氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤^[1]。当机体遭受到体内外各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统平衡失调，自由基的产生量会远远超过机体的清除能力，抗氧化系统不能及时的清除就会导致过多的自由基，从而导致氧化应激^[2]。奶牛由于泌乳期间的高代谢率，往往会产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，导致乳腺的氧化应激，尤其对于高产奶牛^[3]。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)是乳腺组织的主要构成细胞，是乳脂和乳蛋白合成与分泌的重要场所，其细胞的生物合成能力决定了奶牛乳腺的产奶能力^[4]。由于奶牛泌乳期间代谢旺盛，BMEC是乳腺组织受到氧化应激首先攻击的细胞^[5]。因此，BMEC是建立奶牛氧化应激模型的理想组织细胞，建立一个成功可靠的BMEC氧化应激模型，对于揭示氧化应激机制、研究有效的抗氧化措施、提高抗氧化功能和产奶性能具有重要的意义。过氧化氢(hydrogen peroxide,H₂O₂)是一种重要的活性氧，极易穿过细胞膜，与细胞内亚铁离子(Fe²⁺)通过Fenton反应形成高活性的自由基，导致一系列反应，因H₂O₂容易获得，性质相对稳定，操作简单，是目前研究各类细胞氧化损伤的重要工具^[1]。目前，以H₂O₂为应激源构建细胞氧化损伤模型的报道中，关于H₂O₂作用浓度与时间的差别较大。韩飞等^[6]用10、100和1 000 μmol/L H₂O₂作用人肝癌细胞(HepG2)4 h后，结合细胞存活率及对DNA损伤程度结果，选择100 μmol/L作为HepG2细胞氧化模型的适宜浓度。彭亮等^[7]选用人的脐静脉内皮细胞为试验材料，最终选择1 000 μmol/L H₂O₂作用1 h来构建其氧化损伤模型。由此可见，不同的细胞对于抵抗外界应激源的反应敏感程度不同，所以构建氧化损伤模型使用的H₂O₂作用浓度与作用时间也不同。可见，目前大多数氧化应激模型的建立都集中于肝细胞或者是医学领域的心肌细胞，对于BMEC的氧化应激模型建立的研究鲜见，而关于建立BMEC氧化损伤模型的判别标准的研究则尚未见报道。鉴于此，本试验通过研究H₂O₂的作用浓度和作用时间对BMEC存活率和抗氧化指标的影响，研究建立BMEC氧化损伤模型，为进一步深入研究BMEC的氧化应激机制和抗氧化措施奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料

DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰岛素转铁蛋白溶液、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、双抗均购自美国Gibco公司；H₂O₂、表皮生长因子、氢化可的松、催乳素、两性霉素B均购自美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Amresco公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 1.2 试剂配制

H₂O₂原液的配制方法：35% H₂O₂浓度约为10 mol/L。取l mL稀释到10 mL，配制成浓度为1 mol/L(1 000 mmol/L)的H₂O₂原液，按照试验要求配制成不同浓度的H₂O₂贮备液(0、100、200、400、600、800和1 000 mmol/L)。在试验开始前，用不同浓度的H₂O₂贮备液配制成含不同浓度H₂O₂的细胞培养液，保证各浓度培养液中加入的H₂O₂溶液体积相等，使得细胞培养液中除H₂O₂浓度不同外，其他成分都相同。

细胞培养液的配制：将20 μL不同浓度的H₂O₂贮备液加入到19.98 mL的DMEM/F12基础培养液中，使反应体系培养液中H₂O₂作用浓度分别为0、100、200、400、600、800和1 000 μmol/L。配制好的液体用0.22 μm的过滤器过滤，每次换液时现配。
1.3 BMEC的培养

奶牛乳腺组织取自于内蒙古呼和浩特市北亚清真冷库，采用胶原酶消化法获得BMEC。具体为将采集的健康的黑白花奶牛乳腺组织迅速带回实验室，减去外层组织，取里层组织块装入含3×双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)的贮液瓶中，转入超净台中经含3×双抗的PBS清洗3遍、75%医用酒精(30 s)清洗1遍、含1×双抗的PBS清洗3遍后，用眼科剪剪去乳腺组织块的表面部分，于深层腺泡多的地方剪取1 mm³大小的小块装入5 mL的离心管中，充分剪碎后加入等体积的0.5%的胶原酶Ⅱ，置于37 ℃的培养箱中消化1 h，每隔20 min拿出轻轻摇晃离心管1次，使小组织块充分消化。消化液用80目的细胞滤网过滤，收集滤液于15 mL的离心管中，1 300 r/min离心5 min后，移去上清。然后用PBS重新悬浮细胞，1 300 r/min离心3 min后，再次吸弃上清，培养液重新悬浮细胞后接种于25 cm²的培养瓶中，置于培养箱(37 ℃、5% CO₂)中培养。待原代细胞80%～90%贴壁长满培养瓶瓶底时，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化传代细胞。

将传至第3代贴壁生长的BMEC接种于96孔细胞培养板和60 mm培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液(含1 μg/mL氢化可的松、0.5%胰岛素转铁蛋白硒钠、10 ng/mL表皮生长因子、5 μg/mL催乳素)直至80%～90%细胞贴壁后进行后续试验。 1.4 试验设计

本试验分2部分进行。试验一采用单因子完全随机试验设计，将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42个组，每个组10个重复。细胞中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000 μmol/L H₂O₂，使之分别作用2、4、6、8、12和24 h，测定细胞数量，计算存活率。其中，0 μmol/L组为对照组。以细胞存活率为主要指标初步筛选H₂O₂作用时间和作用浓度。

试验二是采用试验一筛选得出适宜H₂O₂作用时间(6 h)，采用单因子随机试验设计，将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组，每组6个重复，BMEC中添加不同浓度的H₂O₂(0、100、200、400、600、800和1 000 μmol/L)，使H₂O₂作用于细胞6 h后，收集细胞和培养液测定抗氧化指标，进一步筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H₂O₂作用浓度。其中，0 μmol/L组为对照组。 1.5 样品采集

细胞培养液样品采集：BMEC培养6 h后，从每组的每个重复中吸取细胞培养液，分别收集于1.5 mL Eppendof管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清液用于CAT和SOD活性的测定。

用于酶活性测定的细胞样品采集：BMEC培养6 h后，弃上清，在每培养皿中加入1 mL PBS清洗贴壁生长的BMEC 2遍，弃去液体，加入动物细胞裂解液后放置于冰上冰浴30 min，用细胞刮板刮取贴壁细胞，收集细胞悬液到1.5 mL Eppendorf管中，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液用于细胞中GPx活性和MDA含量的测定。 1.6 测定指标及方法 1.6.1 存活率

存活率采用噻唑蓝(MTT)法测定，以吸光度值反映细胞的数量。将细胞悬液以1×10⁴个/mL的密度接种于96孔培养板，按上述试验设计培养24 h后，各培养孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL；4 h后，弃上清液，甩板并拍干液体，每孔加入DMSO 100 μL，用全自动酶标仪设置程序振荡10 min，而后检测各孔490 nm波长下的吸光度值(OD_{490 nm})。根据下列公式计算存活率。 存活率(%)=100×试验组OD_{490 nm}/ 对照组OD_{490 nm}。 1.6.2 抗氧化指标

GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，CAT活性采用比色法测定；SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，具体操作过程按照试剂盒说明书进行。 1.7 试验数据处理

所有数据经Excel进行整理和计算，试验数据采用SAS 9.0分析软件的方差分析(ANOVA)程序进行显著性检验和多重比较，P<0.05表示差异显著，0.05<P≤0.10表示差异趋于显著，P>0.10表示差异不显著。 2 结 果 2.1 H₂O₂作用浓度和作用时间对BMEC数量的影响

由表1可见，在所有作用时间下，H₂O₂作用浓度对BMEC数量均有显著的影响(P<0.05)，并且随着H₂O₂作用浓度的增加，细胞的吸光度值均依次显著减小，即细胞数量显著降低(P<0.05)。与对照组相比，当H₂O₂作用浓度为100 μmol/L时，作用时间在2～8 h均未对细胞数量造成显著影响(P>0.10)；作用12和24 h，细胞数量显著减少(P<0.05)，存活率分别为93.62%和92.48%。当H₂O₂作用浓度增加到200～400 μmol/L时，除4和8 h作用时间外，其他各作用时间的细胞数量均显著低于对照组(P<0.05)。当H₂O₂作用浓度达到600 μmol/L时，所有作用时间的细胞数量与对照组相比均显著减少(P<0.05)，2、4、6、8、12和24 h细胞存活率分别为87.30%、91.94%、79.79%、76.34%、60.00%和49.27%，而且当作用时间在6 h以上时，其细胞数量显著低于0～400 μmol/L组(P<0.05)。当H₂O₂作用浓度增加到800、1 000 μmol/L时，所有作用时间的细胞数量均急剧减少，显著低于其他各组(P<0.05)，细胞的存活率分别从2 h的57.54%和56.35%降低到24 h的38.11%和20.15%，细胞死亡率高达40%～80%。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 H2O2作用浓度和作用时间对BMEC数量的影响 Table 1 Effects of concentration and action time of H2O2 on BMECs count OD490 nm H2O2作用浓度 H2O2 action concentration/(μmol/L) 作用时间 Action time/h 2 4 6 8 12 24 0 0.252a 0.298a 0.287a 0.279a 0.345a 0.412a 100 0.247a 0.296a 0.284a 0.276a 0.323b 0.381b 200 0.230b 0.293ab 0.261b 0.274a 0.309c 0.377b 400 0.229b 0.291ab 0.258b 0.271a 0.292d 0.331c 600 0.220b 0.274b 0.229c 0.213b 0.207e 0.203d 800 0.145c 0.218c 0.187d 0.190c 0.171f 0.157e 1 000 0.142c 0.153d 0.122e 0.101d 0.108g 0.083f SEM 0.005 0.006 0.005 0.008 0.005 0.007 P值 P-value <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 同列肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 The values in the same column with the same letter superscript mean no significant difference (P>0.05),while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表1 H2O2作用浓度和作用时间对BMEC数量的影响 Table 1 Effects of concentration and action time of H2O2 on BMECs count

随着H₂O₂作用时间的延长，不同浓度H₂O₂组细胞数量呈不同的变化规律。H₂O₂作用4 h与作用2 h相比，所有浓度H₂O₂组细胞数量均呈升高趋势；作用6～8 h，与4 h相比，所有浓度H₂O₂组细胞数量均呈降低趋势；然而，作用12～24 h，600～1 000 μmol/L组的细胞数量随着H₂O₂作用时间的延长逐渐减弱，而100～400 μmol/L组的细胞数量随着时间的延长反而升高。其中，细胞存活率在70%～80%范围内的H₂O₂作用浓度与作用时间分别是：800 μmol/L H₂O₂作用细胞4 h、600 μmol/L H₂O₂作用细胞6 h、600 μmol/L H₂O₂作用细胞8 h，细胞的存活率分别为73.15%、79.79%和76.34%。 2.2 H₂O₂作用浓度对BMEC抗氧化指标的影响

由表2可见，随着H₂O₂作用浓度升高，细胞GPx活性显著下降(P<0.05)，其中，以600～1 000 μmol/L组较低，显著低于其他各组(P<0.05)，但600、800和1 000 μmol/L组之间无显著差异(P>0.10)；对照组最高，显著高于其他各组(P<0.05)；100、200和400 μmol/L组居中。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 H2O2作用浓度对BMEC抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of action concentration of H2O2 on antioxdant paramaters of BMECs H2O2作用浓度 H2O2 action concentration/ (μmol/L) 谷胱甘肽过氧化物酶 GPx/ (IU/mg prot) 过氧化氢酶 CAT/ (IU/mL) 超氧化物歧化酶 SOD/ (IU/mL) 丙二醛 MDA/ (nmol/mg prot) 0 157.17a 1.73a 17.6a 1.75c 100 139.99ab 1.51a 16.91a 1.96c 200 124.57b 1.36ab 16.69a 2.13bc 400 112.32b 1.13b 15.76b 2.47b 600 84.07c 0.7c 14.4c 4.63a 800 75.88c 0.54c 14.12c 4.88a 1 000 68.19c 0.36c 13.97c 4.86a SEM 8.55 0.11 0.34 0.13 P值P-value <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1

表2 H2O2作用浓度对BMEC抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of action concentration of H2O2 on antioxdant paramaters of BMECs

600～1 000 μmol/L的H₂O₂作用浓度引起培养液CAT和SOD活性显著下降(P<0.05)，显著低于其他各组，但600、800和1 000 μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)；400 μmol/L组的培养液CAT和SOD活性显著低于对照组和100 μmol/L组(P<0.05)，与200 μmol/L组之间无显著的差异(P>0.10)。从总趋势看，对照组的培养液CAT和SOD活性最高，100、200和400 μmol/L组居中，600、800和1 000 μmol/L组较低。

细胞MDA含量与上述GPx、CAT、SOD活性出现相反的变化规律。H₂O₂作用浓度为600～1 000 μmol/L时，细胞MDA含量较高，显著高于对照组及100～400 μmol/L组(P<0.05)，但这3组比较无显著的差异(P>0.10)；作用浓度为400 μmol/L时，细胞MDA含量显著高于对照组和100 μmol/L组(P<0.05)，但与200 μmol/L组之间无显著的差异(P>0.10)。由此得出，600、800和1 000 μmol/L组的细胞MDA含量较高，其次为100、200和400 μmol/L组，对照组最低。 3 讨 论

H₂O₂是一种重要的ROS，极易穿过细胞膜，与细胞内Fe²⁺通过Fenton反应形成高活性的自由基(·OH)，导致一系列反应，因H₂O₂容易获得，性质相对稳定，操作比较简单，所以它是目前应用最为广泛的氧化损伤模型的应激源，是研究各类细胞氧化损伤时使用的主要方法之一^[1]。然而，以H₂O₂为刺激源诱导建立细胞氧化应激模型的方法在医学领域应用较多，如体外培养的心肌细胞及肝脏细胞，关于建立BMEC的氧化应激损伤模型的研究报道极少。而且，以H₂O₂为应激源构建细胞氧化损伤模型的报道中，判断氧化应激是否发生所选择的判别指标与判别标准不同。一些研究认为，MTT法具有特异性强、重复性好、快速、准确等优点，通过测定其吸光度值的大小即可反映出细胞数量的多少，也可反映出细胞增殖的快慢，进而可以作为建立氧化应激模型的判别指标^{[8, 9]}，但目前选择的判别标准不完全相同。Huo等^[10]报道在小鼠的心肌细胞中，选取细胞存活率为40%～50%作为H₂O₂氧化损伤模型的依据。Wei等^[11]研究表明，以H₂O₂氧化诱导鼠嗜铬细胞瘤，以细胞死亡率为25%作为建立氧化损伤模型时选择H₂O₂适宜浓度的判别标准。孙婧陶等^[12]指出，以细胞死亡率为50%～60%作为建立延边奶山羊BMEC氧化损伤模型的判别标准。周丽娜^[13]的研究指出，细胞死亡率为20%～30%可以作为建立小鼠脊髓神经元细胞氧化应激模型的评判标准。由此可见，可能是由于细胞的种类不同，对氧化损伤的耐受能力不同，因此选择的细胞存活率判别标准不同，所报道的H₂O₂作用浓度与作用时间的差别也较大。通常，在建立氧化应激模型时，细胞的存活率都不宜过高或过低，若存活率过低，说明大量的细胞已经死亡，会造成细胞不可恢复的损伤，不利于抗氧化机制的研究；若存活率过高，说明细胞是处于相对长势比较好的状态，细胞的活力也较好，氧化后不会造成明显的损伤，也不利于后续试验的开展^[14]。由此说明，建立细胞氧化损伤模型时需要使细胞达到适宜的损伤程度。

此外，氧化应激指标的变化是判断细胞是否发生了氧化应激、是否可建立细胞氧化应激模型的主要依据，是建立细胞氧化应激损伤模型的关键。除了细胞存活率外，GPx、SOD和CAT活性以及MDA含量可反映出机体清除自由基的能力以及脂质过氧化损伤的程度，因此，也可以作为判断细胞是否发生氧化应激的指标^{[15, 16]}。杨家军等^[17]研究了断奶对仔猪肠上皮细胞的氧化损伤的影响，以SOD、CAT和GPx等酶的活性和MDA的含量作为反映机体氧化损伤的指标，结果表明，在21日龄时，与哺乳组仔猪相比，断奶组仔猪的肠上皮细胞中SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的活性显著降低，过氧化产物MDA含量显著升高，其肠上皮细胞也发生了明显的损伤。李永义^[18]研究了体外仔猪淋巴细胞氧化模型的建立，发现添加200～800 μmol/L H₂O₂后，GPx、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，400 μmol/L H₂O₂可对体外仔猪的淋巴细胞产生明显的氧化应激。韩飞等^[6]研究表明，100和1 000 μmol/L H₂O₂能够显著降低HepG2中SOD、CAT活性，提高MDA含量，而100 μmol/L H₂O₂的对于SOD、CAT活性及MDA含量无显著的影响，选择100 μmol/L H₂O₂构建了氧化应激模型。然而，齐晓龙等^[14]用0.5～8.0 mmol/L的H₂O₂诱导产蛋鸡的原代肝细胞后，MDA含量随着H₂O₂作用浓度的增加而增加，SOD和CAT的活性呈现先增加后减少的趋势，最终选择4 mmol/L的H₂O₂作为构建应激模型的浓度。Wijeratne等^[19]研究表明，用50、100、150、200和250 μmol/L H₂O₂诱导人的病态的结肠细胞后发现，SOD活性在50 μmol/L H₂O₂作用时达到最高，CAT活性在50~250 μmol/L作用时保持不变，GPx活性随着H₂O₂作用浓度的增加而升高。由此可见，不同的细胞在发生氧化应激刺激后，对抗氧化酶活性的影响规律是相似的，但最终选择的H₂O₂作用浓度与作用时间不完全相同，这可能与细胞的种类、研究目的不同有很大的关系。

试验一首先以BMEC的存活率达70%～80%作为评判标准，根据此条件对H₂O₂作用浓度及作用时间进行初步筛选。结果得出，当800 μmol/L H₂O₂作用细胞4 h、600 μmol/L H₂O₂作用细胞6 h、600 μmol/L H₂O₂作用细胞8 h时的细胞存活率分别为73.15%、79.79%和76.34%，也就是说细胞死亡率分别为26.85%、20.21%和23.66%，均符合提出的标准。结果也显示，H₂O₂作用4 h与作用2 h相比，所有H₂O₂作用浓度下的细胞存活率均升高，说明此时细胞生长的速度要远远大于死亡的速度，所以细胞未明显受到H₂O₂的氧化损伤；然而作用6 h之后，与4 h相比，所有H₂O₂作用浓度下的细胞数量开始下降，100~1 000 μmol/L H₂O₂作用下细胞存活率为42.51%～98.95%，说明从6 h开始细胞就开始受到了不同程度的氧化损伤，而且作用8 h与作用6 h的损伤程度相比变化较小，这也说明H₂O₂作用6 h即可发挥很好的氧化损伤作用。本试验研究结果也表明，H₂O₂作用细胞8～12 h，100～400 μmol/L的较低浓度H₂O₂对细胞增殖的抑制作用较小，且作用时间延长后细胞有逐渐恢复的趋势。出现这种现象的原因可能是由于H₂O₂比较容易分解成H₂O和O₂，也许长时间的作用后，低浓度的H₂O₂已经分解为H₂O和O₂，对细胞的损害作用就降低了，所以随着时间的延长细胞数量会增加^[20]。目前相关的研究甚少，其原因有待于进一步探讨。同时也有资料报道，低浓度的H₂O₂会随着时间的延长表现出明显的细胞损伤效应，先是细胞功能的改变，损伤积累到一定程度就会触发细胞的器质性损害引起不可逆损伤^[20]，所以低浓度的H₂O₂对于氧化建模很不利。然而，本试验使用600～1 000 μmol/L的较高浓度H₂O₂作用于细胞8～12 h会明显抑制细胞增殖。因此，试验一首先根据细胞存活率结果初步得出，以H₂O₂为应激源建立细胞氧化应激损伤模型时，600 μmol/L H₂O₂作用6 h可以作为氧化应激损伤的适宜刺激浓度与作用时间，此时细胞存活率下降为79.79%。

在此基础上，试验二又以抗氧化指标GPx、SOD、CAT活性和MDA含量为判别依据，以H₂O₂的作用时间为6 h，进一步研究了不同浓度的H₂O₂对细胞抗氧化酶活性的影响，以进一步确定建立细胞氧化损伤模型时适宜的H₂O₂作用浓度。结果显示，600～1 000μmol/L组与对照组相比均显著降低了GPx、SOD和CAT活性，提高了MDA含量，与400 μmol/L组比较差异显著，但600、800和1 000 μmol/L组之间差异不显著。由此可见，600 μmol/L H₂O₂即可对BMEC产生明显的氧化应激，可以作为建立氧化损伤模型时的作用浓度，作用浓度再继续增加，相关指标的组间无显著差异。H₂O₂引起细胞产生氧化损伤的原因是氧自由基和H₂O₂会启动脂质过氧化反应的发生，进而产生更多的自由基，随着氧化和抗氧化过程的不断进行，造成机体抗氧化能力的耗竭，导致氧化和抗氧化的严重不平衡^[21]，从而造成了机体的氧化损伤，细胞内产生的大量的自由基破坏了生物膜影响了酶的活性，加速蛋白质的分解，进而影响抗氧化酶的活力、导致抗氧化能力的降低^[22]。还有研究指出，机体内抗氧化酶活力的降低是终产物H₂O₂的反馈作用或超氧阴离子(·O^-₂)使其灭活，这被认为是机体自身在环境因素下的保护效应^[23]。因此，综合本试验的细胞存活率和抗氧化指标结果得出，以H₂O₂为应激源，其作用浓度为600 μmol/L、作用时间为6 h可以引起BMEC的氧化损伤，可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。 4 结 论

① 细胞存活率和抗氧化指标(GPx、SOD和CAT活性及MDA含量)可以作为判别BMEC是否发生氧化应激的指标。

② 600 μmol/L H₂O₂作用BMEC 6 h，可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。