奶牛产犊后的一段时间内泌乳量迅速上升，泌乳所需能量及营养物质的量高于从饲粮中的摄取，加之产犊带来的应激，其采食量降低且胃肠道的蠕动、消化吸收功能下降,从而使高产奶牛不得不动员自身身体脂肪和蛋白质储备才够维持产奶需要，这种能量的摄入与输出不对等状态称之为能量负平衡(negative energy balance，NEB)^{[1, 2, 3]}。能量负平衡时期的奶牛血清葡萄糖(GLU)浓度迅速下降，体脂动员产生大量游离脂肪酸(NEFA)并被运至肝脏。在肝脏中NEFA一部分被氧化成酮体(KET)等，一部分酯化后与载脂蛋白结合生成极低密度脂蛋白从而将肝脏合成的甘油三酯(TG)转运出肝脏，如转运不及时则会造成NEFA和TG在肝脏中的堆积，最终造成脂肪肝及酮病的发生，导致机体代谢紊乱,繁殖性能和泌乳性能降低等，严重影响奶牛的健康及生产^{[4, 5, 6]}。

目前，国内外防治奶牛能量负平衡的原则是补糖降酮，促进糖异生作用^[7]。前人研究表明,丙二醇进入瘤胃后可以被瘤胃壁迅速吸收并能够通过糖异生作用转化为葡萄糖，可以减轻因采食量下降导致的能量负平衡，提高血液葡萄糖及胰岛素(INS)浓度，减少奶牛酮病及脂肪肝综合征^{[8, 9]}；另外，也有研究表明，饲粮中添加外源性纤维素酶可以促进反刍动物对纤维素的消化，提高瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)浓度，反刍动物可利用能量显著增加，对奶牛产后能量负平衡也有一定改善作用^{[10, 11]}。但目前有关两者对奶牛能量负平衡改善作用效果的比较研究还相对较少，本研究即通过向基础饲粮中添加丙二醇制剂和纤维素酶制剂，进一步比较两者对产后奶牛能量负平衡相关血液生化、尿液KET浓度影响的差异，以便为奶牛生产中能量负平衡的防治提供试验参考。

选择江苏省宿迁市泗阳县某牛场处于围产前期(3~5胎次，产前8~10 d)的健康中国荷斯坦母牛24头，体重(590±20) kg，305 d泌乳量5 000 kg左右，分成3组，每组8头。分组前采血测定免疫生化等指标使得各组间牛的生理状况基本一致，并采取单头栓养，饲喂相同的全混合日粮(TMR)，自由采食并自由饮水。试验于2013年11月20日至2014年3月5日进行。

基础饲粮粗蛋白质、能量等的需要量依照NRC(2001)^[12]标准进行配制。以饲喂不添加任何其他成分的基础饲粮组为对照组，设置丙二醇组(基础饲粮+0.5%丙二醇制剂)和纤维素酶组(基础饲粮+0.1%纤维素酶制剂)，试验组纤维素酶制剂及丙二醇制剂添剂量为上海欧耐施生物技术有限公司指导用量，基础饲粮组成及营养水平见表1。预试期为15 d，正试期为100 d。

据奶牛生产情况配制试验饲粮总量，分别于每日09:00和15:00进行统一饲喂。

通过集尿带连续采集母牛产后第1、20、40、60和100天5个时间点全天的尿样并进行混合，混合充分后取混合样50 mL置于-20 ℃保存，以供KET浓度的测定。

于母牛产后第1、20、40、60和100天07:00晨饲前采集牛尾静脉血10 mL，3 500 r/min离心10 min分离出血清并置于-20 ℃保存，用于相关指标的测定。

通过购买的美国Bio Assy公司KET测定试剂盒(EKBD-100)自行测定，KET浓度测定值为β-羟丁酸和乙酰乙酸浓度测定值之和。具体测定步骤参见试剂盒说明书。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米青贮 Corn silage 42.50 胡萝卜 Carrot 5.00 苜蓿 Alfalfa 9.00 羊草 Chinese wildrye 10.00 酒糟Distillers solubles 5.00 玉米 Corn 17.00 小麦麸 Wheat Bran 5.00 豆粕 Soybean meal 3.00 大麦 Grain 5.00 石粉 Limestone 2.00 磷酸氢钙 CaHPO4 0.20 食盐 NaCl 0.30 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 干物质 DM 65.84 泌乳净能 NEL/(MJ/kg) 7.02 粗蛋白质 CP 11.30 中性洗涤纤维 NDF 37.60 酸性洗涤纤维 ADF 20.50 钙 Ca 0.91 磷 P 0.44 1)每千克预混料含One kilogram of premix contains the following：CuSO4 25 mg,FeSO4·H2O 75 mg,ZnSO4·H2O 105 mg,Co 0.002 4 mg,Se 0.001 6 mg,VA 12 000 IU,VD3 10 000 IU,VE 25 mg,烟酸nicotinic acid 36 mg,胆碱 choline 1 000 mg。 2)泌乳净能为计算值，其余为测定值。NEL is a calculated value,while the others are measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

通过购买南京建成生物工程研究所的牛血清INS Elisa Assy Kit试剂盒和NEFA试剂盒(A042)自行测定血清INS和NEFA浓度。具体测定步骤参见试剂盒说明书。

将血清样品送至扬州市疾病控制中心测定血清GLU、TG、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度。

利用Excel 2003对试验数据进行整理，采用SPSS 16.0软件中单因素方差分析模块进行方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较。数据以平均值±标准差表示。P值小于0.05表示差异显著。

由表2可知，血清INS和GLU浓度在整个试验期内整体呈上升趋势，丙二醇组和纤维素酶组各时间点血清INS和GLU浓度总体上高于对照组。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛血清INS和GLU浓度的影响 Table 2 Effects of cellulase and propylene glycol on serum INS and GLU concentrations of postpartum dairy cows mmol/L 项目 Items 产后天数 Postpartum days/d 对照组 Control group 丙二醇组 Propylene glycol group 纤维素酶组 Cellulase group 1 12.75±1.85b 14.67±1.07a 12.43±2.38b 20 14.82±0.96 15.45±2.07 15.03±0.62 胰岛素 INS 40 15.26±1.24b 18.59±0.98a 16.07±1.82ab 60 18.73±1.38 19.63±0.68 18.05±1.62 100 18.35±0.63 19.13±1.04 18.65±0.65 1 2.69±0.30b 3.08±0.07a 2.76±0.16b 20 2.92±0.09 3.06±0.11 3.00±0.14 葡萄糖 GLU 40 3.32±0.25 3.37±0.16 3.30±0.20 60 3.62±0.13 3.47±0.35 3.47±0.21 100 3.60±0.28 3.88±0.27 3.75±0.27 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。 Values in the same row with different small letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

表2 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛血清INS和GLU浓度的影响 Table 2 Effects of cellulase and propylene glycol on serum INS and GLU concentrations of postpartum dairy cows

在产后第20、60和100天这3个时间点丙二醇组和纤维素酶组血清INS和GLU浓度与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。在产后的第1天，丙二醇组血清INS和GLU浓度均显著高于纤维素酶组及对照组(P＜0.05)，而纤维素酶组与对照组间的差异则不显著(P＞0.05)；在产后的第40天，丙二醇组血清INS浓度显著高于对照组(P＜0.05)，但与纤维素酶组相比差异则不显著(P＞0.05)。与此同时，该时间点各组间血清GLU浓度也未见显著差异(P＞0.05)。
2.2 对血清NEFA和尿液KET浓度的影响

由表3可知，血清NEFA及尿液KET浓度在整个试验期整体呈波动性下降趋势，且相比纤维素酶组与对照组，丙二醇组这2项指标的下降趋势更强。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛对血清NEFA和尿液KET浓度的影响 Table 3 Effects of cellulase and propylene glycol on serum NEFA and urine KET concentrations of postpartum dairy cows 项目 Items 产后天数 Postpartum days/d 对照组 Control group 丙二醇组 Propylene glycol group 纤维素酶组 Cellulase group 游离脂肪酸 NEFA/(μmol/L) 1 814±15a 784±8b 803±6ab 20 855±21a 731±19c 801±17b 40 754±12a 689±8b 707±13ab 60 582±13a 519±15b 558±29ab 100 426±15 403±18 411±10 酮体 KET/(mg/dL) 1 16.69±1.20a 15.08±0.87b 16.76±1.16a 20 18.92±1.39a 13.06±1.11c 16.00±1.14b 40 14.32±1.25a 13.37±1.16b 13.30±2.20ab 60 12.62±1.13a 9.47±1.35b 10.47±1.21b 100 7.01±1.28 6.88±1.17 6.65±0.97

表3 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛对血清NEFA和尿液KET浓度的影响 Table 3 Effects of cellulase and propylene glycol on serum NEFA and urine KET concentrations of postpartum dairy cows

在产后第1、20、40和60天这4个时间点，丙二醇组的血清NEFE和尿液KET浓度均显著低于对照组(P＜0.05)；纤维素酶组在产后的第20天血清NEFE和尿液KET浓度也均显著低于对照组，且在产后的第60天尿液KET浓度显著低于对照组(P＜0.05)，而血清NEFA浓度与对照组则差异则不显著(P＞0.05)；另外，与丙二醇组相比纤维素酶组在产后第1天尿液KET浓度显著提高(P＜0.05)，且在第20天血清NEFA浓度均显著提高(P＜0.05)；其余时间点各组间血清NEFA和尿液KET的浓度未见显著差异(P＞0.05)。

由表4可知，整个试验期内血清TG、HDL-C、LDL-C浓度变化大致呈先上升再下降的趋势，血清CHO的浓度变化则在一定范围内呈波动上升趋势。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛血清TG、CHO、HDL-C及LDL-C浓度的影响 Table 4 Effects of cellulase and propylene glycol on serum TG,CHO,HDL-C and LDL-C concentrations of postpartum dairy cows mmol/L 项目 Items 产后天数 Postpartum days/d 对照组 Control group 丙二醇组 Propylene glycol group 纤维素酶组 Cellulase group 甘油三酯 TG 1 0.06±0.02 0.05±0.02 0.05±0.01 20 0.22±0.03a 0.14±0.02b 0.16±0.03b 40 0.17±0.02a 0.16±0.02a 0.12±0.02b 60 0.08±0.01a 0.07±0.01ab 0.05±0.02b 100 0.06±0.05 0.05±0.02 0.07±0.01 胆固醇 CHO 1 3.47±0.26a 2.50±0.26b 3.21±0.53a 20 4.24±1.17 3.68±0.27 3.90±0.42 40 5.14±1.04a 3.31±1.05b 3.85±0.84ab 60 5.81±0.51a 3.61±1.22b 4.39±0.20ab 100 5.74±0.78a 3.75±0.65b 4.46±0.49b 高密度脂蛋白胆固醇HDL-C 1 1.63±0.24 1.52±0.12 1.52±0.26 20 1.75±0.17 1.72±0.37 1.80±0.34 40 2.19±0.14 1.83±0.31 1.78±0.36 60 2.07±0.18a 1.64±0.26b 1.86±0.17b 100 2.43±0.26a 1.68±0.17b 1.62±0.17b 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C 1 0.69±0.13a 0.37±0.11b 0.63±0.11a 20 0.68±0.40 0.74±0.14 0.62±0.04 40 1.05±0.38 0.58±0.30 0.78±0.43 60 1.13±0.15a 0.56±0.23b 0.83±0.09b 100 0.69±0.18 0.63±0.20 0.74±0.15

表4 纤维素酶和丙二醇对产后奶牛血清TG、CHO、HDL-C及LDL-C浓度的影响 Table 4 Effects of cellulase and propylene glycol on serum TG,CHO,HDL-C and LDL-C concentrations of postpartum dairy cows

在产后第1天，丙二醇组的血清CHO和LDL-C浓度显著低于纤维素酶组及对照组(P＜0.05)，其余指标各组间则未见显著差异(P＞0.05)；在产后第20天，丙二醇组和纤维素酶组的血清TG浓度显著低于对照组(P＜0.05)，其余指标各组间则未见显著差异(P＞0.05)；在产后第40天，纤维素酶组的血清TG浓度显著低于其余2组，血清CHO浓度则为丙二醇组显著低于对照组(P＜0.05)，其余指标各组间未见显著差异(P＞0.05)；在产后第60天，各指标组间均出现了一定程度的差异，其中血清TG浓度纤维素酶组显著低于对照组(P＜0.05)，血清CHO浓度丙二醇组显著低于对照组(P＜0.05)，血清HDL-C和LDL-C浓度丙二醇组和纤维素酶显著低于对照组(P＜0.05)；在产后第100天，试验组血清CHO和HDL-C浓度显著低于对照组(P＜0.05)。
3 讨 论

在奶牛泌乳早期，由于产奶量的增加，机体糖类消耗增大，但由于机体丙酸缺乏和体脂储备动员缓慢，糖类得不到及时的补充，就会造成奶牛血液中GLU和INS浓度迅速地降低^[13]。王聪等^[14]通过向饲粮中添加不同剂量的丙二醇研究其对围产期奶牛血液生化指标的影响发现，试验组在奶牛分娩后的前3周血液GLU浓度显著高于对照组，且血液INS浓度也有一定的增加。Chiofalo等^[15]在对围产期母羊饲喂丙二醇时也发现其可以显著提高母羊分娩前后的血液GLU浓度。本试验中，在奶牛产后第1、20天，各组血清GLU和INS浓度都处在相对较低水平，且在产后的第1天丙二醇组的血清GLU及INS浓度都显著高于对照组，这与上述研究结果有着一致性，说明饲粮添加丙二醇可以有效地缓解因糖类补充不及时造成的血液GLU和INS浓度下降。Hristov等^[11]报道，添加纤维素酶和木聚糖酶可提高饲粮可溶性糖的含量和降低中性洗涤纤维的含量，本试验中纤维素酶组的血液GLU浓度要高于对照组，但差异不显著，且与丙二醇组相比产后第1天要显著低于丙二醇组。造成这样的差异可能一方面由于纤维素酶主要通过提高瘤胃对饲粮纤维物质的消化率，提高瘤胃液VFA的浓度进而提高了能量的利用效率，但整个过程需要足够的时间^[16]；另一方面，纤维素酶作用的发挥受反应底物、瘤胃状态等多重因素的制约，而产后奶牛的生理发生了巨大的变化，这可能也是作用效果不明显的原因^[17]。相比之下，丙二醇可以被瘤胃直接吸收或代谢生成丙酸盐作为肝脏糖异生的前体物质，对机体能量及血液葡萄糖的补充要来得迅速^[8]。相关研究也表明，饲粮中添加丙二醇可以增加饲料在瘤胃中的滞留时间，提高营养物质的消化率，但因适口性差需要与饲粮混合饲喂^[18]。另外，我们对试验牛产后体重和消化性能的研究结果显示，第40、100天，丙二醇组的体重及对干物质的消化率也显著高于纤维素酶组和对照组。这些结果一致地说明饲粮添加丙二醇相比纤维素酶更有助于产后母牛对营养物质的利用以及体重的恢复。

血液GLU浓度降低后，体脂开始大量动员以弥补能量的入不敷出，这时血液NEFA浓度会迅速升高，其中少部分被乳腺产奶利用，大部分则被运送至肝脏^[19]。本试验中，试验组血清NEFA浓度也总体呈下降趋势，而对照组血清NEFA浓度则呈先上升后下降的趋势。在产后第1、20、40及60天这4个时间点，对照组血清NEFA浓度显著高于丙二醇组，而纤维素酶组浓度虽低于对照组，但只有在产后的第20天出现显著差异。说明丙二醇及纤维素酶的使用相比对照组缓解了能量负平衡导致的体脂进一步动员，且以丙二醇的效果更佳。

NEFA进入肝脏后首先经脂酰辅酶A合成酶作用变成脂酰辅酶A再进行进一步代谢，主要途径有：1)被彻底氧化成二氧化碳，所产生的能量被肝脏吸收利用；2)部分氧化生成KET，被运送至肝脏外的肌肉、骨骼等外周组织进而被利用；3)再酯化形成TG、磷脂或CHO等，用于脂蛋白的合成，转移到肝脏外组织进行利用^[20]。当NEFA产生太多太快，同时肝脏利用NEFA的能力有限，导致过多的NEFA转化为KET，或者合成TG存储在肝实质细胞，导致脂肪肝的发生^[21]。而肝脏脂肪的大量蓄积则会进一步损害肝脏功能，降低NEFA进入三羧酸循环和参与脂蛋白的合成和分解的作用，进而导致更严重的酮病和脂肪肝，这样就造成酮病和脂肪肝的恶性循环，而KET在血液、乳汁、尿液中积聚更加剧了能量负平衡^[22]。本试验中，尿液KET的浓度变化呈波动性下降的趋势，且试验组与对照组出现了一定程度的差异，说明随着时间的延伸奶牛逐渐从能量负平衡中恢复且试验组恢复的较好；另外，各组血清TG浓度呈上升趋势，其中丙二醇组上升较少，对照组上升较多。在产后的第20、40和60天，各组间血清TG浓度出现了显著差异且以对照组最高，可能与以上时间点各组间血清NEFA浓度的显著差异有关。Kaske^[23]报道反刍动物肝脏TG的合成前体主要是来自血液中的NEFA，肝脏TG浓度与血液NEFA浓度存在着正相关。王聪等^[14]报道，通过对围产期奶牛饲喂丙二醇可以显著降低血清TG浓度，加强了糖异生作用，这与本研究结果相一致。

此外，本试验中对照组血清HDL-C浓度也比试验组高，并在试验的后期出现了显著差异。HDL-C具有清洁疏通动脉的功能，促进脂类代谢的作用，这说明伴随着试验组丙二醇和纤维素酶的使用，肝脏代谢脂肪的强度得到缓解，而对照组仍处于较高水平。另外，对照组后期血清LDL-C浓度较高，这加大了其动脉硬化的风险^[24]，也说明肝脏脂肪的代谢负荷较高，不能及时将多余的脂肪代谢转运至体外，导致能量负平衡恢复期的进一步延长。

饲粮中添加0.5%的丙二醇制剂和0.1%纤维素酶制剂可以有效地改善奶牛产后尿液酮体、血清葡萄糖等血液生化指标，缓解奶牛产后能量负平衡，且以添加0.5%的丙二醇制剂作用效果更佳。