通过T型瘘管获得部分动态食糜样品以研究养分在猪体内的消化过程及程度已成为常规的研究手段。在该技术中采样方案直接影响到食糜样品的代表性，从而影响测试结果。目前，在猪回肠末端氨基酸消化率测定的食糜采样中，不同的研究人员采用的采样方案有较大的差异。累计采样时间从16~48 h不等，重复采样天数为1~3 d。如Htoo等^[1]在研究不同蛋白质水平饲粮的猪回肠末端氨基酸消化率时，食糜收集期为正试期第67天的08:00~20:00，总共24 h。Diebold等^[2]在研究添加木聚糖酶和磷脂酶的小麦型饲粮各养分的回肠消化率时，食糜收集期为正试期第10天的08:00~20:00，第11天的02:00~14:00和20:00~08:00，第12天的14:00~02:00，总共48 h。尽管德国^[3]和荷兰^[4]分别建立了生长猪回肠氨基酸消化率的推荐测定方法，但仍指出，食糜的采样频率与持续时间以及试验猪的采食时间与频率对食糜样品的代表性有重要的影响。由此可见，现有的肠道食糜采样方案中，仍具有较大的人为随意性，难以追溯其采样的生理依据。为了使通过瘘管采集的食糜样品尽可能多地代表流经肠道全部食糜的生理信息，需要从以下3个方面进行探讨：1)不同采样时间间瘘管内食糜样品的流量有多大差异？2)每日累计采集的样品量占流经回肠末端总食糜样品量的比例？3)每日累计采集的样品中外源指示剂的总回收率及其变异是多少？为此，本试验通过比较3 d不同采样时间间生长猪回肠末端T型瘘管内食糜养分流量的变异，以瘘管收集日内16 h回肠末端食糜总流量、全天流经回肠末端食糜总流量的日间差异及日内16 h通过回肠瘘管收集食糜的三氧化二铬(Cr₂O₃)回收率，为回肠代表性食糜的采集方案提供参考。

采用3×16双因素完全随机设计，其中采样日期设3个水平，即试验期第8、9、10天。日内采样时间设16个水平，即08:00~24:00，每小时通过瘘管采集回肠末端食糜样品。待每次样品收集后置于-20 ℃保存。

选择初始体重为(21.3±1.0) kg左右的大×长二元杂交去势公猪6头，术前1周进入代谢笼。随机选择4头在回肠末端安装T型瘘管。术后恢复14 d，期间每天08:00和16:00等量饲喂饲粮1，自由饮水。从术后第2天开始饲喂自由采食量的10%，其后逐渐增加，到术后第4天，恢复自由采食。 试验期，日采食量按照100 g/kg BW^0.75分餐1次^[5]分装全部饲粮，08:00和16:00等量饲喂饲粮2。饲粮组成及营养水平见表1。试验期自由饮水，采样期间补充电解质水^[5]，其组成如下(g/L)：KCl 0.372,CaCl₂·6H₂O 0.548,MgCl₂·6H₂O 0.304,NaCl 5.260。代谢室卫生管理按动物营养学国家重点实验室常规程序进行。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diets (air-dry basis) % % 项目 Items 饲粮1(术前及术后恢复期) Diet 1 (pre-operation and post-operation recovery period) 饲粮2(试验期) Diet 2 (experimental period) 原料 Ingredients 玉米 Corn 67.30 66.90 豆粕 Soybean meal 23.02 23.02 麦麸 Wheat bran 6.00 6.00 豆油 Soybean oil 0.97 0.97 石粉 Limestone 0.85 0.85 磷酸氢钙 CaHPO4 0.55 0.55 L-赖氨酸 L-Lys 0.01 0.01 食盐 NaCl 0.30 0.30 三氧化二铬 Cr2O3 0.40 预混料 Premix1) 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 干物质 DM 90.11 89.80 消化能 DE/(MJ/kg) 13.81 13.81 总能 GE/(MJ/kg) 19.00 18.97 粗蛋白质 CP 19.16 19.13 粗脂肪 EE 4.45 4.51 钙 Ca 0.53 0.53 总磷 TP 0.48 0.48 三氧化二铬 Cr2O3 0.00 0.46 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 8 250 IU，VD3 825 IU，VE 40 IU，VK3 4 mg，VB1 1.0 mg，VB2 5 mg，VB6 2 mg，VB12 25 μg，泛酸 pantothenic acid 15.0 mg，烟酸 nicotinic acid 35.0 mg，叶酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 4 mg，氯化胆碱 choline chloride 600 mg，Cu (as copper sulfate) 50.0 mg，Fe (as ferrous sulfate) 80.0 mg，Zn (as zine sulfate) 100.0 mg，Mn (as manganese sulfate) 25.0 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，I (as potassium iodide) 0.5 mg。 2)干物质、总能、粗脂肪和粗蛋白质为实测值，其余为计算值。DM,GE,EE and CP were measured values， while the others were calculated values.

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diets (air-dry basis)

术前试验猪禁食24 h，期间自由饮水，手术室及手术台以0.01%的新洁尔灭喷雾消毒后，再以紫外灯照射30 min灭菌。手术器械、瘘管、缝合针、线等用0.05%的新洁尔灭浸泡30 min后再用生理盐水清洗。将试验猪右腹侧后半部剃毛并用生理盐水清洁。耳后肌肉注射舒泰0.08 mL/kg及速眠新Ⅱ 0.05 mL/kg作全身麻醉。待猪昏迷后，右腹侧向上保定于手术台上，用碘酊、酒精对术部进行浸染消毒。按照腹壁切开手术常规操作，在腹中线上方约20 cm、最后肋骨后约3～4 cm处，纵向作长约6~8 cm的切口。然后依次切开皮肤层、钝性撕开肌肉层，剪开腹膜层后找到回盲结合处。在距此处往前15 cm处背向肠系膜一侧的肠段上纵向作约3 cm切口，恰好将瘘管凹型端插入。然后绕瘘管作荷包缝合，轻敷青霉素后将瘘管送回腹腔。在第1道皮肤切口距头侧约3~5 cm处，作一长约3 cm的第2道切口，将瘘管管体从此处引出。切忌肠管发生前后扭转。然后套上外垫圈，以防止瘘管掉入腹腔。在第1道切口处依次缝合腹膜、纵肌、斜肌及皮肤。最后用酒精和碘酒在术部消毒，并敷青霉素粉消炎。将荷术猪转移至观察室，待其完全清醒后再转移至代谢笼内。禁饲、禁水24 h，按常规程序护理2周。当试验猪恢复了正常的采食，且体况良好后，开始试验期。

根据试验设计规定的采样日和采样时间，依次打开瘘管盖、内塞，将样品收集装置(塑料袋与内螺纹塑料连接件)拧到瘘管上。当袋内的食糜样品超过50 mL时，更换收集装置。将每次收集的样品称重(总重-皮重，精确至0.01 g)后装入每1 h的总收集袋中。-20 ℃冷冻。待试验结束后，解冻食糜样品。无损失地转移到培养皿中65 ℃烘干、称重，并迅速测定干物质含量，同时测定总能、粗蛋白质和Cr₂O₃的含量。

饲粮与食糜样品的干物质含量参照《饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定》(GB/T 6435—2006)的方法测定。总能参照《动物饲料、动物性产品和粪或尿总能的测定——氧弹式热量计法》(ISO 9831 ∶ 1998)的方法，使用Parr 6400全自动绝热式氧弹计测定。粗蛋白质含量参照《饲料中粗蛋白测定方法》(GB/T 6432—1994)，使用KDY-9820凯氏定氮仪测定。Cr₂O₃含量参照Fenton等^[6]的方法，使用紫外分光光度计测定。

食糜中养分流量及Cr₂O₃回收率的计算如下：

式中：ti为第i小时内的采样时间，单位为min；每日回肠末端食糜养分总流量，分别指干物质、总能、粗蛋白质及Cr₂O₃的总流量，计算中根据猪全消化道消化率指示剂法测定的原理^[7]假设全天回肠末端Cr₂O₃的回收率为100%。

统计分析根据双因素完全随机设计，采用SAS 9.0 GLM模块对瘘管内鲜食糜、食糜干物质、粗蛋白质、总能和Cr₂O₃的流量进行协方差分析，其中协变量为猪的采食量，主效应为采样日与日内采样时间，随机效应为试验猪个体。对16 h瘘管内食糜养分总流量、全天流经回肠末端食糜养分总流量、Cr₂O₃的回收率进行协方差分析，其中协变量为猪的采食量，主效应为采样日，随机效应为试验猪个体。组间平均值采用Duncan氏法进行多重比较。数据以最小二乘方平均值表示。

如图1所示，通过T型瘘管收集回肠末端鲜食糜及干物质的平均流量分别为169.7和13.2 g/h，日内与日间的总变异系数分别为55.01%和56.08%。采样日对回肠末端鲜食糜及干物质的流量均无显著影响(P>0.05)。日内采样时间对回肠末端鲜食糜和干物质的流量均有显著性影响(P<0.05)。采样日与日内采样时间对回肠末端鲜食糜与干物质流量的影响无显著的互作效应(P>0.05)。在食糜流量的日内变异上，回肠末端鲜食糜和干物质的流量在餐后2 h后达到最大值，然后逐渐降低，并在餐后4 h降到最低值。在随后4 h内，回肠末端鲜食糜与干物质的流量一直处于较低的水平波动。

在猪回肠末端T型瘘管中，食糜总能与粗蛋白质的平均流量分别为218.9 kJ/h和2.0 g/h，日内与日间的总变异系数分别为57.09%和56.02%。采样日期对回肠末端食糜总能流量有显著性影响(P<0.05)，对回肠末端食糜粗蛋白质的流量没有显著性的影响(P>0.05)。日内采样时间对回肠末端食糜总能和粗蛋白质的流量也均有显著性影响(P<0.05)。采样日与日内采样时间对回肠食糜总能与蛋白质的流量的影响无显著的互作效应(P>0.05)。在食糜流量的日内变异上，回肠食糜总能和粗蛋白质的流量在餐后2 h后达到最大值，然后逐渐降低，并在餐后5 h降到最低值。在随后3 h内，回肠末端食糜总能与粗蛋白质的流量一直处于较低的水平波动。

通过T型瘘管收集的回肠末端食糜中，指示剂Cr₂O₃的平均流量为0.23 g/h，日内与日间的总变异系数为61.09%。采样日期对指示剂的流量无显著影响(P>0.05)。日内采样时间对回肠末端食糜指示剂的流量有显著性影响(P<0.05)。采样日与日内采样时间对回肠食糜指示剂流量的影响无显著的互作效应(P>0.05)。在日内变异上，餐后2 h指示剂的流量达到最大值，然后逐渐降低，并在餐后5 h降到最低值。在随后3 h内，回肠末端食糜指示剂流量一直处于较低的水平波动。

由表2可知，采样日对日内通过T型瘘管连续收集16 h的回肠末端食糜干物质总量、总能总量及粗蛋白质总量均有显著性影响(P<0.05)，其日间变异系数分别为12.09%，12.99%，13.84%。其中试验期第9和10天的16 h内收集的食糜干物质总量、总能总量及粗蛋白质总量比第8天的相应值分别显著少19.1%和15.8%(P<0.05)、20.1%和16.1%(P<0.05)与19.2%和14.4%(P<0.05)。采样日对通过指示剂估测流经回肠末端的全天食糜干物质总量及总能总量也有显著性影响(P<0.05)，变异系数分别为6.97%和7.46%。其中试验期第9、10天每日流经回肠末端的食糜干物质总量及总能总量比第8天的相应值分别显著少14.0%和16.2%(P<0.05)，20.4%和22.4%(P<0.05)。采样日对通过指示剂估测流经回肠的全天食糜粗蛋白质总量没有显著性影响(P>0.05)。通过T型瘘管连续收集16 h的回肠末端食糜干物质总量、总能总量及粗蛋白质总量占全天流经回肠末端食糜的相应量的比例分别为76.3%、72.8%和71.5%。而且这一比例在采样日间无显著性差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 16 h内T型瘘管收集回肠末端食糜与全天流经回肠末端食糜养分的总量 Table 2 The nutrient flow collected for 16 h with T-cannula and passed the intestine in 24 h at terminal ileum of growing pig 养分 Nutrients 项目 Items 瘘管内16 h总流量 Pooled volume collected with T-cannula in 16 h/g 全天流经回肠末端食糜总流量 Pooled volume in 24 h at terminal ileum/g 比例 Percentage/% 干物质 DM 第8天 Day 8 233.8a 299.5a 78.5a 第9天 Day 9 189.3b 257.7b 73.4a 第10天 Day 10 193.2b 251.1b 77.0a 变异系数 CV/% 12.09 6.97 7.20 SEM 7.53 9.96 2.84 P值 P-value <0.001 0.030 0.536 总能 GE 第8天 Day 8 931.0a 1 342.2a 75.3a 第9天 Day 9 744.4b 1 068.3b 69.6a 第10天 Day 10 765.3b 1 041.1b 73.6a 变异系数 CV/% 12.99 7.46 6.88 SEM 32.05 44.29 2.58 P值 P-value <0.001 0.006 0.406 粗蛋白质 CP 第8天 Day 8 35.9a 48.9a 74.0a 第9天 Day 9 29.1b 42.3a 68.8a 第10天 Day 10 29.9b 41.8a 71.8a 变异系数 CV/ % 13.84 13.88 6.58 SEM 1.33 3.30 2.42 P值 P-value 0.002 0.071 0.443 同列数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，无字母或相同小写字母则差异不显著(P>0.05)。下表同。 In same column,valves with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 16 h内T型瘘管收集回肠末端食糜与全天流经回肠末端食糜养分的总量 Table 2 The nutrient flow collected for 16 h with T-cannula and passed the intestine in 24 h at terminal ileum of growing pig

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 生长猪回肠末端T型瘘管中食糜养分及Cr2O3的流量 Fig. 1 Flow of nutrients and chromium oxide in digesta collected with T-cannula at terminal ileum of growing pig

由表3可知，在试验期第8、9、10天，通过瘘管连续16 h收集回肠末端食糜的Cr₂O₃总量分别为3.7、3.4和3.7 g，日间变异系数为11.18%。采样日间所收集食糜Cr₂O₃的总量无显著性差异(P>0.05)。3 d采样期中，全天流经回肠末端的Cr₂O₃总量分别为4.9、4.9和4.9 g，日间变异系数为8.73%。采样日间流经回肠末端食糜Cr₂O₃的总量无显著性差异(P>0.05)。相应地，3个采样日内通过瘘管16 h连续收集回肠末端食糜Cr₂O₃总量占全天流经回肠末端Cr₂O₃总量(回收率)的比例分别为75.4%、69.7%和73.7%，回收率在日间无显著性差异(P>0.05)。

食糜养分的流量是由食糜流量及食糜中养分的含量2个数据相乘得出。在胃肠道鲜食糜流量的控制上，胃内液态食糜的排空主要受胃与十二指肠压力差的控制，而固态食糜的排空受食糜粒度(阈值：直径<2.0 mm)的控制^{[8, 9]}。由此表明，胃排往小肠的食糜在组成上是由固态物质与液态物质按不同的比例混合而成，因此，进入小肠的食糜在化学组成上是波动的。在鲜食糜的流量变化上，餐后1 h内，随着食糜在胃内的充盈，渗透压增加，胃的收缩运动增强，食糜排空速度快。随着食糜的排空，渗透压逐渐降低，排空速度减慢^[9]。食糜进入小肠后，依靠小肠的分节运动和蠕动推动食糜向后段肠道。食糜中的固态和液态部分受肠内渗透压及“回肠制动”的控制^[10]，加之，由胃进 入十二指肠食糜流量及在组成上的波动，最终表 现在不同时间内收集的回肠食糜养分在流量也是波动的。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 16 h内T型瘘管收集回肠末端Cr2O3的总量与全天流经回肠末端食糜Cr2O3的总量 Table 3 The pooled chromium oxide in digesta collected for 16 h with T-cannula and passed the intestine in 24 h at terminal ileum of growing pig 项目 Items 通过瘘管收集16 h Cr2O3总量 Pooled Cr2O3 collected with T-cannula in 16 h/g 流经回肠末端的全天Cr2O3总量 Pooled Cr2O3 pass terminal ileum in 24 h1)/g 16 h Cr2O3回收率 Recovery rate of Cr2O3 in 16 h/% 第8天 Day 8 3.7a 4.9 75.4 第9天 Day 9 3.4a 4.9 69.7 第10天 Day 10 3.7a 4.9 73.7 变异系数 CV/% 11.18 8.73 6.87 SEM 0.12 — 2.58 P值 P-value 0.401 — 0.405 1)数值根据猪全消化道消化率指示剂法的测定原理[7]，假设全天回肠末端Cr2O3的回收率为100%，由1.6中公式计算得出。 Values were calculated on the formula shown in section 1.6. The recovery rate of Cr2O3 at terminal ileum was assumed to be 100%，which was in accordance with the method for determination of total tract apparent digestibility in pig[7].

表3 16 h内T型瘘管收集回肠末端Cr2O3的总量与全天流经回肠末端食糜Cr2O3的总量 Table 3 The pooled chromium oxide in digesta collected for 16 h with T-cannula and passed the intestine in 24 h at terminal ileum of growing pig

本试验中，每日2个餐后2 h后回肠鲜食糜、干物质及养分与指示剂的流量达到最大值，在餐后4~5 h流量降至最低。这一现象与上述猪胃肠道内食糜流量的控制机制相符，也处于食糜在猪胃-小肠内平均停留时间的正常范围内^{[11, 12, 13]}。在日内变化规律上，鲜食糜流量与干物质流量、养分流量及指示剂流量都有类似的规律。这表明不同时间采集食糜的干物质、养分及指示剂含量的变异远低于鲜食糜流量的变异，从而使得干物质及养分与指示剂流量的日内变异系与鲜食糜流量的变异系数都比较接近。在日间差异上，尽管鲜食糜的流量无日间显著性差异，但干物质的流量有日间显著性差异，其差异来自于采样期第1天的流量显著地高于第2、3天的流量。由此导致食糜总能与粗蛋白质的流量也呈现类似差异。这表明猪回肠食糜流量在日间平均流量也具有不稳定性。特别是采样首日是否因猪对采样的不适应性导致养分的平均流量与后2 d有显著差异，尚需要进一步研究。

测定饲粮养分在回肠末端的消化率，样品的代表性非常关键^{[3, 4]}。现有研究表明，不同采样时间回肠末端食糜中样品养分及指示剂含量是波动的^{[14, 15]}，其中指示剂含量的变异系数达到13%^[15]。因此，采集某几个时间点的食糜样品作为测定消化率的依据可能会产生较大的误差。目前，国际上在猪回肠末端消化率的测定上，采样方案有较大的差异(表4)。从本试验结果来看，通过T型瘘管连续收集16 h回肠食糜，其干物质总量占全天流经回肠末端食糜总量的73%以上，总能与粗蛋白质的总量占全天流经回肠末端的68%以上，且这一比例的日间差异不显著，表明16 h所收集的样品具有较好的代表性。特别是16 h从回肠末端收集的Cr₂O₃总量在日间相对稳定，回收率在69%以上。这表明日内2个餐后连续采集8 h回肠食糜的样品代表性是可以接受的。但综合前面讨论的结果，在3 d的收集中，后面2 d回肠食糜的平均流量相对稳定。因此，在3 d的采样中建议取后面2 d的样品作为分析用样品。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 文献报道的猪回肠食糜采样方案 Table 4 The published collection schemes for ileal digesta in pigs 试验目的 Experimental objective 饲喂时间 Feeding time 回肠末端食糜收集方案 Collection scheme for ileal digesta 采样日期 Collection day 参考文献 References 回肠食糜内源氨基酸组成 Composition of endogenous amino acid in terminal ileal digesta 08:00,20:00 连续24 h收集 正试期 第8天 De Lange 等[16] 回肠食糜流动时间 Transit of ileal digesta 08:00,16:00 连续36 h收集，前3 h内 每隔20 min收集20 min，此后， 每隔1 h收集1 h 正试期 第6天 Solà-Oriol 等[17] 回肠食糜内源氨基酸 Endogenous amino acid in terminal ileal digesta 08:00,20:00 共收集24 h，第7~8天 08:00~10:00全部收集， 此后每隔2 h收集2 h 正试期 第7～8天 Fan 等[18] 回肠食糜内源氨基酸 Endogenous amino acid in terminal ileal digesta 08:00,20:00 共收集4 d，08:00~20:00, 全部收集 正试期 第12天 Jansman 等[19] 回肠末端食糜流动时间 Transit of ileal digesta 07:00,15:00 共收集2 d，每天 07:30~18:30收集样品 正试期 第16~17天 Owusu- Asiedu 等[20] 回肠末端消化率 Digestibility at terminal ileum 08:00,20:00 共收集48 h，第10天08:00~20:00, 02:00~14:00, 02:00~8:00,14:00~ 02:00,全部收集 正试期 第10~12天 Diebold 等[2] 回肠末端氨基酸消化率 Amino acid digestibility at terminal ileum 08:00,16:00,24:00 共收集24 h，第6~7天08:00~ 20:00,02:00~14:00,02:00~ 08:00,14:00~02:00,全部收集 正试期 第6~7天 Htoo 等[1] 回肠末端消化率 Digestibility at terminal ileum 08:30,11:30 共收集20 h，每天08:30~ 16:30,全部收集 正试期 第10~11天 Donkoh 等[21] 回肠末端消化率 Digestibility at terminal ileum 08:00,20:00 共收集18 h，第11~12天 08:00开始36 h内每隔1 h 收集1 h 正试期 第11~12天 Imbeah 等[22] 仔猪回肠末端消化率 Digestibility at terminal ileum of piglets 08:00,16:00,24:00 共收集24 h，第6~7天 08:00~16:00,24:00~08:00, 16:00~24:00,全部收集 正试期 第6~7天 Caine 等[23] 仔猪蛋白质回肠末端消化率 Digestibility of crude protein at terminal ileum of piglets 08:00,20:00 共收集24 h，第6天08:00~ 20:00,第7天20:00~08:00, 全部收集 正试期 第6~7天 Urbaityte 等[24]

表4 文献报道的猪回肠食糜采样方案 Table 4 The published collection schemes for ileal digesta in pigs

① 生长猪回肠末端食糜养分及指示剂的流量在日内采样时间上有显著差异，在3 d的收集中，后面2 d食糜养分的平均流量相对稳定。

② 2个餐后8 h的连续收集食糜有较好的代表性，建议3 d采样中，第1天作为采样预试期，后面2 d作为采样正试期。