窝深度达到3.28，分别比对照组、低磷饲粮组和500 U/kg新型耐热植酸酶添加组增加了16.31%、20.58%和17.56%，但仅与低磷饲粮组差异显著(P<0.05)，其余各组间差异均不显著(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 新型耐热植酸酶对断奶仔猪小肠绒毛形态结构的影响Table 3 Effects of NHP on small intestine villus morphology structure of weaner piglets 项目 Items 基础饲粮 Basal diet 低磷饲粮 Low phosphors diet 低磷饲粮+500 U/kg 新型耐热植酸酶 Low phosphors diet+ 500 U/kg NHP 低磷饲粮+1 000 U/kg 新型耐热植酸酶 Low phosphors diet+ 1 000 U/kg NHP SEM P值 P-value 线性 Linear 二次 Quadratic 绒毛高度 Villus height/μm 十二指肠 Duodenum 405.70 399.36 403.61 398.57 6.56 0.797 0.965 空肠 Jejunum 367.92ab 344.03a 372.36ab 402.53b 9.34 0.109 0.140 回肠 Ileum 358.13b 315.30a 378.80b 370.44b 8.43 0.097 0.193 隐窝深度 Crypt depth/μm 十二指肠 Duodenum 146.53b 146.99b 144.95b 122.63a 3.94 0.027 0.108 空肠 Jejunum 148.48 141.28 137.27 140.60 4.25 0.515 0.578 回肠 Ileum 157.62 149.97 141.45 133.35 5.82 0.153 0.985 绒毛高度/隐窝深度 V/C 十二指肠 Duodenum 2.82ab 2.72a 2.79ab 3.28b 0.09 0.077 0.102 空肠 Jejunum 2.53 2.47 2.75 2.89 0.11 0.197 0.651 回肠 Ileum 2.29 2.15 2.81 2.78 0.13 0.064 0.802

表3 新型耐热植酸酶对断奶仔猪小肠绒毛形态结构的影响Table 3 Effects of NHP on small intestine villus morphology structure of weaner piglets

图1显示的是4组仔猪空肠和回肠的肠组织结构。从图中可以看出，相比较低磷饲粮组，2个新型耐热植酸酶添加组的空肠和回肠绒毛都较长，绒毛也相对密集，其完整性也更好；基础饲粮组绒毛发育程度也比低磷饲粮组好，但略差于2个新型耐热植酸酶添加组；低磷饲粮组肠绒毛则呈现稀疏且短小。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图A~D分别为基础饲粮、低磷饲粮、低磷饲粮+500 U/kg新型耐热植酸酶和低磷饲粮+1 000 U/kg新型耐热植酸酶处理的空肠切片；图E~H分别为基础饲粮、低磷饲粮、低磷饲粮+500 U/kg新型耐热植酸酶和低磷饲粮+1 000 U/kg新型耐热植酸酶处理回肠切片。 Fig. A to D were jejunal slices of treatments of basal diet, low phosphors diet, low phosphors diet+500 U/kg NHP and low phosphors diet+1 000 U/kg NHP, respectively; Fig. E to H were ileal slices of treatments of basal diet, low phosphors diet, low phosphors diet+500 U/kg NHP and low phosphors diet+1 000 U/kg NHP, respectively.图1 仔猪肠组织结构图Fig. 1 Intestinal tissue structure graphs of piglets (100×)

本试验结果显示，断奶仔猪低磷饲粮中添加一定量新型耐热植酸酶，不仅不影响仔猪的生长发育，还能一定程度上提高平均日增重和减小料重比。植酸酶能释放饲料中被植酸螯合的矿物元素、蛋白质、淀粉等营养物质，从而增加畜禽体内ATP的生成，降低内源氨基酸损失和尿素的形成和排泄，进而降低了植酸磷及植酸盐的抗营养作用，提高机体内消化酶的活性，并最终提高动物对饲料中营养物质的消化吸收^{[8, 9, 10, 11, 12]}。另有研究发现，由于饲料原料中的植酸分别与蛋白质和金属离子等物质形成植酸-金属离子-蛋白质三元复合物和植酸-蛋白质二元复合物，改变了饲料中蛋白质的理化性质及生物效价，不仅降低了仔猪对这些营养物质的消化吸收，还因为蛋白质乳化性质及溶解性的下降而致使饲粮中大量蛋白质进入肠道，并在仔猪肠道内腐败变质形成毒素，损害肠道黏膜的结构完整性，影响结肠对水分和电解质的吸收而导致仔猪拉稀^{[13, 14]}。这就形成一个恶性循环：植酸螯合蛋白质进入肠道→蛋白质于肠道中腐败释放毒素→损害肠道黏膜→降低对包括蛋白质在内的营养物质吸收→更多的蛋白质进入到肠道。许多研究发现，畜禽饲粮中添加植酸酶能有效提高其日增重和日采食量，降低料重比^{[15, 16, 17, 18]}。但孙宏选等^[19]和黄兴国等^[20]研究提到，饲粮中植酸酶的添加并没有改善畜禽的生长性能，而在蔡青和等^[21]的植酸酶对断奶仔猪的研究显示，低磷饲粮植酸酶添加组相比较对照组降低了断奶仔猪的日增重和日采食量。本试验结果显示，与低磷饲粮组相比，在断奶仔猪低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶能提高其平均日增重，降低料重比，一定程度上改善了其生长性能，但差异均不显著，但新型耐热植酸酶添加组的平均日增重还略低于基础饲粮组，这与Nourmohammadi等^[22]的微生物植酸酶对肉鸡生长性能的试验结果相似。出现这种结果的可能原因是本试验的钙和 总磷比值过高，胡骁飞^[23]研究表明，钙磷比值为 (1.0~1.4) ∶ 1.0时最有利于植酸酶发挥作用，生长猪的生长性能最好，因为多余的钙可能会与植酸结合，不利于植酸酶发挥生物活性，还会与植酸酶竞争活性位点，降低植酸酶的酶活，而本试验的新型耐热植酸酶添加组在降低磷含量的同时，用石粉和沸石粉补充了钙使之保持与基础饲粮组钙含量一致，使耐热植酸酶组钙磷比值偏高，这可能是导致断奶仔猪低磷饲粮中添加植酸酶对生长性能影响不显著的重要因素。

小肠作为单胃动物营养成分吸收的主要场所，在营养物质消化吸收过程中发挥着至关重要的作用。畜禽肠管结构随年龄逐渐发育成熟，其发育状况与营养物质吸收利用直至畜禽生产性能都息息相关^[24]。Tang等^[25]研究指出，小肠黏膜形态结构直接反映添加剂对仔猪断奶应激的缓冲作用及对肠道修复的效果。研究证实，提高畜禽肠道消化酶活性或饲粮中添加消化酶能大大改善小肠黏膜结构完整性，减小绒毛损伤^[26]。而断奶仔猪养分消化率下降导致的腹泻，被许多研究证实会严重损伤肠绒毛^[27]。前面对生长性能的研究提到，低磷饲粮中添加植酸酶能促进胃肠道消化酶的活性和减小断奶仔猪腹泻，由此作者推测，饲粮中添加植酸酶，能有效提高小肠黏膜结构的完整性，促进小肠绒毛的生长发育。本试验对小肠黏膜结构的数据统计发现，低磷饲粮中添加植酸酶能有效改善肠黏膜结构完整性，促进小肠绒毛生长，抑制隐窝细胞增生，邱梅平^[28]在低磷饲粮中添加植酸酶对蛋鸡肠道黏膜结构的研究也得到了相似的结果，而谢南彬等^[29]对幼建鲤磷缺乏的研究发现，磷缺乏会引起幼建鲤肠上皮细胞坏死及脱落，从而损伤小肠绒毛。这也验证了植酸酶有改善仔猪平均日增重和料重比的作用。

① 低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶能一定程度上改善断奶仔猪生长性能，并促进仔猪小肠黏膜发育。

② 仔猪饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶能减少部分无机磷的添加，起到与基础饲粮相同甚至更好的作用，其中1 000 U/kg新型耐热植酸酶能起到更好的替代作用。