2. 四川农业大学动物营养研究所, 成都 611130;
3. 鱼类营养与安全生产四川省高校重点实验室, 雅安 625014
, ZHOU Xiaoqiu2,3, HU Yi1, LI Jiayong1, LI Qian1, FENG Lin2,3, JIANG Weidan2,3, LIU Yang2,3, JIANG Jun1,2,3
2. Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
3. Fish Nutrition and Safety Production University Key Laboratory of Sichuan Province, Ya'an 625014, China
随着人们生活水平的提高，对鱼肉品质和风味的要求也越来越高。然而，在养殖过程中，高密度饲养、养殖环境恶化等导致鱼肉品质下降的问题日趋严重。因此，如何提高鱼肉品质和改善鱼肉风味是目前水产养殖研究的热点之一。谷氨酸是一种重要的风味氨基酸，其与肌苷酸(IMP)具有协同呈鲜味作用，当二者比例为1 ∶ 1时，鲜味强度是等量谷氨酸鲜味强度的30倍[1]。Larsson等[2]研究表明，饲料中添加谷氨酸提高了大西洋鲑冰冻鱼片的硬度，提高了肌肉中饱和脂肪酸、二十二碳五烯酸和ω-3脂肪酸的含量。蒋克勇[3]研究表明，饲料中添加谷氨酸显著提高了对虾肌肉中IMP含量。马现永等[4]在黄羽肉鸡上的研究表明，饲料中添加谷氨酸钠可提高肌肉中风味氨基酸含量及其风味物质形成相关基因的表达，从而提高肉品风味。因此，谷氨酸可能通过改善肌肉营养组成，提高肌肉中风味物质含量，以改善肌肉品质。草鱼是我国主要的淡水养殖品种，具有生长速率快、饲料转化率高和营养价值高等优点，但到目前为止，关于谷氨酸对草鱼肌肉品质的影响鲜有报道。为此，本研究拟在饲料中添加不同水平的谷氨酸，研究其对生长中期草鱼肌肉质构、组织特性及营养组成的影响，进一步探索谷氨酸对风味物质形成相关基因表达的影响，为谷氨酸在水产饲料中的合理使用提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料
试验用谷氨酸购自梅花生物科技集团股份有限公司，纯度≥99%。 1.2 试验设计
试验选取初始体重为(370.0±3.8) g的健康草鱼540尾，随机分为3组，每组3个重复，每个重复60尾鱼。以豆粕、菜籽粕、棉籽粕为主要蛋白质源，以豆油为脂肪源配制基础饲料，以谷氨酸分别替代基础饲料中0(对照)、0.8%和1.6%的面粉[5, 6]，配制成3种试验饲料。试验饲料组成及营养水平见表1。各饲料原料经粉碎过60目筛，混匀后制粒，-20 ℃保存备用。 1.3 饲养管理
试验在四川农业大学动物科技学院水产科研试验基地进行。试验池为圆形水泥池，直径为8 m，共9口，平均水深1 m，草鱼购回后进行为期2周的驯化，分组称重后进行正式试验。试验每天于07:00、11:00、15:00、19:00定点投喂4次，水泥池底部设置投料盘，投喂量保证每次投喂30 min后料盘上有少量剩料，每天收集剩料并烘干称重，准确记录剩料量。试验为期8周，每5 d换掉全池1/3的水，注入曝气后的自来水，全天不间断微孔增氧，溶解氧浓度≥6 mg/L，自然水温和光照，水温(26.5±3.0) ℃，pH 7.5±0.3，氨态氮浓度<0.50 mg/L，硝态氮浓度<0.05 mg/L。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
饲养试验结束后，对每池鱼称重，计算平均体重，每池随机选取接近平均体重的鱼3尾，样品的收集参照Periago等[7]的方法，具体如下：先将采样鱼处死，电子天平称量每尾鱼的体重。然后分别从鱼体左侧背鳍下方和臀鳍上方侧线以上位置(图1中B区)取下白肌组织，用于肌纤维结构分 析。使用Videoplan图像分析仪估测横截面积后 将肌肉样品修整为1 cm×1 cm×1 cm的组织块，放入预先用液氮冷冻至-160~-155 ℃的异戊烷中，再放入液氮中保存备测肌纤维面积和直径。使用Leica CM 1850冷冻切片机切片，苏木精-伊红染色制成横切片，使用Axio-Vision 4.6软件进行分析，随机选择10个视野，每个视野测量20根肌纤维的面积和直径，据肌纤维面积和直径计算肌纤维密度。
 | 图1 取样部位示意图 Fig. 1 Sampling location schematic diagram |
每池随机选取接近平均体重的鱼3尾，取右侧侧线上方背鳍后方白肌(图1中C区)用于pH测定，参照Erkan等[8]的方法进行，每块肌肉重复测定3次，以3次的平均值作为此时的pH。使用肉质pH测定仪(FC232D，Hanna Instruments Inc.，意大利)进行测定。 1.4.3 肌肉质构特性测定
每池随机选取接近平均体重的鱼3尾，去皮、去内脏后，取左侧背鳍前方侧线上方(图1中A区)的白肌，将其修整为2 cm×2 cm×2 cm的块状，用TA-XT Plus质构仪(Stable Micro Systems)，P/50探头测定肌肉质构特性。测试条件：测试前速率3 mm/s，测试速率1 mm/s，测试后速率1 mm/s，压缩程度60%，停留时间5 s，每个样品重复测定6次，取平均值。其中，硬度为肌肉样品达到一定变形时所需的力，其值为第1次穿冲样品时的压力峰值；弹性为变形样品在去除变形力后恢复到变形前的条件下的高度比率，用第2次穿冲的测量高度同第1次的测量高度的比值表示；黏聚性表示样品内部的黏合力，即样品拉在一起的内聚力，表现为2次压缩所做正功之比；咀嚼性，数值上为硬度×黏聚性×弹性；胶黏性为测试样品的黏性特性，数值上为硬度×黏聚性。 1.4.4 肌肉常规养分、氨基酸及IMP含量测定
参照AOAC(1990)方法分析肌肉常规养分含量，每组取9尾鱼，每尾鱼取背部肌肉50 g左右，经冷冻干燥后测定，其中：水分含量采用105 ℃常压干燥法测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定；粗灰分含量采用高温灼烧法测定。肌肉氨基酸含量使用日立L-8800型氨基酸分析仪测定。另取1份新鲜肌肉样品使用HP1100高效液相色谱仪测定IMP含量。 1.4.5 肌肉腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因表达检测
每池随机选取接近平均体重的鱼3尾，取侧线上方背鳍后方白肌用于ADSL基因表达的检测。使用Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度，利用TaKaRa反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT)将总RNA反转录为cDNA。反转录产物于-20 ℃保存备用。内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的引物序列：上游，5′-CGTGATGGACTCTGGTGATG-3′；下游，5′-TCGGCTGTGGTGGTGAAC-3′(GenBank登录号为M24113)。ADSL基因的引物序列：上游，5′-AAGTTGGCTCGTGTCATAGA-3′；下游，5′-CTGGTTGATAGTGGGTGAAG-3′(GenBank登录号为EU571219)。实时荧光定量PCR采用20 μL反应体系：2 μL反转录产物、10 μL SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ(TaKaRa)、1 μL上游引物、1 μL下游引物、6 μL无RNA酶水。反应程序为：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，38个循环。每个样品重复3次，平行样间相对偏差不大于10%。 1.5 数据分析
试验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 11.5软件进行方差分析，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较。P＜0.05为差异显著性判断标准。 2 结果与分析 2.1 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉形态学指标和pH的影响
经测定，添加0、0.8%和1.6%谷氨酸的组取样草鱼的平均体重分别为(516±17) g、(537±19) g和(527±12) g，组间差异不显著(P>0.05)。由表2可知，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸显著降低了肌纤维直径(P<0.05)，显著提高了肌纤维密度(P<0.05)，但对肌肉横截面积和pH无显著影响(P>0.05)。
| 表2 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉形态学指标和pH的影响 Table 2 Effects of dietary Glu on muscle morphological parameters and pH of grass carp (Ctenopharyngodon idella) during middle growth period |
由表3可知，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸显著提高了肌肉硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性(P<0.05)，而对肌肉黏聚性无显著影响(P>0.05)。
| 表3 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉质构特性的影响 Table 3 Effects of dietary Glu on muscle texture characteristics of grass carp during middle growth period |
由表4可知，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸对肌肉水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量均无显著影响(P>0.05)。
| 表4 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉常规养分组成的影响 Table 4 Effects of dietary Glu on conventional nutrient composition in muscle of grass carp during middle growth period |
由表5可知，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸对肌肉氨基酸组成无显著影响(P>0.05)。
| 表5 饲料中添加谷氨酸对生长中期草肌肉氨基酸组成的影响 Table 5 Effects of dietary Glu on amino acid composition in muscle of grass carp during middle growth period |
由表6可知，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸显著提高了肌肉IMP含量(P<0.05)，其中谷氨酸添加水平为1.6%时最高。饲料中添加0.8%的谷氨酸显著提高了肌肉ADSL mRNA相对表达量(P<0.05)，饲料中添加1.6%的谷氨酸对肌肉ADSL mRNA相对表达量虽也有提高作用，但差异不显著(P>0.05)。
| 表6 饲料中添加谷氨酸对肌肉IMP含量和ADSL mRNA相对表达量的影响 Table 6 Effects of dietary Glu on IMP content and relative expression level of ADLS mRNA in muscle of grass carp during middle growth period |
肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的状态直接影响肉质形状，最终决定了肌肉的品质。肌纤维组织结构的变化影响肌肉的嫩度、多汁性、保水性和口感等指标，因此，鱼的肌纤维结构被普遍用于鱼肌肉品质的评定[9]。鱼类骨骼肌由红肌纤维、白肌纤维以及存在于二者之间的粉肌纤维组成，其中白肌纤维占鱼体骨骼肌总量的95%左右[10]。因此，鱼类骨骼肌的生长主要通过白肌纤维的肥大和增生得以实现[11]。肌纤维直径主要取决于年龄、营养状况和运动量等因素。本研究结果表明，饲料中添加1.6%的谷氨酸显著降低了生长中期草鱼的肌纤维直径，提高了肌纤维密度，但对肌肉横截面积无显著影响。Kiessling等[12]研究表明，营养水平在一定程度上影响肌纤维直径的生长规律，限制饲喂和营养过度极显著影响白肌纤维直径。Johnston等[13]研究表明，低蛋白质饲料显著降低大西洋鲑的肌纤维直径。因此，饲料中添加谷氨酸可通过影响肌纤维结构从而影响肌肉品质，其具体机制有待进一步研究。肌肉pH是一个中性性状，鱼类死亡后，肌肉中的糖原通过糖酵解反应生成乳酸和ATP，产生H+，使其pH降低，导致鱼肉蛋白质变性，从而影响鱼肉品质[14]。因此，pH可作为鱼类等水产品鲜度变化的一个重要指标。本研究结果表明，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸对肌肉pH无显著影响。 3.2 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉质构特性的影响
肌肉的质构特性是决定其可口性的重要因素，是肉品主要的感官和理化指标。质构分析法是模拟人口腔的咀嚼运动，对样品进行压缩，根据样品压缩时变形所需要的压力、压缩完毕后恢复的程度及压缩峰面积等计算各种指标的值，包括硬度、弹性、咀嚼性等。硬度表现为人体的触觉——柔软或坚硬，使食品达到一定变形所需要的力，食品保持形状的内部结合力。硬度越大，抵抗牙齿压力的能力越大，发生断裂所需的变形力越大，弹性也相应的越大。咀嚼性是一项质地综合评价参数，它是肌肉硬度降低、肌肉细胞间凝集力降低、肌肉弹性减小等综合作用的结果。胶黏性是用来描述半固态食品在一定力作用下流动性的参数[15]。本研究结果表明，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸可显著提高生长中期草鱼肌肉的硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性。Larsson等[2]研究表明，饲料中添加谷氨酸提高了大西洋鲑冰冻鱼片的硬度，与本试验结果一致。 3.3 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉常规养分和氨基酸组成的影响
相比陆生动物，肌肉是水生动物最主要的可食部分。鱼体组成的60%是肌肉组织，因此肌肉组织的组成会影响鱼的肌肉品质[16]。鱼类肌肉的构成成分主要包括水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分等。氨基酸是蛋白质的基本构成单位[17]。蛋白质是生物机体内重要的营养物质，其营养价值主要由氨基酸的种类、组成、比例及必需氨基酸的含量共同决定。本试验结果表明，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸对生长中期草鱼肌肉常规养分和氨基酸的组成均无显著影响。这与Larsson等[2]在大西洋鲑上的研究结果一致。 3.4 饲料中添加谷氨酸对生长中期草鱼肌肉IMP含量和ADSL基因表达的影响
IMP是构成肌肉鲜味的主要成分之一[18]。鱼死亡后，正常的生理代谢机能遭到破坏，在糖酵解酶作用下开始无氧酵解，生成乳酸使pH下降，同时激活ATP酶，部分ATP在ATP酶的作用下，分解成二磷酸腺苷(ADP)。ADP在肌酸激酶的作用下，分解成腺苷酸(AMP)。AMP在脱氨酶作用下，脱氨形成IMP，IMP又可在磷酸酯酶的作用下形成肌苷，并进一步在核苷水解酶的作用下分解成次黄嘌呤和核糖[19]。IMP合成酶系中至关重要的ADSL是催化嘌呤核苷酸起始合成与循环的唯一双功能酶，它对IMP的合成具有关键的调控作用[20]。本研究结果表明，饲料中添加0.8%和1.6%的谷氨酸显著提高了生长中期草鱼肌肉IMP含量，且当谷氨酸添加水平为1.6%时最高。饲料中添加0.8%的谷氨酸显著提高了肌肉ADSL mRNA的相对表达量。蒋克勇[3]研究表明，饲料中添加谷氨酸可显著提高对虾肌肉IMP含量。马现永等[4]在黄羽肉鸡上的研究表明，饲料中添加谷氨酸钠可提高肌肉中风味氨基酸的含量及其风味物质形成相关基因的表达，从而提高肉品风味。这些研究结果均与本试验结果一致。因此，饲料中添加谷氨酸可能通过提高IMP合成过程中相关酶的表达来提高肌肉中IMP含量，从而提高肌肉风味。 4 结 论
在本试验条件下，饲料中添加谷氨酸可改善生长中期草鱼的肌纤维结构和肌肉质构特性，提高肌肉中风味物质IMP的含量，从而改善肌肉品质。
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