葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种高活性需氧脱氢酶，能专一氧化葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢，同时消耗大量的氧，在食品、医药工业以及血糖的测定方面有广泛的应用。1999年，农业部发布的《允许使用的饲料添加剂品种目录》中，GOD被列入可用的12种饲用酶制剂之一，在饲粮中应用GOD可以起到类似于抗生素、酸化剂、益生菌和霉菌解毒剂的作用，其应用前景十分广阔^{[1, 2]}。但是由于发酵水平的限制，生产上GOD活性一直很低，且成本很高，在饲料中应用并不是很广泛，相关研究也很少。本实验室通过基因克隆技术在毕赤酵母生物反应器中实现GOD基因的高效表达，采用液体深层发酵方式使GOD活性达到了615 U/mL^[3]，且大大降低了生产成本，有效地解决了GOD不能大规模生产的问题，为GOD在畜牧业中的广泛应用打下了基础。本试验通过在常规仔猪饲粮中添加GOD，以生长性能、粪便菌群和血清指标为参数，研究GOD在仔猪养殖上的应用效果，为GOD在畜牧业上的广泛应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

试验中GOD产品由农业部饲料生物技术重点实验室提供，活性大于1 000 U/g(实测活性为1 272 U/g；酶活性单位定义为：在37 ℃、pH为5.5的条件下，每分钟从过量底物中降解释放1 μmol产物所需的酶量定义为1个酶活性单位，即1 U)。供试仔猪和试验场地由北京市房山区畜禽良种猪场提供。 1.2 试验设计

试验采用单因素完全随机设计，选择健康的35日龄仔猪112头，随机分为2个组，每组4个重复，每个重复14头猪。各组仔猪初始体重无显著 差异(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮基础上添加100 g/t GOD的试验饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。试验期35 d。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 60.00 消化能 DE/(MJ/kg) 14.18 膨化大豆 Extruded soybean 8.00 粗蛋白质 CP 18.50 发酵豆粕 Fermented soybean meal 2.00 钙 Ca 0.72 豆粕 Soybean meal 15.50 总磷 TP 0.60 鱼粉 Fish meal 3.40 有效磷 AP 0.37 乳清粉 Whey powder 1.50 赖氨酸 Lys 1.37 豆油 Soybean oil 1.60 蛋氨酸 Met 0.54 葡萄糖 Glucose 4.00 苏氨酸 Thr 0.90 预混料 Premix1) 4.00 色氨酸 Try 0.24 合计 Total 100.00 1)每千克预混料中含有Contained the following per kg of premix：赖氨酸 Lys 30 g，胆碱 choline 10 g，食盐 NaCl 75 g，Ca 200 g，总磷 TP 24 g，Fe 4 500 mg，Cu 4 000 mg，Mn 7 500 mg，Zn 3 000 mg，I 60 mg，Se 10 mg，烟酸 nicotinic acid 750 mg，叶酸folic acid 16 mg，泛酸钙calcium pantothenate 375 mg，生物素 biotin 7.5 mg，VA 75 000 IU，VD 25 000 IU，VE 375 IU，VK 14 mg，VB1 37.5 mg，VB2 120 mg，VB6 78 mg，VB12 0.4 mg。 2)消化能为计算值，其余均为实测值。DE was a calculated value,while the others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

各组试验猪每天定时喂料，自由采食，饮水器提供充足清洁饮水。其他免疫、消毒、卫生等饲养管理按常规进行。 1.4 检测指标 1.4.1 生长性能

分别于试验始、末空腹称重，准确记录饲料消耗量，计算出平均日增重、平均日采食量以及料重比。计算公式为：

平均日增重=(末重-初重)/试验天数；
平均日采食量＝耗料量/试验天数；
料重比＝平均日采食量/平均日增重。

在整个饲养试验阶段，每天分别在09:00和17:00观察猪粪便情况、发病情况和是否有死亡猪只，记录猪的腹泻、发病和死亡头数，统计腹泻率、发病率和死亡率。计算公式为： 腹泻率(%)=100×腹泻头次/(试验头数×试验天数)； 发病率(%)=100×病例头数/试验头数； 死亡率(%)=100×死亡头数/试验头数。 1.4.3 粪便菌群指标 1.4.3.1 样品采集

在试验猪场试验结束称重前随机采集各组健康的试验仔猪(每组3头)的新鲜粪便，然后在无菌操作台上检测菌落总数和大肠杆菌、沙门氏菌数。 1.4.3.2 培养基

菌落总数测定使用普通LB琼脂培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化钠9.0 g，琼脂粉15 g，pH=7.2±0.1，用去离子水定容至1.0 L；大肠杆菌和沙门氏菌数测定使用麦康凯培养基：蛋白胨20.0 g，乳糖10.0 g，牛胆盐5.0 g，氯化钠5.0 g，中性红0.03 g，琼脂14.0 g，pH=7.1±0.1，用去离子水定容至1.0 L。 1.4.3.3 测定方法与步骤

在超净工作台中分别迅速取粪便内容物0.5 g置灭菌锥形瓶中，加入0.9%灭菌生理盐水49.5 mL，在20 ℃恒温震 荡箱150 r/min震荡10 min，使样品充分摇匀，此液为10^-2稀释液，然后吸取1.0 mL置于盛有9.0 mL的0.9%灭菌生理盐水灭菌试管中进行10^-3稀释，再依次进行到10^-6稀释。分别将10^-4、10^-5、10^-6稀释液100 μL涂抹于各培养基上，37 ℃有氧培养18~24 h后进行菌落计数。各稀释度设3个重复。采用平板计数法进行菌落计数，并换算成lg(CFU/g)菌液，即用每克粪样含活菌数表示。 1.4.4 血清指标

于试验的第35天，称重后每重复取2头猪空腹采血5 mL左右，血样室温下静置2 h，5 000 r/min离心5 min，分离血清，4 ℃保存待测。使用日立7600全自动生化仪测定血清葡萄糖、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、总蛋白(TP)含量，计算血清蛋白系数(A/G)；采用放射免疫法测定三碘甲腺原氨酸(T₃)、甲状腺素(T₄)、促甲状腺激素(TSH)、生长激素(GH)、胰岛素(INS)和胰高血糖素(GLU)含量，放射免疫法测定所用试剂盒均购于天津九鼎医学生物工程有限公司。 1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件，应用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性分析，采用LSD法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。 2 结 果 2.1 GOD对仔猪生长性能的影响

由表2可知，GOD组平均日增重为0.483 kg，比对照组提高了35 g；GOD组平均日采食量为0.884 kg，比对照组提高了39 g；GOD组料重比比对照组降低了0.067；上述指标2组间差异均显著(P<0.05)。试验全期对照组和GOD组各有1头猪死亡，无腹泻等不良情况，猪群健康状况良好。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 GOD对仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of GOD on growth performance of piglets 项目 Items 对照组 Control group GOD组 GOD group 初重 Initial weight/kg 10.486±0.793 10.707±0.821 末重 Final weight/kg 26.500±0.721a 27.810±0.536b 平均日增重 ADG/(kg/d) 0.448±0.022a 0.483±0.016b 平均日采食量 ADFI/(kg/d) 0.845±0.020a 0.884±0.009b 料重比 F/G 1.897±0.044b 1.830±0.023a 死亡率 Mortality/% 1.79 1.79 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 GOD对仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of GOD on growth performance of piglets

由表3可知，GOD组的仔猪粪便中大肠杆菌数比对照组有降低趋势，但2组之间菌落总数和大肠杆菌数没有显著性差异(P>0.05)；GOD组的仔猪粪便中沙门氏菌数显著低于对照组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 GOD对仔猪粪便菌群的影响 Table 3 Effects of GOD on faecal microflora of piglets lg (CFU/g) 项目 Items 对照组 Control group GOD组 GOD group 菌落总数 Total plate count 8.600±0.146 8.637±0.136 大肠杆菌数 Number of E. Coli 6.317±0.192 6.271±0.167 沙门氏菌数 Number of Salmonell 5.713±0.181b 5.218±0.206a

表3 GOD对仔猪粪便菌群的影响 Table 3 Effects of GOD on faecal microflora of piglets lg (CFU/g)

由表4可知，GOD组仔猪的血清葡萄糖、白蛋白、球蛋白、总蛋白含量和蛋白系数比对照组都有所提高，但均未出现显著性差异(P>0.05)；GOD组三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素含量分别为1.00 ng/mL和6.87 μg/dL，均显著高于对照组(P<0.05)；GOD组生长激素含量为3.71 ng/mL，显著高于对照组(P<0.05)；GOD组仔猪其他各血清激素含量比对照组也有所提高，但未见显著性差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 GOD对仔猪血清指标的影响 Table 4 Effects of GOD on serum parameters of piglets 项目 Items 对照组 Control group GOD组 GOD group 葡萄糖 Glucose/(mmol/L) 4.87±1.07 5.14±1.04 白蛋白 Alb/(g/L) 27.30±1.80 28.27±1.65 球蛋白 Glb/(g/L) 13.17±1.01 14.25±1.64 蛋白系数 A/G 1.93±0.56 2.06±0.81 总蛋白 TP/(g/L) 44.72±2.58 45.51±2.00 三碘甲状腺原氨酸 T3/(ng/mL) 0.82±0.10a 1.00±0.09b 甲状腺素 T4/(μg/dL) 5.45±0.94a 6.87±0.59b 促甲状腺素 TSH/(μIU/mL) 2.81±0.26 2.94±0.58 生长激素 GH/(ng/mL) 3.18±0.26a 3.71±0.31b 胰岛素 INS/(μIU/mL) 21.90±5.74 22.13±7.67 胰高血糖素 GLU/(pg/mL) 253.71±20.14 258.80±35.88

表4 GOD对仔猪血清指标的影响 Table 4 Effects of GOD on serum parameters of piglets

GOD在动物胃肠道中可以用葡萄糖为底物酶解反应产生葡萄糖酸和过氧化氢(H₂O₂)。葡萄糖酸可以降低动物胃内pH，激活胃蛋白酶的活性，具有酸化剂的作用，同时胃内pH降低和肠道氧(O₂)的减少能有效抑制有害菌、促进有益菌的生长，提高饲料消化率；过氧化氢相当于一种广谱抗生素，酶解产生的少量过氧化氢可以起到类似抗生素的作用；从而改善动物肠道健康和消化能力，提高饲粮营养物质消化和吸收效率，促进动物生长^[4]。本课题组前期对该GOD进行梯度饲喂试验(添加量为100、200、400 g/t)，结果表明饲粮中添加100 g/t性价比最佳^[5]。本试验结果表明，饲粮中添加100 g/t GOD显著的提高了仔猪的平均日增重、平均日采食量，降低了料重比，再次验证了GOD的促生长效果。杨久仙等^[6]研究了GOD对断奶仔猪生长性能的影响，结果表明GOD提高了营养物质消化率和饲料转化效率，改善了断奶仔猪生产性能。同时，由于GOD的抗氧化作用，其还可以清除肠道上的自由基，保护肠道上皮细胞完整，加速肝脏内的氧化还原反应，提高肝脏对毒性成分的代谢，这些也是GOD能在动物生产上发挥良好效果的重要原因^[7]。 3.2 GOD对仔猪粪便菌群的影响

消化道菌群数量的变化反映了断奶仔猪消化道内环境的改变，通过检测新鲜粪样的细菌数是判断动物肠道内实际菌群变化情况的一种有效方式^[8]。一方面，GOD通过与饲粮中葡萄糖作用而产生的葡萄糖酸来发挥作用；另一方面，GOD在反应过程中消耗肠道中的氧，使消化道更易形成厌氧环境。葡萄糖酸产生的酸性环境有利于乳酸杆菌等有益菌的生长繁殖，对大肠杆菌等有害菌有抑制作用；而大多数的有益菌是厌氧菌，有害菌是需氧菌，厌氧环境的形成更利于抑制动物后肠道有害菌，促进有益菌的生长，从而改善动物肠道微生态平衡和肠道形态。黄建华等^[9]研究了二甲酸钾对断奶仔猪大肠杆菌和乳酸杆菌的影响，结果表明二甲酸钾的添加降低了断奶仔猪新鲜粪样中大肠杆菌数。本试验研究表明，GOD的添加降低了仔猪新鲜粪样的大肠杆菌和沙门氏菌数量，其中沙门氏菌的数量还出现了显著性降低，这说明GOD能有效的改善仔猪的肠道微生态平衡。本试验饲粮添加GOD并没有对粪便中菌落总数产生显著性影响，这可能是因为各种细菌都可在普通琼脂培养基上生长而很难区分出GOD对整体菌群数量产生的影响。杨久仙等^[10]研究GOD对断奶仔猪胃肠道微生物区系以及生产性能的影响，结果显示，与对照相比，饲粮中添加GOD提高了仔猪日增重，降低了消化道内大肠杆菌数量。
3.3 GOD对仔猪血清指标的影响

动物血糖绝大多数都是葡萄糖，主要来源于动物采食之后消化系统的转化，而葡萄糖又是动物能量的主要来源。GOD是以葡萄糖为底物发挥作用，反应的过程中会消耗一部分葡萄糖，但由于GOD添加量微少，相对于动物采食分解产生的葡萄糖，反应底物所需要的葡萄糖相对占比还是比较微小。本试验结果表明添加GOD并没有使血清葡萄糖含量降低，这说明添加GOD并没有影响动物对葡萄糖的转化吸收。

血清中总蛋白含量与蛋白质的营养有密切的关系，血清中白蛋白的含量与有功能肝细胞的数量呈正比，球蛋白是参与机体免疫机能的血清蛋白，正常家畜血清白蛋白和球蛋白含量会在一定范围内波动；血清蛋白系数因血清白蛋白和球蛋白相对含量的升降较大而发生明显变化，因此也可以通过这个比值的大小看出动物的健康状况^{[11, 12]}。本试验结果显示，GOD组仔猪各项血清生化指标都高于对照组，但未出现显著性差异，这说明试验仔猪整体健康状况良好，GOD的添加一定程度上提高了仔猪的生长性能和免疫能力。Tancin等^[13]研究表明，仔猪在断奶后早期，胃肠道细胞、酶和淋巴系统将发生相当大的变化，机体血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量一定范围内的升高，可以增强能量动员和体液免疫功能。

甲状腺激素是维持动物体正常生长发育所必需的激素，它主要有三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素2种，甲状腺素的主要作用是促进物质的能量代谢，促甲状腺素功能主要是促使甲状腺合成并分泌甲状腺激素，研究结果表明血清甲状腺激素含量与仔猪生长性能呈正相关，甲状腺功能低下时，生长明显受阻；生长激素可促进机体合成代谢和蛋白质合成，促进脂肪分解，同时对胰岛素有拮抗和抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用，最终影响动物的生长性能；胰岛素主要生理功能是合成代谢，促进糖原、脂肪和蛋白质的合成，与之相反，胰高血糖素是一种促使分解代谢的激素，它们在体内共同协调，影响机体的代谢和生长^{[14, 15, 16]}。本试验结果表明，GOD组三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素和生长激素含量显著高于对照组，2组之间其他血清激素含量没有显著性差异，这说明GOD的添加可以促进仔猪对饲粮的代谢和利用，提高了仔猪对营养元素的合成能力，进而促进仔猪的生长。Etherton^[17]通过长期试验研究表明，生长激素可显著提高猪的日增重和饲料转化效率。陈清华等^[18]研究非淀粉多糖酶制剂对仔猪生长和血清指标的影响，结果表明血清中血糖、三碘甲状腺原氨酸含量比基础饲粮组有所上升，添加酶制剂对仔猪生长性能的改进效果明显。 4 结 论

饲粮中添加100 g/t的GOD，可显著降低仔猪粪便中沙门氏菌数量，改进仔猪肠道健康；显著提高三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素和生长激素的含量；显著提高仔猪平均日增重和平均日采食量，降低料重比，改善仔猪生长性能。