方格星虫，别名沙虫，是北部湾的特色经济海产品之一，一直以肉脆味美、营养丰富并兼具药用价值著称^{[1, 2]}。近几年来，随着人们对方格星虫的深入了解以及对绿色健康食物的追求，天然方格星虫的市场需求量显著上升，但是由于其食性特殊，养殖周期长，对环境要求高，又使得适合养殖方格星虫的天然滩涂并不多，因此突破方格星虫人工养殖技术成为了方格星虫养殖研究的重点。广西壮族自治区海洋研究所自2004年突破方格星虫人工繁育技术以来，一直致力于方格星虫人工配合饲料的研究，此前已有关于方格星虫稚虫蛋白质、脂肪、糖以及糖脂比等相关研究^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}，为补充健全方格星虫营养需要量，微量元素最适需求量的研究也必不可少。本文开展了饲料中微量元素铁水平对方格星虫的生长性能、体成分、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性以及铁元素在方格星虫稚虫体内分布特点的研究，为实现规模化养殖方格星虫的营养需要量的完善提供理论基础。

试验所用的方格星虫取自广西海洋研究所海水增养殖基地，为同批人工孵化苗种，自然状态下体长为1.3~1.8 cm，平均体重为(16.12±0.26) mg。选用体重[(16.11±0.09) mg]相近、健康无病的方格星虫稚虫7 200条，以400条为1个重复，3个重复为1组，随机分成6组，分别饲喂6种不同铁水平的人工微颗粒饲料。制作饲料之前，分别对各原料进行了粗蛋白质、粗脂肪以及总能的测定，作为制定和调整饲料配方的依据。如表1所示，试验用饲料主要由酪蛋白、明胶、鱼油、糊精、卵磷脂、褐藻酸钠、微晶纤维素、维生素预混料以及矿物质预混料组成，并用蛋氨酸铁来调节试验饲料中的铁水平。经测定，6种试验饲料中铁 的实际水平分别为11.2、42.5、61.3、115.6、283.7、482.1 mg/kg。饲料制作过程中，先将主要原料粉碎过300目筛，按照添加水平从低至高逐级称重并混合均匀，与鱼油搓匀之后再加少量水搓匀，烘干粉碎制成过150目筛的微颗粒饲料，装袋标号备用。本饲料制作加工过程均参照Blair等^[9]介绍的方法。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) % 项目 Items 饲料铁水平 Dietary iron level/(mg/kg) 11.2 42.5 61.3 115.6 283.7 482.1 原料 Ingredients 酪蛋白 Casein 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 明胶 Gelatin 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 鱼油 Fish oil 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 糊精 Dextrin 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 卵磷脂 Lecithin 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 褐藻酸钠 Sodium alginate 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 维生素预混料 Vitamin premix1) 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 微晶纤维素 Microcrystalline cellulose 14.00 13.98 13.96 13.92 13.85 13.69 矿物质预混料 Mineral premix2) 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 蛋氨酸铁 Iron methionine 0.02 0.04 0.08 0.15 0.31 合计Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 52.57 51.60 52.69 53.13 52.47 52.21 粗脂肪 EE 2.75 2.77 2.64 2.57 2.85 2.73 粗灰分 Ash 3.16 3.13 2.93 3.11 2.91 3.14 总能 Gross energy/(MJ/kg) 19.82 19.68 19.83 19.79 19.68 19.74 1)维生素预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following per kg of diets：VD 2 400 IU，VE 100 mg，VK 1 mg，VC 70 mg，VB1 0.5 mg，VB2 7 mg，VB6 6 mg，VB12 1 mg，D-泛酸 D-pantothenic acid 32.6 mg，烟酸 nicotinic acid 28 mg，生物素 biotin 1 mg，叶酸 folic acid 7.5 mg，肌醇 inositol 440 mg。 2)矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral premix provided the following per kg of diets：CuSO4·5H2O 12 mg，ZnSO4·7H2O 156 mg，MnSO4·H2O 41 mg，NaCl 800 mg，Na2SeO3·5H2O 0.9 mg，KI 0.8mg。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)

养殖试验阶段，养殖时间为2013年8—10月，养殖周期为56 d。选用相同规格(65 cm×55 cm×45 cm)的18个水槽，在水槽的底部均匀地铺设用淡水彻底清洗消毒并经海水浸泡1 d的细沙薄层，厚约3~4 cm，加水深约20 cm，此为方格星虫稚虫的栖息地。6组方格星虫稚虫分别饲喂6种不同铁水平的试验饲料，投喂方法为过量投喂，即保证沙子表面有少量未食用完全的饵料。饲养采用自然光照周期，24 h连续微充氧，水温维持在26~30 ℃，盐度维持在18~22 g/L，溶解氧大于5.0 mg/L。

饲养阶段结束后，将方格星虫稚虫转移至海水深为10 cm左右的无沙水槽中停食吐沙2~3 d，之后收集各水槽内的方格星虫稚虫并称重，称重后于液氮中快速冷冻，转移至-80 ℃超低温冰箱中保存。同时记录方格星虫稚虫的成活条数，计算各组方格星虫的成活率(survival rate,SR)。计算公式如下：

成活率(％)=100×N_t／N₀；

增重率(weight gain rate,WGR,％)=

100×(W_t-W₀)／W₀；

特定生长率(specific gain rate,SGR,％／d)=

100×(1nW_t-lnW₀)／t。

式中：N₀为初始方格星虫稚虫条数；N_t为终末方格星虫稚虫条数；W₀为初始方格星虫稚虫体重；W_t为终末方格星虫稚虫体重；t为试验天数。

本试验采用AOAC(1995)的方法分析试验方格星虫稚虫的体成分和饲料常规成分。使用105 ℃烘箱中烘干至恒重测定水分含量，凯氏定氮法(Kjeltec 8 400，瑞典)测定粗蛋白质含量，索氏抽提法(Soxtec 2 050，瑞士)测定粗脂肪含量，550 ℃马福炉中灼烧12 h测定粗灰分含量。

方格星虫稚虫CAT活性采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。

采用《动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》(GB 13885—2003)中的方法进行体壁(解剖剪剪开后去除内脏和体腔液所得)和虫体铁含量的测定。具体方法：将样品550 ℃马福炉灰化，用浓盐酸溶解残渣并稀释定容，然后导入原子吸收分光光度计的空气-乙炔火焰中，测定元素的吸光度，并与元素校正溶液的吸光度比较定量。

本试验采用SPSS 13.0对所得数据进行方差分析，若差异达到显著，则进行Tukey’s多重比较，显著性水平为P<0.05。试验数据用平均值±标准误表示。

由表2可知，经过56 d的饲养，不同的铁水平对方格星虫稚虫养殖的WGR、SGR和SR都有显著影响(P<0.05)。随着饲料铁水平增加，各试验组的WGR和SGR呈先增后降趋势，铁水平为115.6 mg/kg的试验组WGR和SGR最高，显著高于其他试验组(P<0.05)。铁水平为42.5 mg/kg的试验组方格星虫稚虫SR最高，显著高于铁水平为11.2、482.1 mg/kg的试验组(P<0.05)，但与其他组无显著差异(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料铁水平对方格星虫稚虫生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary iron level on growth performance of juvenile peanut worm 饲料铁水平 Dietary iron level/(mg/kg) 初始体重 IBW/mg 终末体重 FBW/mg 增重率 WGR/% 特定生长率 SGR/(%/d) 成活率 SR/% 11.2 16.08±0.17 42.48±0.80a 164.14±2.42a 1.73±0.02a 59.58±1.69a 42.5 16.23±0.19 44.06±0.84ab 171.43±3.73ab 1.78±0.02ab 84.25±3.97c 61.3 16.09±0.25 47.17±0.57bc 193.37±7.80abc 1.92±0.05bc 75.92±4.05bc 115.6 16.23±0.17 55.81±1.07d 244.10±9.33d 2.21±0.05d 74.67±1.92bc 283.7 16.00±0.44 47.26±0.66bc 195.64±4.70bc 1.94±0.03bc 70.50±2.90abc 482.1 16.08±0.23 49.79±1.30c 209.63±7.91c 2.02±0.05c 65.75±3.26ab P值 P-value 0.983 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.002 同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 饲料铁水平对方格星虫稚虫生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary iron level on growth performance of juvenile peanut worm

从表3可知，试验方格星虫稚虫水分含量在78.15%~79.73%之间，粗蛋白质含量在17.49%~19.20%之间，粗灰分含量在4.71%~5.53%之间，上述指标各组间均无显著差异(P>0.05)。而不同铁水平的饲料对方格星虫稚虫粗脂肪含量则有显著影响(P<0.05)，铁水平最低的2个试验组粗脂肪含量最低，分别为(0.44±0.02)%和(0.56±0.03)%，并显著低于其余各组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料铁水平对方格星虫稚虫体成分的影响 Table 3 Effects of dietary iron level on body composition of juvenile peanut worm % 饲料铁水平 Dietary iron level/(mg/kg) 水分 Moisture 粗蛋白质 CP 粗脂肪 EE 粗灰分 Ash 11.2 79.73±0.41 17.49±0.29 0.44±0.02a 4.96±0.31 42.5 78.85±0.46 18.31±0.88 0.56±0.03ab 5.00±0.13 61.3 79.56±0.44 18.17±0.13 0.62±0.03bc 4.71±0.46 115.6 78.20±0.19 18.98±0.30 0.71±0.02bc 5.40±0.22 283.7 78.15±0.42 19.20±0.58 0.70±0.02c 5.29±0.49 482.1 78.36±0.21 18.70±0.25 0.62±0.03c 5.53±0.08 P值 P-value 0.370 0.078 ＜0.001 0.578 粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量为方格星虫稚虫的湿重含量。 CP，EE and ash contents were wet weight content of juvenile peanut worm.

表3 饲料铁水平对方格星虫稚虫体成分的影响 Table 3 Effects of dietary iron level on body composition of juvenile peanut worm %

由表4可知，饲料铁水平对方格星虫稚虫CAT活性有显著的影响(P<0.05)。随着饲料中铁水平的增加，方格星虫稚虫CAT活性先呈逐渐升高趋势后趋于平稳；当铁水平为115.6 mg/kg时CAT活性达到最大值(3.62 U/mg prot)；其中饲料铁水平为11.2和42.5 mg/kg的试验组CAT活性 显著低于铁水平为115.6、283.7和482.1 mg/kg的试验组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料铁水平对方格星虫稚虫CAT活性的影响 Table 4 Effects of dietary iron level on CAT activity of juvenile peanut worm 饲料铁水平 Dietary iron level/(mg/kg) 过氧化氢酶 CAT 11.2 1.20±0.18a 42.5 2.06±0.25ab 61.3 2.79±0.28bc 115.6 3.62±0.33c 283.7 3.32±0.16c 482.1 3.40±0.11c P值 P-value ＜0.001

表4 饲料铁水平对方格星虫稚虫CAT活性的影响 Table 4 Effects of dietary iron level on CAT activity of juvenile peanut worm

由表5可知，饲料铁水平对方格星虫稚虫体 壁和虫体内铁含量的均无显著影响(P>0.05)。其中体壁铁含量在214.65~240.75 μg/g之间；虫体铁含量在192.25 ~234.24 μg/g之间,且随着饲料铁水平增加有先上升后降低的趋势(0.05<P<0.10)。通过折线模型进行回归分析^[10](图1)，虫体铁含量(y₁)以铁水平115.6 mg/kg为界，可与前4组饲料铁水平(x₁)(11.2、42.5、61.3、115.6 mg/kg)形成线性关系，其方程为：y₁=0.4x₁+185.8 (R²=0.852)；此外虫体铁含量(y₂)与后3组饲料铁水平(x₂)(115.6、283.7、482.1 mg/kg)形成线性关系，其方程为y₂=-0.1x₂+245.8 (R²=1.000)。如图1所示，当2线 交汇可求出虫体铁含量最大时(y_max=233.85 μg/g) 的饲料铁水平为x_max=118.65 mg/kg。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲料铁水平对方格星虫稚虫体壁和虫体铁含量的影响 Table 5 Effects of dietary iron level on the iron content of body and wall of juvenile peanut worm μg/g 饲料铁水平 Dietary iron level/(mg/kg) 体壁铁含量 Iron content of wall 虫体铁含量 Iron content of body 11.2 214.65±13.17 196.11±6.34 42.5 220.31±23.37 192.25±9.77 61.3 237.38±13.02 214.18±5.30 115.6 237.48±14.80 234.24±10.19 283.7 240.75±20.27 217.08±14.40 482.1 224.57±22.49 197.32±11.07 P值 P-value 0.876 0.079

表5 饲料铁水平对方格星虫稚虫体壁和虫体铁含量的影响 Table 5 Effects of dietary iron level on the iron content of body and wall of juvenile peanut worm

图1(Figure 1)

图1 方格星虫稚虫的虫体铁含量与饲料铁水平的关系 Fig. 1 Relationship between iorn content of juvenile peanut worm body and dietary iron level

微量元素铁是生物体必需的一种营养元素，它是生物体内血红蛋白、肌蛋白以及某些细胞酶的组成部分，对维持生物体正常生理功能起着重要作用^[11]。在自然水体中能被水生动物吸收利用的可溶性铁很少，不够满足水生动物对铁的需要，所以饲料中必需添加铁源。

相较于单纯的无机盐形式的铁，氨基酸螯合后的铁能够利用肠道中的氨基酸吸收通道进行吸收利用，从而避免了在矿物质吸收通道中与其他的微量元素的竞争和拮抗作用^[12]，因此本试验选用蛋氨酸铁螯合物作为方格星虫稚虫的饲料铁源。不同生物对饲料铁需求量不同，前人的研究中，在鲤鱼(Cyprinus carpio)饲料中添加亚铁盐能有效降低饲料系数，降低发病率，最适添加水平为300 mg/kg^[13]；奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus)的养殖中，饲料铁添加水平为320 mg/kg时WGR最大^[14]。然而对投喂铁水平24.85 mg/kg的基础饲料的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)，则表现出明显的生长抑制^[15]。在给大西洋鲑(Salmo salar)投喂缺铁饲料时，血红蛋白含量和血细胞比容都有显著的降低，进而导致缺铁性贫血，影响生长^[16]。

与上述学者研究结果相似，本试验中投喂不同铁水平的饲料也会造成方格星虫稚虫的WGR、SGR和SR有显著差异。随着饲料中铁水平的上升，方格星虫的WGR、SGR和SR均呈先增加后降低的趋势。另外，在饲料蛋白质水平^[7]和糖脂比^[6]的研究中方格星虫的最大WGR达到了400%以上，而本试验中方格星虫的WGR偏低仅为200%左右，可能的原因在于纯化饲料的适口性稍差，导致方格星虫的摄食率有所降低。但由于方格星虫的食性是吞食沙子然后消化沙子表面的饲料和有机碎屑^[3]，而本试验采用的过量投喂法，并没有研究方格星虫的具体摄食率，因此纯化饲料对摄食率的影响还有待进一步研究。

不同于脊椎动物的血红素，方格星虫血液中氧载体为含铁的金属蛋白——蚯蚓血红蛋白，输送氧分子时同样需要铁原子的参与，具体为每2个铁原子结合1个氧分子^[17]。本试验中饲料过低的铁水平很有可能使得蚯蚓血红蛋白与氧分子结合量下降，影响了方格星虫的正常生长代谢，从而使得WGR和SGR低于其他各组。另外，研究表明饲料中适当添加铁能有效提高血清中的溶菌酶活性，溶菌酶活性的大小能影响鱼体的免疫力；过量添加铁能导致血清中的溶菌酶活性下降，进而使得鱼体免疫力下降^[18]。在高铁饲料喂养下，方格星虫稚虫WGR、SGR和SR不增反降的原因可能是高铁饲料影响了方格星虫的免疫力。

关于军曹鱼幼鱼(Rachycentron canadum)对饲料中铁需要量的研究中，以蛋氨酸铁为铁源，投喂不同铁水平饲料仅对鱼体的粗脂肪含量有显著影响，而各组之间水分、粗蛋白质和粗灰分含量无显著差异^[19]，本试验结果与上述研究结果一致。各试验组之间粗脂肪含量差异的原因可能在于，脂肪代谢中脂肪酸的生物合成所需碳源全部来自于乙酰辅酶A，而铁对维持和激活其活性具有重大意义^[20]。

由于各试验组饲料的基础营养成分并无显著差异，这可能是造成各组之间的水分、粗蛋白质和粗灰分含量无显著差异的原因。

CAT作为生物防御系统关键酶之一，能清除生物体内过量的过氧化氢(H₂O₂)，使细胞免于H₂O₂的侵害。铁是CAT的辅助因子，1分子酶蛋白中含有4个铁原子，因而铁对CAT的活性起着不可或缺的作用^[11]。在本试验中，不同饲料铁水平对方格星虫稚虫CAT活性有显著的影响(P<0.05)。饲料铁水平在11.2~115.6 mg/kg时，随着饲料铁水平的升高，方格星虫稚虫CAT活性呈显著升高，当铁水平达到115.6 mg/kg时CAT活性达到最大值(3.62 U/mg prot)，原因可能是饲料中铁水平升高，相应地被方格星虫吸收的铁增加，也就是CAT辅助因子越多，使得CAT活性上升。4组高铁水平饲料组(61.3、115.6、283.7、482.1 mg/kg)之间的CAT活性无显著差异。

动物机体及其组织中微量元素的含量也是评定微量元素需要量的一个重要指标。饲料中不同铁水平对大西洋鲑^[21]鱼体中的铁含量和皱纹盘鲍^[15]的软组织中的铁含量有显著影响，但是对军曹鱼鱼体的铁含量并无显著影响^[18]。在本试验中，不同饲料铁水平对方格星虫稚虫体壁的铁含量无显著影响，仅虫体内的铁含量有随着饲料铁水平增加而增高的趋势。其可能原因是基础饲料的铁水平(11.2 mg/kg)已经能满足方格星虫对铁的需要量，并且铁的吸收和利用受机体控制，投喂高铁饲料可能并不能持续提高方格星虫对饲料铁源的吸收，而已被方格星虫吸收至体内的铁，也有可能会随着机体调节而排出体外^[20]。

① 饲料铁水平对方格星虫稚虫的WGR、SGR、SR、粗脂肪含量以及CAT活性有显著影响，而对其水分、粗蛋白质、粗灰分、体壁铁以及虫体铁含量无显著影响。

② 以虫体铁含量为指标，通过折线模型回归分析，饲料铁水平为118.65 mg/kg虫体铁含量(233.85 μg/g)最大。

③ 以蛋氨酸铁为饲料铁源，铁水平为115.6 mg/kg时，WGR最大，CAT活性最高，并且拥有较高的SR，因此建议方格星虫稚虫人工配合饲料的铁水平为115.6 mg/kg。