王草是一种优质的热带多年生禾本科牧草，具有产量高、适口性好等特点,以刈割后鲜饲家畜为主，在我国南方各省已有大面积种植^{[1, 2]}。海南岛降雨量大且空气湿度大，干草调制较为困难，通过青贮贮藏多余王草，对均衡家畜全年饲料供应具有重要意义。青贮原料适宜的干物质(DM)含量为30%～40%，新鲜王草水分含量可达80%以上，直接青贮时产生大量汁液，造成营养物质损失甚至变质，难以获得优质青贮饲料。凋萎会降低水分含量，抑制丁酸菌等有害微生物的活动^[3]。研究表明，绿汁发酵液(PFJ)作为一种新型的纯天然添加剂，改善青贮品质效果明显，成为近年来青贮研究的热点^[4]，利用热带地区乡土牧草附着的乳酸菌制作绿汁发酵液，对该地区调制优质的青贮饲料具有重要的意义。青贮过程中添加纤维素酶可分解细胞壁成分，增加可溶性碳水化合物含量，对纤维成分含量高的低质粗饲料青贮效果好^[5]，针对王草纤维含量较高的特点，添加纤维素酶可能有助于提高饲料青贮品质。我国王草青贮技术研究起步较晚，研究重点主要集中在添加剂青贮上，研究发现添加乳酸菌、纤维素酶、蔗糖、葡萄糖、山梨酸等均能提高青贮品质，且提出了每种添加剂的适宜用量^{[6, 7, 8, 9, 10]}。然而，降低水分含量以及添加绿汁发酵液与纤维素酶对王草青贮品质的研究较少，本研究采用凋萎以及凋萎后添加绿汁发酵液与纤维素酶处理，对王草青贮饲料发酵品质及其主要营养成分进行测定，从而得到较佳的青贮方式，对指导王草青贮饲料的生产具有重要的意义。

试验采用热研4号王草(P. purpureum×P. glaucum cv. Reyan No.4)，采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所畜牧研究中心试验基地。王草的化学成分见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 王草的化学成分(风干基础) Table 1 Chemical composition of king grass (air-dry basis) % 项目 Item 干物质 DM 水溶性碳水化合物 WSC 粗蛋白质 CP 中性洗涤纤维 NDF 酸性洗涤纤维 ADF 饲料相对值 RFV 含量 Content 20.03 7.21 8.36 60.44 40.36 88.44

表1 王草的化学成分(风干基础) Table 1 Chemical composition of king grass (air-dry basis)

绿汁发酵液：称取150 g王草切碎后加入300 mL蒸馏水打浆，用4层纱布过滤，量取250 mL滤液加入5 g葡萄糖摇匀，排出空气后密封保存，于30 ℃下恒温发酵48 h后使用。

纤维素酶：酶活力≥15 000 U/g，购于国药集团化学试剂有限公司。

试验处理：设对照组、凋萎(W)组、凋萎+绿汁发酵液(WP)组、凋萎+纤维素酶(WC)组、凋萎+绿汁发酵液+纤维素酶(WPC)组。王草生长至180 cm(营养期)刈割，切碎至1~2 cm，部分鲜草直接青贮，剩余凋萎处理(晾晒4 h后，水分含量约70%)。绿汁发酵液和纤维素酶添加量分别为4.0 mL/kg和0.1 g/kg。将处理好的王草快速填装至300 mL聚乙烯瓶中，压实加盖并用黑胶带密封，室温保存，每个处理3个重复。

青贮35 d后开瓶，将青贮料全部取出并充分混匀，准确称取20 g青贮料于三角瓶中，加入180 g蒸馏水，搅拌均匀，4 ℃下浸提24 h后用4层纱布过滤，再将滤液用定量滤纸二次过滤，所得浸提液保存于-20 ℃冰箱中，用于测定pH、氨态氮(AN)、有机酸等青贮品质指标。余下青贮料烘干并粉碎，用于测定营养成分指标。

pH用pH计对浸提液直接测定，AN含量采用笨酚-次氯酸钠比色法，有机酸中乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)含量用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件：采用COMOSIL5C18-PAD色谱柱(4.6 mm×250 mm)进行二元梯度洗脱，流动相A为20 mmol/L NaH₂PO₄(H₃PO₄调pH 2.65)，流动相B为甲醇。起始流动相为100%流动相A，0流动相B，维持5 min；到8 min为90%流动相A，10%流动相B，维持14 min；最后在22 min时恢复起始浓度，平衡柱子，进下一个样。流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长215 nm，进样体积20 μL。

青贮样品测定干物质、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量，参照杨胜^[11]的方法。蒽酮-硫酸比色法测定水溶性碳水化合物(WSC)含量^[12]。

V-Score评分是以AN和挥发性脂肪酸为评定指标的青贮品质评价体系，在青贮饲料评价中应用较广^[13]。该评价体系满分为100分，各指标不同含量分配的分数不同，见表2。根据此评分结果，可将青贮饲料品质分为良好(80分以上)、尚可(60~80分)和不良(60分以下)3个级别。

RFV＝DMI×DDM／1.29。
DMI与DDM的预测模型分别为：
DMI＝120／NDF；
DDM＝88.9－0.779ADF。

式中：DMI(dry matter intake)为粗饲料干物质的随意采食量，单位为占体重的百分比即%BW；DDM(digestible dry matter)为可消化的干物质，单位为%DM^[14]，粗饲料分级标准参照文献^[15]。

试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS 9.0软件包和Excel 2003软件进行数据处理和统计分析，组间采用Duncan氏法多重比较检验，显著水平为P＜0.05。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 V-Score分数分配计算式 Table 2 Calculation method of V-Score 氨态氮／总氮 AN/TN 比值 XN 计算式 Formula 乙酸＋丙酸 Acetate＋propionate 比值 XA 计算式 Formula 丁酸 Butyrate 比值 XB 计算式 Formula V-Score ≤5 YN=50 ≤0.2 YA=10 0~0.5 YB=40-80XB 5~10 YN=60-2XN 0.2~1.5 YA=(150-100XA)/13 0.5＜ YB=0 10~20 YN=80-4XN 1.5＜ YA=0 Y=YN+YA+YB 20＜ YN=0

表2 V-Score分数分配计算式 Table 2 Calculation method of V-Score

由表3可见，各组pH均小于4.0，其中W组与WC组之间，对照组、WP组与WPC组之间差异均不显著(P＞0.05)，W与WC组的pH显著高于其余3个组(P＜0.05)。凋萎后的各添加组LA含量显著高于对照组(P＜0.05)，其中WPC组LA含量最高，凋萎处理的W组LA含量最低。对照组AA含量最高，显著高于其余各组(P＜0.05)；W组 AA含量最低，显著低于其余各组(P＜0.05)；其他 组AA含量相差较小。各组LA/AA均大于1，都是以LA发酵为主，其中WP组与WPC组之间LA/AA差异不显著(P＞0.05)，W组LA/AA显著高于其他组(P＜0.05)，对照组LA/AA显著低于其他组(P＜0.05)。各组中仅有WP组检测到少量PA，其他各组均未检测到。所有组均未检测到BA。对照组氨态氮/总氮(AN/TN)显著高于其他组(P＜0.05)，WPC组AN/TN显著低于其他组(P＜0.05)，W组、WP组与WC组之间的AN/TN差异不显著(P＞0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 王草青贮饲料发酵品质 Table 3 Fermentation quality of king grass silages 组别 Groups pH 乳酸 LA/% 乙酸 AA/% 乳酸/乙酸 LA/AA 丙酸 PA/% 丁酸 BA/% 氨态氮/总氮 AN/TN 对照 Control 3.75±0.03b 6.89±0.03bc 0.76±0.04a 9.15±0.47d — — 10.57±0.69a 凋萎 W 3.93±0.04a 6.26±0.32c 0.29±0.06d 19.82±1.45a — — 5.96±0.44b 凋萎+绿汁发酵液 WP 3.77±0.02b 7.65±0.21ab 0.52±0.02c 14.86±1.13b 0.06±0.01 — 5.32±0.13b 凋萎+纤维素酶 WC 3.88±0.04a 7.13±0.34b 0.59±0.00b 12.13±2.13c — — 5.73±0.15b 凋萎+绿汁发酵 液+纤维素酶 WPC 3.74±0.02b 7.94±0.20a 0.50±0.03c 15.82±0.87b — — 4.70±0.32c 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表5同。—表示未检测到。 In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5. — mean undetected.

表3 王草青贮饲料发酵品质 Table 3 Fermentation quality of king grass silages

由表4可见，各组评分均在80以上，等级属于“优”。其中对照组得分为83.45，评分最低；WPC 组得分为97.68，评分最高，表明王草直接青贮也 可获得优质青贮饲料，但凋萎和添加剂处理均能提高王草青贮品质，其中王草经凋萎后添加绿汁发酵液和纤维素酶组青贮品质最好。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 王草青贮饲料的V-Score评分 Table 4 Grade of V-Score of king grass silages 组别 Groups 氨态氮／总氮 AN/TN 比值 XN 计算式 Formula 乙酸＋丙酸 Acetate＋propionate 比值 XA 计算式 Formula 丁酸 Butyrate 比值 XB 计算式 Formula 评分 Scores 等级 Grade 对照 Control 10.57 37.72 0.76 5.73 0.00 40.00 83.45 优 凋萎 W 5.96 48.08 0.29 9.30 0.00 40.00 97.38 优 凋萎+绿汁发酵液 WP 5.32 49.36 0.57 7.15 0.00 40.00 96.51 优 凋萎+纤维素酶 WC 5.73 48.54 0.59 7.02 0.00 40.00 95.55 优 凋萎+绿汁发酵液+纤维素 WPC 4.70 50.00 0.50 7.68 0.00 40.00 97.68 优

表4 王草青贮饲料的V-Score评分 Table 4 Grade of V-Score of king grass silages

由表5可见，对照组CP含量显著低于其余4个组(P＜0.05)，W、WC组CP含量显著低于WP与WPC组(P＜0.05)。WC与WPC组的NDF含量显著低于其他组(P＜0.05)，W组的NDF和ADF的含量在各组中最高，对照组、W组与WP组之间的NDF含量差异不显著(P＞0.05)，对照组与W组之间的ADF含量差异不显著(P＞0.05)。WC组与WPC组之间的WSC含量差异不显著(P＞0.05)，WC、WPC组的WSC含量又显著高于其他组(P＜0.05)，WP组的WSC含量最低。WC、 WPC组的RFV显著高于其他组(P＜0.05)，WC组与WPC组之间RFV差异不显著(P＞0.05)，对照组、W组、WP组之间RFV差异不显著(P＞0.05)。结果表明，王草直接青贮CP含量最低，RFV仅高于凋萎处理，营养价值较低；凋萎处理后添加纤维素酶以及绿汁发酵液和纤维素酶混合处理能显著提高CP含量并提高王草青贮饲料RFV，参照RFV粗饲料分级标准(表6)^[15]，王草青贮饲料等级由3级提升至2级，明显提高了王草青贮饲料的营养价值。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 王草青贮饲料营养成分(风干基础) Table 5 Nutrient composition of king grass silages (air-dry basis) % 组别 Groups 粗蛋白质 CP 中性洗涤纤维 NDF 酸性洗涤纤维 ADF 水溶性碳水化合物 WSC 饲料相对值 RFV 对照 Control 8.25±0.10c 59.05±1.45a 39.48±1.28ab 5.68±0.08b 91.61±5.49b 凋萎 W 11.11±0.62b 59.11±0.75a 41.08±0.53a 5.33±0.33bc 89.56±3.76b 凋萎+绿汁发酵液 WP 11.73±0.40a 58.84±0.62a 38.20±1.11bc 4.88±0.40c 93.51±4.87b 凋萎+纤维素酶 WC 11.03±0.23b 54.13±2.01b 37.15±0.46c 8.00±0.59a 103.03±6.84a 凋萎+绿汁发酵液+纤维素酶 WPC 11.97±0.03a 53.63±1.00b 36.60±0.94c 7.67±0.14a 104.75±6.42a

表5 王草青贮饲料营养成分(风干基础) Table 5 Nutrient composition of king grass silages (air-dry basis) %

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 RFV粗饲料分级标准 Table 6 RFV roughage quality standard 项目 Item 分级标准 Quality standard 特级 Prime 1 2 3 4 5 饲料相对值 RFV ＞151 125～150 103～124 87～102 75～86 ＜75

表6 RFV粗饲料分级标准 Table 6 RFV roughage quality standard

青贮对原料的水分含量要求一般为60%～70%，并有足够的可溶性碳水化合物为微生物提供发酵底物。本研究中，王草水分含量较高，不利于青贮调制；NDF、ADF含量高，RFV低，营养价值较低。通过合理的青贮调制可以改善王草的青贮品质并提高营养价值。

许多研究表明，降低青贮料的水分含量有助于促进LA发酵，可以改善青贮料的发酵品质，并能延长保存时间^{[3, 16, 17]}。然而对降低青贮料中水分含量的作用也有其他观点，Kim等^[18]和Manyawu等^[19]的研究结果表明，水分含量降低导致pH升高和LA等含量降低，影响青贮品质。本试验中王草凋萎处理后青贮料的pH显著高于直接青贮，LA含量低于直接青贮，可能是晾晒处理后的王草细胞液渗出减少，由于乳酸菌对低水分环境忍受力有限，使乳酸菌的繁殖受到部分抑制，导致较低的LA含量和较高的pH，与郑丹等^[4]对杂交狼尾草的研究结果一致，可能是狼尾草属牧草特有的青贮特性。Inoue等^[20]研究发现，将稻草水分含量由50.0%降低至27.5%，青贮品质有显著提高，但是继续降低水分含量青贮品质反而有所下降。因此，针对不同的青贮原料青贮时是否需要降低水分含量以及降低多少需要区别对待。本研究中凋萎处理与直接青贮饲料营养成分无显著差异，表明青贮未造成营养物质的流失，那是由于实验室青贮条件下汁液不能外排，实际生产中青贮所产生的汁液是排出青贮窖的，肯定会伴随营养物质的损失。另外，凋萎后干物质含量的提高可有效增加动物干物质采食量，这对提高饲料利用率，提高生产性能具有积极意义，因此针对水分含量高的青贮原料建议适当降低水分含量。

纤维素酶的作用是分解植物细胞壁，并使细胞内容物流出，增加了能被乳酸菌直接利用的WSC含量，补充了发酵底物，促进乳酸菌生长繁殖，产生更多的LA，促进了LA发酵。许多研究者都报道了添加纤维素酶能提高青贮品质和降低纤维成分含量，与本研究结果相似。贾燕霞等^[21]研究表明，添加复合纤维素酶显著提高了LA含量，降低了pH，改善了象草的青贮发酵品质。庄苏等^[5]研究表明，酶制剂能增加多花黑麦草与白三叶青贮中LA含量，降低pH，提高青贮饲料品质。原现军等^[22]研究表明，添加酶制剂明显改善青稞秸秆和黑麦草混合青贮发酵品质，显著提高了LA含量，显著降低了pH和AN含量，抑制了AA、PA和BA的产生。徐然等^[23]研究发现，纤维素酶能显著提高光叶紫花苕青贮品质，并指出添加量为2 g/t时青贮效果最好。另外，上述研究还发现添加纤维素酶青贮后，能够一定程度上降低NDF与ADF含量，保留更多的WSC，提高了青贮饲料的营养价值。当然也有研究发现纤维素酶对原料青贮品质和营养成分无明显作用。Kung等^[24]添加纤维素酶对大麦和野豌豆青贮饲料发酵品质的影响不明显，NDF和ADF含量也无明显差异。Sheperd等^[25]研究发现，纤维素酶对玉米青贮饲料有机酸含量无显著影响。李平等^[26]研究发现，纤维素酶对改善虉草青贮饲料发酵品质无显著影响。添加纤维素酶出现不同效果的原因可能与青贮原料特性(缓冲能力，碳水化合物、水分含量)、贮藏条件(温度、密度)以及酶的用量等因素相关。另外，酶对环境条件敏感，不适的外界条件容易影响酶的活性甚至造成酶失活，这都可能导致酶处理的青贮效果不同。

绿汁发酵液由青贮原料添加碳水化合物经厌氧发酵制得，原料本身附着的乳酸菌群经过厌氧发酵，乳酸菌在绿汁发酵液中的数量会大幅提高。青贮时添加绿汁发酵液，增加发酵初期的乳酸菌，确保乳酸菌迅速繁殖并抑制其他有害微生物，短时间内产生大量LA进而提高青贮品质。许多研究都表明绿汁发酵液能够改善青贮品质，Masuda等^[27]和Shao等^[28]在大黍和意大利黑麦草青贮中添加绿汁发酵液，青贮效果改善明显。其他学者在水葫芦与甜玉米秸秆混合青贮，苜蓿、象草以及多花黑麦草等原料青贮时添加绿汁发酵液都能明显改善青贮品质^{[29, 30, 31, 32, 33]}。本研究中添加绿汁发酵液处理与直接青贮相比pH较低，LA含量较高，降低了AN含量，提高了青贮品质；添加绿汁发酵液组的CP含量明显高于直接青贮，NDF与ADF含量较低，提高了RFV，与上述研究结论相符。

绿汁发酵液主要作用是增加青贮初期乳酸菌数量，纤维素酶主要作用是分解细胞壁成分，为乳酸菌提供发酵底物。青贮时二者混合添加，可能会产生叠加效应，改善青贮品质，青贮时间更短，效果更明显。许多研究者在光叶紫花苕、苜蓿、二色胡枝子、玉米秸秆等原料青贮时混合添加乳酸菌和纤维素酶都能明显改善青贮品质且较单独添加处理效果好^{[4, 34, 35, 36, 37, 38]}。本研究也得到类似的结果，绿汁发酵液与纤维素酶混合添加较其他组pH含量最低，LA含量最高，AN含量最低，V-Score评分最高，青贮品质最好；主要营养成分CP含量最高，NDF与ADF含量最低，RFV最高且达到2级饲料标准，提高了青贮饲料的营养价值。

① 王草可以直接青贮，但营养价值较低。

② 凋萎后添加绿汁发酵液和纤维素酶混合处理能改善王草青贮品质并提高营养价值。