油脂是动物能量来源之一，是动物组织的重要组成成分，也为动物提供必要的脂肪酸。植物油中含有较多的不饱和脂肪酸，亚麻油中含有较高的亚麻酸，玉米油和芝麻油中亚油酸含量较高，芝麻油中油酸的含量较高^{[1, 2, 3]}。猪油含有较高的单不饱和脂肪酸，且油酸含量较高^[1]。油脂具有高能、易吸收等特点，在肉鸡饲粮中添加油脂，可以满足肉鸡快速生长对能量的需要，并改善饲料利用效率。研究表明，肉鸡饲粮中添加油脂能改善肉鸡生长性能和养殖效益^{[4, 5]}。

18S rRNA是由18S rDNA转录的一种核糖体RNA，是真核生物核糖体的重要组成部分，其代谢独立于细胞核内的核酸代谢，且其有较长的代谢周期，一般认为18S rRNA在组织细胞中的表达量较为恒定，受细胞内外环境和功能状态变化的影响较小^{[6, 7]}。18S rRNA是分子生物学研究中常用的内参基因之一，是诸多内参基因中表现较为稳定的内标^{[8, 9]}。随着对18S rRNA表达稳定性研究的深入，人们发现小鼠在自由采食和限饲条件下，其大脑皮质和海马体组织中18S rRNA的表达量均呈现显著差异^[10]。病人白内障手术眼前囊膜中18S rRNA的表达量显著高于另只眼^[11]。当动物机体处于不同环境或病理条件下，18S rRNA的表达量也会发生变化，由此可见18S rRNA的表达可能并非十分稳定^[12]。研究表明，油脂可以在转录水平调控肉仔鸡脾脏核转录因子-κB(NFκB)的表达^[13]，饲粮添加油脂是否影响18S rRNA的表达，未见相关报道。因此本试验在肉鸡饲粮中分别添加不同水平(2.50%和5.00%)的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油，研究饲粮油脂类型和水平对肉鸡18S rRNA表达的影响。 1 材料与方法 1.1 试验动物及试验设计

选用240只1日龄科宝肉鸡母雏，随机分为8个组，每组6个重复，每个重复5只鸡。试验鸡采用笼养，每笼5只鸡，自由采食和饮水。免疫程序 按常规进行。饲粮参照NRC(1994)肉鸡的营养 需要配制，分为1～3和4～6周龄2个阶段饲养。1~4组饲粮分别添加2.50%的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油，其饲粮组成及营养水平见表1；5~8组饲粮分别添加5.00%的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油，其饲粮组成及营养水平见表2。油脂脂肪酸组成见表3。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 1~4组饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets of groups 1 to 4 (air-dry basis) % 项目 Items 1～3周龄 Aged from 1 to 3 weeks 4～6周龄 Aged from 4 to 6 weeks 1~3组 Groups 1 to 3 4组 Group 4 1~3组 Groups 1 to 3 4组 Group 4 原料 Ingredients 玉米 Corn 51.72 51.52 63.65 63.50 油脂 Oil1) 2.50 2.50 2.50 2.50 豆粕 Soybean meal 29.00 29.62 19.20 19.69 鱼粉 Fish meal 3.00 3.00 3.00 3.00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 4.00 3.60 7.35 7.00 食盐 NaCl 0.35 0.35 0.35 0.35 石粉 Limestone 1.30 1.30 1.28 1.28 磷酸氢钙 CaHPO4 1.57 1.57 1.25 1.25 50%氯化胆碱 50% choline chloride 0.26 0.26 0.20 0.20 蔗糖 Sucrose 5.00 5.00 赖氨酸 Lys 0.18 0.16 0.21 0.21 蛋氨酸 Met 0.12 0.12 0.01 0.02 预混料 Premix2) 1.00 1.00 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.56 12.56 12.98 12.98 粗蛋白质 CP 21.50 21.50 20.01 20.01 钙 Ca 1.01 1.01 0.91 0.91 总磷 TP 0.67 0.67 0.60 0.60 有效磷 AP 0.45 0.45 0.40 0.40 赖氨酸 Lys 1.15 1.15 1.00 1.01 蛋氨酸 Met 0.50 0.50 0.40 0.41 1)1~4组饲粮的油脂分别为亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油。Oil in diets of groups 1 to 4 was linseed oil,corn oil,sesame oil and lard oil,respectively. 2)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of diets：VA 0.45 mg,VD3 0.005 mg,VE 10.00 mg,VK 0.50 mg,VB1 1.80 mg,VB2 3.60 mg,VB6 3.50 mg,VB12 0.002 5 mg,烟酸 niacin acid 35.00 mg,叶酸 folic acid 0.55 mg,生物素 biotin 0.20 mg，泛酸 pantothenic acid 10.00 mg，Zn (ZnSO4·7H2O) 40.00 mg,Mn (MnSO4·5H2O) 60.00 mg,Fe (FeSO4·7H2O) 80.00 mg,Cu (CuSO4·5H2O)，10.00 mg,I (KI) 0.35 mg,Se (Na2SeO3·5H2O) 0.15 mg。表2同 The same as Table 2。 3)根据NRC(1994)肉鸡的营养需要计算得来。表2同。Calculated in accordance with nutrient requirements of broilers of NRC (1994). The same as Table 2.

表1 1~4组饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets of groups 1 to 4 (air-dry basis)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 5~8组饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of diets of groups 5 to 8 (air-dry basis) % % 项目 Items 1～3周龄 Aged from 1 to 3 weeks 4～6周龄 Aged from 4 to 6 weeks 5~7组 Groups 5 to 7 8组 Group 8 5~7组 Groups 5 to 7 8组 Group 8 原料 Ingredients 玉米 Corn 51.15 50.65 57.35 56.94 油脂 Oil 5.00 5.00 5.00 5.00 豆粕 Soybean meal 35.36 35.46 29.70 31.00 鱼粉 Fish meal 3.00 3.00 3.00 3.00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 0.90 食盐 NaCl 0.35 0.35 0.35 0.35 石粉 Limestone 1.26 1.26 1.19 1.18 磷酸氢钙 CaHPO4 1.55 1.55 1.26 1.26 50%氯化胆碱 50% choline chloride 0.26 0.26 0.20 0.20 赖氨酸 Lys 0.03 0.03 0.01 蛋氨酸 Met 0.14 0.14 0.05 0.06 沸石粉 Limestone 0.90 1.30 预混料 Premix 1.00 1.00 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.56 12.56 12.98 12.98 粗蛋白质 CP 21.50 21.50 20.01 20.01 钙 Ca 1.01 1.01 0.90 0.90 总磷 TP 0.68 0.68 0.62 0.62 有效磷 AP 0.45 0.45 0.40 0.40 赖氨酸 Lys 1.15 1.16 1.02 1.05 蛋氨酸 Met 0.50 0.50 0.40 0.41 5~8组饲粮的油脂分别为亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油。 Oil in diets of groups 5 to 8 was linseed oil,corn oil,sesame oil and lard oil,respectively.

表2 5~8组饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of diets of groups 5 to 8 (air-dry basis) %

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 常见动植物油脂的脂肪酸组成 Table 3 The fatty acid composition of animal and plant oil[14] %TFA 脂肪酸 Fatty acid 亚麻油 Linseed oil 玉米油 Corn oil 芝麻油 Sesame oil 猪油 Lard oil 饱和脂肪酸 SFA 10.90 14.40 15.10 38.00 油酸 Oleic acid 21.00 27.50 41.20 48.70 亚油酸 Linoleic acid 17.40 57.00 43.20 12.20 亚麻酸 LNA 50.60 0.90 0.20 0.70 其他 Others 0.10 0.20 0.30 0.40

表3 常见动植物油脂的脂肪酸组成 Table 3 The fatty acid composition of animal and plant oil[14] %TFA

于42日龄时，随机从各重复挑选1只肉鸡屠宰，无菌条件下取肝脏和胸肌。所取组织样品均用焦碳酸二乙酯(DEPC)水清洗后，液氮中速冻，-80 ℃保存。 1.3 总RNA提取和反转录反应

组织样品总RNA的提取参照Trizol试剂盒(TaKaRa)使用说明书(取50～100 mg的组织)。微量分光光度计(NanoDrop 2000 UV spectrophotometer，Thermo Scientific，德国)分析提取的RNA浓度和纯度；琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像分析系统(AlphaImager)上照相分析所提取RNA的完整性。反转录反应参照试剂盒(PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa，大连)使用说明书进行操作，该试剂盒可以去除提取RNA中的残余基因组DNA。反应液(总RNA,2.0 μg)置于冰上操作，反应体系20 μL。瞬时离心混匀后将反应液放到PCR仪器中，37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，-20 ℃保存备用。 1.4 引物设计

根据红色原鸡的18S rRNA基因序列(GenBank登录号:AF173612.1)，用Oligo 6.0软件设计荧光定量PCR所用的检测引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。正、反向引物及探针如表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 PCR所用引物 Table 4 The primers of PCR 基因 Gene 引物和探针序列 Sequences of primer and probe(5′—3′) 产物长度 Product size/bp 18S rRNA F: GATCCATTGGAGGGCAAGTC 113 R: GGATCTTG GGATCGAGCTG P:CAGCAGCCGCGGTAATTCCAGC F：上游 forward；R：下游 reserve；P：探针 probe。

表4 PCR所用引物 Table 4 The primers of PCR

参照Li等^[15]文献，运用探针法荧光定量PCR进行基因的定量表达分析。反应体系25.0 μL，包括1.0 μL cDNA(0.1 μL总RNA)、0.5 μL上游引物(12.5 μmol/L)、0.5 μL下游引物(12.5 μmol/L)、2.5 μL TaqMan^TM探针、0.5 μL RoxⅡ、3.5 μL 镁离子(Mg²⁺，25 mmol/L)、12.5 μL 2×Mix(包含1.5 mmol/L Mg²⁺)、4.0 μL超纯水；荧光定量PCR反应条件为95 ℃预变性2 min，40个循环的95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min。每个样品设置3个重复。纯化的PCR产物采用微量分光光度计(NanoDrop 2000 UV spectrophotometer)测定浓度后，梯度(10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰)稀释，用于建立每板的标准曲线。每板均设阴性对照。参照Bustin^[16]报道，本研究采用微量定量仪测定RNA的浓度，反应中添加等量的RNA和cDNA进行每个样品的均一化处理，研究已证明该方法是进行基因表达的定量研究中最可靠的均一化方法。 18S rRNA相对表达量=样本拷贝数/42日龄胸肌平均拷贝数最低组平均值。 1.6 数据统计和分析

用SPSS 17.0软件的单变量多因素方差分析方法检测油脂类型和水平对18S rRNA相对表达量的影响。结果以平均值±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。 2 结果与分析 2.1 油脂对肉鸡肝脏中18S rRNA相对表达量的影响

由表5可知，肝脏中18S rRNA相对表达量分别受油脂类型、水平以及两者之间交互作用极显著的影响(P<0.01)。2.50%的添加水平时，亚麻油组肉鸡肝脏18S rRNA的相对表达量分别显著高于玉米油组、芝麻油组和猪油组(P<0.05)；在5.00%的添加水平时，亚麻油组、玉米油组肉鸡肝脏18S rRNA的相对表达量分别显著高于芝麻油组和猪油组(P<0.05)，且亚麻油组和玉米油组差异不显著(P>0.05)；饲粮油脂在5.00%水平时玉米油组(P<0.01)、芝麻油组(P<0.05)和猪油组(P<0.01)18S rRNA的相对表达量分别极显著或显著高于其2.50%油脂水平时18S rRNA的相对表达量。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 油脂类型与水平对肉鸡肝脏中18S rRNA相对表达量的影响 Table 5 Effects of oil type and level on the relative expression level of 18S rRNA in liver of broilers 项目 Items 油脂水平 Oil level/% 2.50 5.00 油脂类型 Oil type 亚麻油 Linseed oil 5.43±1.08a 5.08±1.13a 玉米油 Corn oil 1.34±0.25b 4.35±0.82a** 芝麻油 Sesame oil 1.13±0.22b 2.23±0.31b* 猪油 Lard oil 1.42±0.28b 4.04±0.68c** 标准误 SE 0.169 0.150 显著性 Significance 油脂类型 Oil type ## 油脂水平 Oil level ## 油脂类型×油脂水平 Oil type×oil level ## 同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。同行数据肩标*表示差异显著(P<0.05)，肩标* *表示差异极显著(P<0.01)。##表示差异极显著(P<0.01)，NS表示差异不显著(P>0.05)。表6同。 Values in the same column with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). Values in the same row with * superscripts mean significant difference (P<0.05),and with * * superscripts mean significant difference (P<0.01). ## indicates significant difference (P<0.01),while NS means no significantly difference (P>0.05). The same as Table 6.

表5 油脂类型与水平对肉鸡肝脏中18S rRNA相对表达量的影响 Table 5 Effects of oil type and level on the relative expression level of 18S rRNA in liver of broilers

由表6可知，胸肌中18S rRNA相对表达量分别受油脂类型和水平极显著的影响(P<0.01)，然而，油脂类型和水平之间的交互作用对18S rRNA相对表达量的影响不显著(P>0.05)。2.50%的添加水平时，亚麻油组肉鸡胸肌18S rRNA的相对表达量分别显著高于玉米油组和芝麻油组(P<0.05)；在5.00%的添加水平时，亚麻油组肉鸡胸肌18S rRNA的相对表达量分别显著高于玉米油组、芝麻油组和猪油组(P<0.05)；饲粮中4种油脂 在5.00%水平时18S rRNA的相对表达量分别极 显著高于2.50%油脂水平时18S rRNA的相对表达量(P<0.01)。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 油脂类型与水平对肉鸡胸肌中18S rRNA相对表达量的影响 Table 6 Effects of oil type and level on the relative experssion level of 18S rRNA in chest muscle of broilers 项目 Items 油脂水平 Oil level/% 2.50 5.00 油脂类型 Oil type 亚麻油 Linseed oil 2.62±0.87a 4.72±0.53a** 玉米油 Corn oil 1.00±0.53b 3.33±1.51b** 芝麻油 Sesame oil 1.21±0.44b 2.65±1.20b** 猪油 Lard oil 1.64±1.40ab 3.27±0.36b** 标准误 SE 0.188 0.194 显著性 Significance 油脂类型 Oil type ## 油脂水平 Oil level ## 油脂类型×油脂水平 Oil type×oil level NS

表6 油脂类型与水平对肉鸡胸肌中18S rRNA相对表达量的影响 Table 6 Effects of oil type and level on the relative experssion level of 18S rRNA in chest muscle of broilers

本试验结果表明肉鸡饲粮中添加油脂对肉鸡肝脏、胸肌中18S rRNA的表达有显著的调控作用。42日龄胸肌、肝脏中，除5.00%的亚麻油组肝脏中18S rRNA的相对表达量低于2.50%亚麻油组外，其他所有5.00%油脂水平18S rRNA的相对表达量都显著或极显著高于2.50%油脂水平，表明提高饲粮中油脂的添加水平对42日龄肉鸡肝脏和胸肌18S rRNA表达有上调作用。

研究表明，长链脂肪酸可以调控基因的表达^[17]。饲粮中添加共轭亚油酸对肉鸡腹脂过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达量有显著的抑制作用^[18]，可提高老鼠肝脏中脂肪生成相关酶的活性和mRNA表达量^[19]。本试验中2.50%和5.00%的亚麻油组的肉鸡肝脏和胸肌中18S rRNA的相对表达量均不同程度地高于其他3个相应添加水平的油脂组，提示亚麻酸对42日龄胸肌、肝脏中18S rRNA的相对表达量的调控力度强于其他脂肪酸。研究发现，相比于低玉米油组，高玉米油组提高了老鼠肝脏中毒碱棕榈酰转移酶1α(CPT1a)和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)基因的表达量^[20]，本试验提高玉米油的添加水平时，18S rRNA相对表达量也随之提高。

18S rRNA作为一个重要的内参基因，其表达的稳定性一直是人们关注的热点，流感病毒感染情况下，与其他几个常用的内参基因相比较，18S rRNA在人支气管上皮细胞、猪气管上皮细胞、鸡和鸭的肺细胞中的表达最为稳定^[21]；多不饱和脂肪酸可降低肝脏SREBP-1 mRNA的表达丰度^[22]。然而本试验中，18S rRNA的相对表达量受到饲粮油脂的类型和水平调控而呈现出差异，这表明油脂添加影响18S rRNA的表达稳定性。也正如叶文静等^[12]指出的18S rRNA的转录易受到生物因素的影响，18S rRNA表达稳定性并非一成不变。本试验的结果再次证明，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或试验因素作用下“有范围”的恒定^[23]。因此，试验中应根据不同的试验动物及组织选择合适的内参基因或同时选用多个内参基因。 4 结 论

肉鸡18S rRNA的相对表达量受油脂类型和水平的影响，提高玉米油、芝麻油和猪油水平可上调肉鸡胸肌、肝脏中18S rRNA相对表达量。亚麻油对胸肌、肝脏中18S rRNA相对表达量的调控强度不同程度地高于玉米油、芝麻油和猪油。18S rRNA的表达易受饲粮油脂类型和水平的影响，表达并不十分稳定。

感谢河南农业大学王志祥教授对本文稿所提出的宝贵意见。