随着人们生活水平的不断提高，人们对肉类品质的要求也越来越高。兔肉具有高蛋白质、高赖氨酸、高卵磷脂、高消化率以及低脂肪、低热量、低胆固醇、低尿酸等优点，被联合国粮农组织列为美容、益智、增寿的保健食品并越来越受到消费者的青睐^{[1, 2]}。然而，兔肉存在的一些如肉纤维粗硬、抗生素残留等问题，始终制约着兔肉的消费量。饲料营养是影响肉品质的重要因素之一^[3]。微生态制剂被公认为饲用抗生素的最佳替代产品，具有无残留、无毒副作用等特点，可达到更好的生态效益和经济效益。其中乳酸菌作为肠道内的优势菌群，与之相关的微生态制剂受到了更多的关注。目前，国内外研究大多在益生素对畜禽生长性能、免疫方面的作用，鲜有在肉品质方面的研究报道，并且益生菌在改善肉品质方面的效果存在争议。陆银等^[4]研究表明，复合益生菌(由蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌组成)能显著提高肉仔鸡肌肉的系水力和嫩度。李文东等^[5]报道，饲粮中添加微生态制剂可在一定范围内提高冷鲜鸭肉品质，延长冷鲜鸭的货架期。吴家泉等^[6]用微生态制剂饲喂肉羊，结果表明微生态制剂组的肉色、大理石纹显著优于对照组，失水率显著低于对照组。然而，益生菌是否能改善獭兔肉感官品质目前尚未见报道。现代分子生物学技术的发展为进一步探讨乳酸菌对獭兔肌肉生长速度的调控机制提供了条件，为此，本试验将不同水平的乳酸菌添加于断奶獭兔的饮水中，通过测定獭兔生长性能、肉品质及肌肉胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、生长激素受体(GHR)mRNA相对表达量，研究乳酸菌对机体肌肉组织的调控作用，以期探索乳酸菌对獭兔的作用效果及适宜用量，为獭兔饲用益生素的研发提供参考。

本试验所选用的乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌种来自西北农林科技大学资源环境学院环境与微生物实验室。

乳杆菌的活化和发酵培养：将乳杆菌以1%的接种量在灭菌的乳酸细菌培养基(MRS培养基)上活化，将活化好的植物乳杆菌再以5%的接种量接种于灭菌的MRS培养基中，在空气恒温摇床中37 ℃、100 r/min的条件下培养48 h，4 000 r/min、4 ℃离心，取菌泥，以1 ∶ 5的体积比加冷冻保护剂搅拌混匀，于-80 ℃下保存。使用前于37 ℃水浴摇床中复苏，测定其活率为10¹⁵ CFU/mL。

MRS培养基的配制^[7]：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、吐温80 1.0 mL、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.05 g、磷酸氢二钾2 g、蒸馏水1 000 mL，调节pH至6.2~6.4，121 ℃灭菌15 min。

冷冻保护剂的配制^[8]：脱脂乳70 g/L、谷氨酸钠20 g/L、蔗糖5 g/L、维生素C 2 g/L、葡萄糖2 g/L、甘油30 mL/L，121 ℃灭菌15 min。

试验饲粮参照我国推荐的家兔饲粮营养标准，结合陕西当地饲料原料的实际情况进行配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 15.00 豆粕 Soybean meal 15.00 麦麸 Wheat bran 16.00 蚕沙 Silkworm excrement 5.00 啤酒酵母 Brewer’s yeast 5.00 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 5.00 玉米皮溶浆粉 Corn bran soluble powder 5.00 菌糠 Mushroom bran 15.00 米糠 Rice bran 15.00 预混料 Premix1) 4.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 10.17 粗蛋白质 CP 19.33 赖氨酸 Lys 0.84 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.48 钙 Ca 1.07 磷 P 0.62 1)预混料可为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet: 石粉 limestone 14 g， CaHPO4 11 g，NaCl 5 g，Fe (FeSO4·H2O) 100 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 160 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 141.7 mg，Mn (MnSO4·H2O) 94.07 mg，I (KI) 0.65 mg，Se (Na2SeO3) 0.45 mg，VA 3.096 mg，VD3 0.025 mg，VE 50 mg，VK 2 mg，Lys 2 000 mg，Met 2 000 mg，抗氧化剂 antioxidant 5 mg，地克珠利 diclazuril 20 mg，杆菌肽锌 bacitracin zinc 3 000 mg，载体 carrier 2 200 mg。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

将购自陕西省武功县秦兴兔场(43±2)日龄断奶、体重(1.15±0.05) kg的80只健康獭兔，随机分为5组，每组4个重复，每个重复4只兔(公母各占1/2)。对照组喂饮生理盐水；试验组(Ⅰ~Ⅳ组)每个兔笼上都安装独立饮水装置用于喂饮菌液，植物乳杆菌添加水平分别为10⁴、10⁷、10¹⁰和10¹³ CFU/mL。每隔1 d喂饮1次，每次10 mL。试验预试期7 d，正试期60 d。

饲养试验在西北农林科技大学实验动物中心进行。试验开始前，打扫兔舍，并用火焰枪对兔笼进行彻底消毒，最后喷洒百毒杀消毒液对整个兔舍进行消毒灭菌。将所选试验兔编号后单笼饲养，自由采食和饮水，每隔1 d喂饮1次乳酸菌或生理盐水，每次10 mL。每天打扫兔舍，定期清理料槽并用百毒杀对兔舍进行带兔消毒。试验期间，仔细观察试验兔的采食情况和健康状况，每只试验兔单独记录采食量。整个试验期间内不使用任何抗生素等化学药物。

试验第60天，每个处理分别随机抽取4只试验兔(公母各占1/2)屠宰，分别取背最长肌和后腿肌肉用于测定肉品质。另取后腿肌肉放入无RNA水解酶的1.5 mL离心管，液氮速冻，-80 ℃保存，以备进行总RNA的提取。

正试期当天于晨饲前空腹称重作为试验始重，试验结束后空腹称重作为试验末重。试验末重和试验始重之差再除以试验天数即为试验兔的平均日增重。

测定后腿肉的pH、剪切力。

pH：用数显pH计(pH-Spear，Eutech公司，新加坡)测定屠宰后45 min内的pH(pH_{45 min})和在4 ℃冰箱保存24 h的pH(pH_{24 h})，测定时将电极头完全包埋在肉样中。

剪切力：用C-LM3数显肌肉嫩度测定仪测定，将肉样修成长4.0 cm、宽1.0 cm、厚0.5 cm的小块，避开筋腱、脂肪及肌膜，每样本切3次，计算 平均值。

测定背最长肌的肉色和失水率。

肉色：用WSC-S测色色差计(上海精密科学仪器有限公司)测定腿肉的亮度值(lightness，L^*)、红度值(redness，a^*)和黄度值(yellowness，b^*)。

失水率：屠宰后2 h内进行，使用YYW-2型应变控制式无侧限压力仪(南京土壤仪器厂有限公司)测定，取肉样(厚约1 cm，直径约3 cm)称压前重，然后置于上下各18层吸水纸之间，放在钢环允许膨胀压缩仪平台上，35 kg压力下，持续5 min，然后迅速撤去压力，立即称压后重。计算公式如下:

用超纯RNA提取试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司)提取后腿肌肉总RNA，提取的RNA样品经Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo Scientific科技有限公司)测定浓度，用琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。以RNA单链为模板，反转录成双链。引物(表2)参照GenBank上IGF-1、IGF-1R、GHR和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)相关序列设计，由生工生物公司合成，然后以cDNA为模板，GADPH为内参基因，在CFX96实时定量PCR仪(BIO-RAD公司)上进行相对定量。肌肉IGF-1、IGF-1R、GHR mRNA相对表达量用2^-△△Ct法计算。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验用引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of primers in the experiment 基因 Genes 登录号 Accession No. 引物序列 Sequences of primers (5′—3′) 产物大小 Product size/bp 磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH NM_001082253.1 F: TGCCACCCACTCCTCTACCTTCG R: CCGGTGGTTTGAGGGCTCTTACT 139 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 NM_001082026.1 F: TATTTCAACAAGCCCACAGG R: ACATCTCCAGCCTCCTCAGA 109 胰岛素样生长因子1受体 IGF-1R XM_002721774.1 F: ACATCCGACGAGGCAATAAC R: CAGGAAGGACAAGGAGACCA 119 生长激素受体 GHR NM_001082636.1 F: ATGACGACTCTGGACGAACC R: TGAGCAGCAGGAGAAACATC 190

表2 试验用引物序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers in the experiment

采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法多重比较检验，试验数据采用“平均值±标准差”表示。

由表3可知，随着乳酸菌添加水平的增加，獭兔肌肉的失水率呈先降低后升高的趋势，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ组的失水率分别降低了4.49%和2.27%，3组之间差异显著(P<0.05)，且Ⅰ组显著低于其他4组(P<0.05)。各组獭兔肌肉的pH、剪切力和肉色均无显著差异(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 乳酸菌对獭兔肉品质的影响Table 3 Effects of lactic acid bacteria on meat quality of Rex rabbits 项目 Items 组别 Groups 对照 Control Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ pH45 min 6.95±0.16 6.99±0.13 6.94±0.20 6.95±0.18 7.03±0.11 pH24 h 6.21±0.21 6.22±0.09 6.16±0.30 6.26±0.14 6.12±0.07 剪切力 Shear force/kgf 28.06±1.23 30.58±1.33 31.56±1.30 28.90±3.53 28.72±2.86 失水率 Water loss rate/% 24.18±0.96c 19.69±1.40a 21.91±1.22b 22.84±1.43bc 23.26±1.19bc 亮度 L* 38.99±2.74 40.09±2.91 37.10±2.79 39.94±2.33 39.46±2.88 红度 a* 9.46±1.71 10.76±1.05 10.61±1.07 10.21±0.53 10.77±1.05 黄度 b* 7.69±0.63 8.29±0.73 8.23±0.28 7.81±1.50 7.13±1.42 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表4同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4.

表3 乳酸菌对獭兔肉品质的影响 Table 3 Effects of lactic acid bacteria on meat quality of Rex rabbits

由表4可知，随着乳酸菌添加水平的增加，獭兔平均日增重呈先升高后降低的趋势，在Ⅱ组达到最大值，试验组较对照组分别提高了7.68%、15.29%、11.76%、8.02%，Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)，其余各组间差异不显著(P>0.05)。各组平均日采食量无显著差异(P>0.05)。随着乳酸菌添加水平的增加，试验组的料重比呈先降低后升高的趋势，试验组料重比与对照组相比分别降低了9.37%、12.49%、10.49%、6.89%，Ⅱ组料重比最低，显著低于对照组(P<0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 乳酸菌对獭兔生长性能的影响 Table 4 Effects of lactic acid bacteria on growth performance of Rex rabbits 项目 Items 组别 Groups 对照 Control Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 平均日增重 ADG/(g/d) 17.00±2.67b 18.31±1.51ab 19.60±3.22a 19.00±2.83ab 18.36±2.99ab 平均日采食量 ADFI/(g/d) 131.65±2.23 130.54±4.13 132.83±4.25 131.96±4.76 132.13±1.95 料重比 F/G 7.91±1.18a 7.17±0.50ab 6.92±1.00b 7.08±1.01ab 7.36±1.14ab

表4 乳酸菌对獭兔生长性能的影响Table 4 Effects of lactic acid bacteria on growth performance of Rex rabbits

由表5可知，随着乳酸菌添加水平的升高，IGF-1 mRNA相对表达量先升高后降低，Ⅰ组显著高于其他各组(P<0.05)。各组IGF-1R mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05)。随着乳酸菌添加水平的升高，GHR mRNA相对表达量先升高后降低，Ⅱ组最大，与对照组差异显著(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 乳酸菌对獭兔肌肉IGF-1、IGF-1R、GHR mRNA相对表达量的影响Table 5 Effects of lactic acid bacteria on mRNA relative expression of IGF-1,IGF-1R and GHR in muscle of Rex rabbits 项目 Items 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 胰岛素样生长因子-1受体 IGF-1R 生长激素受体 GHR 对照组 Control group 1.00±0.00a 1.00±0.00 1.00±0.00a Ⅰ组 Group Ⅰ 1.77±0.31b 0.81±0.09 1.36±0.16ab Ⅱ组 Group Ⅱ 1.06±0.41a 0.80±0.15 1.48±0.37b Ⅲ组 Group Ⅲ 1.07±0.24a 1.01±0.31 1.12±0.21ab Ⅳ组 Group Ⅳ 1.03±0.14a 1.06±0.23 1.12±0.37ab 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。 In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表5 乳酸菌对獭兔肌肉IGF-1、IGF-1R、GHR mRNA相对表达量的影响Table 5 Effects of lactic acid bacteria on mRNA relative expression of IGF-1,IGF-1R and GHR in muscle of Rex rabbits

目前，国内外在益生素对畜禽肉品质影响方面的研究鲜有报道，并且益生菌在改善肉品质方面存在疑问，结果也不一致。李菊等^[9]研究发现，肉鸡饲喂乳酸菌(CAU6001)可以提高肉鸡胸肌和腿肌a^*和b^*，但对L^*无显著影响。然而，Zhu等^[10]研究发现，唾液乳杆菌对肉鸡胸肌L^*、a^*和b^*都没显著影响。郭元晟等^[11]报道，饲喂发酵乳杆菌F-6对肉鸡肌肉的肉色无显著影响，但对肌肉系水力有一定的改善效果。Yang等^[12]在1日龄爱拔益加肉鸡饲粮中添加丁酸梭菌后，可以显著降低肌肉的剪切力。Zhou等^[13]研究发现，凝结 芽孢杆菌可以改善广西三黄鸡的口感，降低胸肌 的剪切力和滴水损失。Jukna等^[14]报道，益生素可显著降低猪肉的硬度。孙建广等^[15]研究发现，饲粮中添加发酵乳杆菌可使肥育猪滴水损失降低2.3%，剪切力降低26.1%。Parra等^[16]的研究结果却显示，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对伊比利亚猪的肉质没有影响，胆固醇含量和脂肪酸组成也没有发生明显的变化。出现这种差异的原因可能是与试验动物、菌种和试验周期有关。

乳酸菌是动物肠道内重要的厌氧菌，可以在动物肠道内正常定植，通过代谢产生乳酸等酸性物质，降低肠道pH，产生抑菌物质，且与致病菌竞争营养物质及附着位点，抑制致病菌，维持肠道微生物区系的平衡，提高动物机体的免疫力，在生长繁殖的过程中还能产生多种消化酶，从而促进了蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养物质的消化吸收^[17]，使其在避免了化学药物使用的条件下最大限度地提高了生长性能。同时，有益微生物的定植能减少腐败物质的产生，加强营养物质吸收，在一定程度上能改变动物机体物质组成结构，进而影响肉品质。另有研究报道，肉品质与生长性能之间存在着拮抗关系，生长性能对肉品质影响的原因可能是由于生长速度加快，导致肌肉中的化学物质代谢失调，同时快速生长引起肌肉组织结构发生改变，从而使肉品质受到影响^[18]。

系水力是重要的肉品质性状之一，可影响肉的多汁性、嫩度、营养成分和色泽等食用品质，通常用失水率或滴水损失来衡量肉的系水力，而失水率越小，保水性就越高，水分越不易渗出，有利于维持肌肉的嫩度、多汁性与肉制品的品质。本试验中，Ⅰ、Ⅱ组的失水率比对照组分别降低了4.49%和2.27%，说明饲喂乳酸菌对兔肉的系水力有一定的改善作用。值得注意的是，失水率较高的Ⅰ、Ⅱ组剪切力却相对较小，这可能是肉样取自不同部位^[18]而造成这一比较反常的结果。虽然并未发现乳酸菌对兔肉的pH和肉色的影响，但乳酸菌对系水力的影响也能在一定程度上反映出乳酸菌具有改善獭兔肉品质的趋势，这值得进一步的研究和探索。乳酸菌影响肉品质的作用机理尚不明确，可能是因为使用益生素后，避免了抗生素、激素等化学药物的使用，不仅有利于畜禽健康成长，而且由于体内大量的有益微生物的活化作用，改善了畜产品品质，但又由于肉品质与生长性能之间存在着拮抗关系，所以改善效果并未随乳酸菌添加水平的不断升高而一直加强，由于肉品质的影响因素很多，而且各因素之间的关系较为复杂，因此乳酸菌对肉品质潜在的影响及其作用机理还有待更加深入的探讨。

乳酸菌能产生蛋白酶和淀粉酶等多种消化酶来促进肠道对营养物质的消化吸收，提高饲料利用率，从而提高畜禽的生长性能。同时，乳酸菌还可以通过产生B族维生素、氨基酸、未知促生长因子等来参与机体新陈代谢，促进动物的生长^[19]。徐基利^[20]试验结果表明，同源乳酸菌对肉仔鸡生长性能、盲肠菌群及免疫机能都有不同程度的促进作用。索成等^[21]研究发现，向仔猪基础饲粮中加入植物乳杆菌ZJ316可提高了平均日增重和肉品质。王全溪等^[22]报道，添加100 mg/kg乳酸菌素比200 mg/kg乳酸菌素更能显著提高肉鸡增重，降低料重比。本试验中，当乳酸菌添加量在10⁷ CFU/mL时，獭兔的平均日增重最高、料重比最低，而过量使用则效果变差。分析其可能原因如下，幼龄獭兔因受断奶应激、饲粮改变等的影响，肠道内的菌群平衡受到破坏，添加适量的乳酸菌可以促进有益菌的增殖，帮助幼兔建立有利于生长的新的菌群平衡，起到促生长的效果。但是过量添加乳酸菌会导致其进入肠道后进一步与优势菌群争夺营养物质和生态位点，破坏肠道微生物的动态平衡，进而造成獭兔生长性能的下降。

生长激素(GH)位于生长激素轴的中心环节，是调控动物生长的主要激素，具有调节营养分配、促进蛋白质合成、促进骨骼肌肉生长、减少脂肪沉积、提高动物生长速度和饲料报酬等功能。GH发挥作用的第一步必须与靶细胞膜表面的GHR结合，由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。骨骼肌是动物机体主要的代谢器官，重量占动物体重的40%~50%，也是畜牧业生产中主要的动物产品。GH可作用于骨骼肌GHR，产生旁分泌或自分泌的IGF-1，IGF-1可通过IGF-1R促进蛋白质合成，从而调控骨骼肌的生长发育^{[23, 24]}。通过营养调控途径能够提高动物体内IGF-1水平，促进动物生长发育，同时提高动物的生长性能^[25]。综上所述，GH/IGF-1系统对动物的生长发育和代谢活动有极其重要的调控作用，IGF-1、IGF-1R、GHR被认为是影响畜禽生长、生产等主要经济性状的基因。乳酸菌可产生多种维生素、氨基酸等营养物质，同时还能提高消化酶活性，促进机体对营养物质的吸收利用，这就能在一定程度上提高营养水平，进而通过神经内分泌系统及相关功能基因的表达来调节肌纤维的生长。已有研究表明，营养状况对GH/IGF-1系统相关激素的相对表达量有显著的影响^{[26, 27]}。而通过饲喂益生菌，菌体蛋白及菌体自身的其他营养能为宿主动物提供优质的蛋白质及必需氨基酸等营养物质，可能会通过影响GH/IGF-1系统相关激素的表达，进而促进动物生长，提高动物生长性能。张常明等^[28]发现，植物源性乳酸菌可以提高断奶仔猪血清中IGF-1水平，乳酸菌添加水平为30和60 mL/d的试验组与对照组差异显著。Carnevali等^[29]报道，乳酸菌可显著提高鲈鱼IGF-1 mRNA相对表达量，试验组IGF-1 mRNA相对表达量是对照组的6倍。Avella等^[30]将含鼠李糖乳杆菌IMC501添加到饲养小丑鱼的水中，发现小丑鱼IGF-1、IGF-1R mRNA相对表达量有显著提高。对于益生菌能否通过改变动物肌肉组织中该系统基因的表达而影响整个肌肉的生长及生长性能这一问题，目前研究多集中在这些激素在血液或肝脏中的变化，而其相关受体在肌肉局部的表达则缺乏系统的报道。

本试验中，乳酸菌提高了肌肉IGF-1和GHR mRNA相对表达量，Ⅰ组IGF-1 mRNA相对表达量最高，Ⅱ组GHR mRNA相对表达量最高，二者均显著高于对照组；而乳酸菌对獭兔肌肉IGF-1R mRNA相对表达量无显著影响。结果表明，乳酸菌对生长性能的影响伴随着肌肉中一些与生长密切相关的mRNA相对表达量的变化，其中GHR mRNA相对表达量与生长性能的变化趋势一致，这说明乳酸菌对獭兔肌肉生长的促进作用可能是通过肌肉组织中GHR介导的；而IGF-1 mRNA相对表达量则受到较低乳酸菌添加水平的影响而上调，这与生长性能的变化趋势不符。分析其原因可能是IGF-1 mRNA相对表达量随日龄增长而不断改变，有研究表明，猪骨骼肌中IGF-1 mRNA相对表达量随日龄增加而减少^[31]，而生长性能指标则是一段时间内的平均值。另外，IGF-1 mRNA相对表达量也会受到动物个体差异的影响。各组IGF-1R mRNA相对表达量差异不显著，说明在獭兔肌肉组织中IGF-1R mRNA表达量可能与骨骼肌的生长没有直接关系，这与郝哲^[32]的观点一致。Ⅰ、Ⅱ组IGF-1R mRNA相对表达量略低于对照组，可能是由于试验误差所致。

在饮水中添加乳酸菌能提高獭兔生长性能，促进肌肉IGF-1、GHR mRNA的表达，并改善肌肉的系水力。本试验条件下，乳酸菌的适宜添加水平为10⁷ CFU/mL，推荐添加水平为10⁴~10⁷ CFU/mL。