近年来，随着人们生活水平的不断提高，人们对于肉及肉制品的品质要求越来越高。毫无疑问，肉的嫩度是消费者最重视的食用品质之一，它决定了人们在食用肉时口感的好坏，是反映肉质地的指标，特别是在评价牛、羊肉的食用品质时，嫩度指标尤为重要^[1]。因此，改善肉嫩度的研究非常有必要。常见的改善方法就是宰后加工处理，如电刺激、高压处理、高温处理、宰后低温吊挂排酸、采用酶制剂嫩化等。此外，国内外学者对通过营养调控改善肉嫩度也进行了大量研究，包括饲养方式、饲粮能量和蛋白质等对肉嫩度的调控。其中，宰前补饲维生素D₃改善牛肉嫩度是一个重点研究方向。但目前，国内关于维生素D₃调控牛肉嫩度的研究尚未有报道，仅有关于维生素D₃调控牛肉嫩度的一些综述且不全面，并没有对维生素D₃调控牛肉嫩度的机理及进展进行系统、合理的综述^{[2, 3, 4, 5]}。因此，本文将就维生素D₃影响牛肉嫩度的基本原理及研究进展进行综述，以期为牛肉嫩度调控提供参考。 1 牛肉嫩度

嫩度是评价牛肉品质的重要指标。澳大利亚一项调研发现，如果牛肉的嫩度高于当前市场上的牛肉，那么有77%的消费者表示会买更多的牛肉^[6]；同时美国的一项调研也表明，消费者最关心的前3个牛肉产品质量问题包括：牛肉产品的多样性、合适的嫩度以及适口性^[7]；Rodas-Gonzalez等^[8]调查发现消费者对牛肉的嫩度变化非常敏感；此外，Miller等^[9]研究发现消费者会根据嫩度对牛肉进行评价，他们愿意花更多的钱买嫩度较高的牛肉。因此，为满足消费者对牛肉品质的要求，当前亟待解决的问题就是改善牛肉嫩度^{[10, 11]}。研究表明，牛肉嫩度是一个很复杂的概念，因为它与很多生理因素有关，例如肌肉组织的特点、肌肉的能量状况、细胞骨架蛋白质及其降解特性等^{[12, 13]}。其中与牛肉嫩度最为密切相关的就是肌肉中的结缔组织蛋白、肌原纤维蛋白以及肌浆蛋白3种蛋白质。特别是结缔组织蛋白和肌原纤维蛋白的数量及可降解性直接决定着牛肉的嫩度^[14]，这些蛋白使得大量胶原质在肌肉组织之间构成链接网，肌肉中这种链接越多，肌肉嫩度就越差^[15]。肉牛屠宰后，在成熟过程中，肌肉中一些相关蛋白酶会对结缔组织蛋白及肌原纤维蛋白进行一定程度的降解，从而影响牛肉的嫩度。 2 维生素D₃ 2.1 代谢及功能

维生素D₃是一种脂溶性维生素，通常储存在肝脏中。由饲粮摄入的维生素D₃通过小肠吸收，进入血液，与α-球蛋白结合，转运至肝脏，在肝脏中经过25-羟化酶的作用，转变成25-羟基胆钙化醇(25-hydroxy cholecalciferol，25-OH-VitD₃)。25-OH-VitD₃再转运至肾中，经过1-α羟化酶或24-羟化酶进一步羟基化转变为1,25-二羟基胆钙化醇[1,25-hydroxycholecalciferol，1,25-(OH)₂-VitD₃]，它是维生素生物学活性最高的一种形式^[16]，生物活性比25-OH-VitD₃高500~100倍，且其对受体的结合能力也较高^[17]。最终，它被运送至血液进入身体各个组织。

维生素D₃是动物及人体所必需的一种重要的营养素。它的活化形式1,25-(OH)₂-VitD₃除了能促进肠内壁对钙离子的吸收外^[16]，还具有调节机体免疫、调控细胞增殖和分化、调控肾素血管紧张素系统(RAS)及改善糖代谢等多种生物学功能^[18]。 2.2 体内维生素D₃的平衡

肾脏中产生的1,25-(OH)₂-VitD₃的数量受副甲状腺激素的控制，当血液中钙离子浓度降低时，就会刺激副甲状腺分泌更多的副甲状腺激素。副甲状腺激素促使肾脏产生更多的1,25-(OH)₂-VitD₃，进而增加肠对钙及磷的吸收(因为在骨骼中钙和磷是相互联系的)，同时也增加了肾脏及骨骼对钙、磷的吸收^[16]。然而，当血钙浓度上升时，甲状腺就会释放降血钙素激素。一旦降血钙素激素进入血液，就会产生与副甲状腺激素相反的效果，抑制骨骼对钙、磷的重吸收，并降低骨骼向血液中释放钙离子的量。同时血液中高浓度的钙离子或1,25-(OH)₂-VitD₃也能抑制副甲状腺激素的产生。因此，维持血液钙离子供给稳定的控制系统构成了2条反馈链，即副甲状腺激素维持钙供应和甲状腺激素防止钙离子浓度超过血液所需水平^[19]。

维生素D₃摄入过多，会产生病理生理学毒性，这主要归咎于严重的血钙过高。血钙过高的症状表现为肾结石、关节和骨骼疼痛、肌无力、采食量下降(导致厌食)、呕吐和多尿。该毒性也可导致一些软组织中的盐沉积，例如各种器官和大动脉血管内壁。在比较严重的情况下，维生素D₃的毒性还可能导致骨细胞坏死。维生素D₃中毒是一种非常严重的疾病，它跟其他病理学病变一样很难治疗，而且它对动物产生的危害很难或是根本不可能逆转。针对维生素D₃过多症，应该首先着手降低血钙浓度，从而初步缓解临床症状^[20]。 3 补饲维生素D₃调控牛肉嫩度的研究现状

目前，国外关于肉牛补饲维生素D₃调控嫩度的研究已经非常多。最初人们给农场饲养的牛注射含羟基的维生素D₃，发现可提高其血清钙浓度^{[30, 31, 32]}。给牛屠宰前2周饲喂5×10⁶ IU/d维生素D₃，也可以提高其血钙浓度^{[33, 34]}。Karges等^[35]主持进行的一项研究中，分别给阉割公牛宰前4和6 d补饲维生素D₃ 6×10⁶ IU/d，牛肉在2 ℃条件下成熟7、14和21 d，结果表明，饲喂6 d维生素D₃组的牛背最长肌的剪切力低于对照组及饲喂4 d维生素D₃组，饲喂维生素D₃组的牛血浆钙浓度都显著增高，且随饲喂时间的延长，血浆钙浓度越高。Swanek等^[36]研究表明，给牛宰前10 d补饲维生素D₃ 7.5×10⁶ IU/d显著增加了血浆及肌肉中钙离子浓度，此外，成熟7和14 d的牛肉剪切力均有显著改善，这与Karges等^[37]的研究结果均一致。在Tipton等^[38]的试验中，给第1组牛宰前5 d补饲维生素D₃ 3×10⁶ IU/d，第2组补饲维生素D₃ 3×10⁶ IU/d 5 d后，停止补饲7 d，然后屠宰。结果表明，第2组牛血清钙离子浓度增高而第1组则没有；第2组牛肉嫩度改善而第1组未有改善。这说明，补饲维生素D₃后停止补饲一段时间，可以使补饲效果增加，安全性提高，因为在补饲期上升的维生素D₃水平在停止补饲的时间段内又回到了正常水平。

Montgomery等^[39]研究发现，给阉牛连续补饲维生素D₃ 5×10⁶或7.5×10⁶ IU/d 9 d，补饲完成1 d后屠宰，经补饲的牛肉在成熟3、7和21 d的剪切力均低于未补饲组，特别是在成熟14 d时，补饲维生素D₃组的剪切力比未补饲组低0.5 kg/cm²。该研究还发现，补饲组肌肉中维生素D₃水平上升，甚至高出了肝脏及肾脏中的含量。Vargas等^[7]也有类似的研究，他们发现，未补饲维生素D₃组经成熟7 d的牛肉嫩度显著差于补饲组(宰前6.5 d补饲6×10⁶ IU/d)。Montgomery等^[40]用不同水平维生素D₃补饲阉公牛，得到相似的结果：血浆钙离子浓度随维生素D₃水平的增加而直线上升，且相互差异极显著，肌肉中钙离子浓度也随维生素D₃水平的增加而直线上升，且相互差异显著；补饲维生素D₃对钙蛋白酶抑制蛋白(calpastain)和钙蛋白酶(calpain)的活性无显著影响，但嫩度却有显著差异；维生素D₃补饲水平分别为0.5×10⁶、1.5×10⁶和7.5×10⁶ IU/d，成熟7 d的腰大肌剪切力依次降低。Montgomery等^[41]也发现给阉牛补饲维生素D₃可以增加肌肉细胞内钙、磷、镁的浓度。细胞内游离态钙离子能够刺激钙离子相关酶calpain的活性，进而改变肌肉的结构。

然而，也有一些研究表明，补饲维生素D₃对肉的嫩度没有影响。Foote等^[42]研究表明，给牛补饲1,25-(OH)₂-VitD₃和25-OH-VitD₃显著增加了血浆钙离子浓度，但肌肉中钙离子浓度不受影响；与未补饲组相比，补饲维生素D₃，成熟14 d的背最长肌剪切力有下降的趋势，但成熟时间再延长，未补饲组的牛肉就显得更嫩。这与Rider等^[43]的研究结果相似，他们发现补饲维生素D₃不能使肌肉中钙离子浓度增加，但随维生素D₃补饲量的增加，肌肉钙离子浓度有增加的趋势。补饲维生素D₃对屠宰后未经成熟的牛肉剪切力没有影响，但降低了其成熟7 d时的剪切力，成熟14 d时，补饲组剪切力却高于未补饲组。同样，Lawrence等^[6]研究表明，补饲维生素D₃对肌肉pH、肌节长度、肌肉颜色及蒸煮损失率无影响，而且肌肉及血浆中钙离子及维生素的浓度均无增加。同时，补饲组成熟1、7及14 d的肌肉剪切力与未补饲组均无显著差异。这有可能是补饲量过高，打破了维持血液钙离子供给稳定的2条反馈链的平衡，即高浓度的1,25-(OH)₂-VitD₃抑制了副甲状腺激素的产生，从而抑制了钙离子的吸收，因此达不到增加肌肉钙离子浓度的目的。 4 维生素D₃调控牛肉嫩度的机制

研究表明，肉牛屠宰后在0~2 ℃温度下，7~21 d的成熟过程中，肌肉嫩度会随一些关键肌原纤维蛋白的水解而改善^[21]。而这些蛋白的水解与钙蛋白酶类(calpains：μ-calpain、m-calpain)和calpastain酶类均密切相关。其中μ-calpain是主要促进肌肉肌原纤维蛋白水解的酶类，是肉嫩化的基本酶类，而钙离子是该酶的激活剂。研究表明，维生素D₃转化形成的1,25-(OH)₂-VitD₃有促进钙离子吸收的作用。其作用方式有多种。首先，1,25-(OH)₂-VitD₃可以滋养肠黏膜并增加其吸收面积，并作用于小肠黏膜细胞的细胞核受体(VDRn)，激活钙结合蛋白基因，促进钙结合蛋白的生物合成，钙结合蛋白和钙结合成可溶性复合物，从而加速钙的吸收；其次，1,25-(OH)₂-VitD₃还可特异性地引起肠细胞中磷脂酰胆碱含量和结构的改变，使膜的通透性升高，钙的转运速度加快。从基因水平讲，这种作用方式可能与调控控制钙离子通道的基因表达相关。Montell等^[22]首次成功克隆出瞬时性受体电位通道(TRP)基因，并研究证明TRP基因能够编码与钙离子转运有关的通道蛋白。其中TRPV5及TRPV6 2个基因与钙代谢及调控密切相关^{[23, 24, 25]}，而相关研究表明1,25-(OH)₂-VitD₃可以调控TRPV5的转录结合位点，控制TRPV5的mRNA表达进而对其功能进行调控^[26]；此外，1,25-(OH)₂-VitD₃在骨内能协同甲状旁腺激素刺激骨脱钙，使骨中钙转移入血液循环，提高血钙浓度，并且能够促进肾小管对钙磷的重吸收，减少尿钙的排泄^[27]。因此，理论上来说，补饲维生素D₃可以促进机体对钙离子的吸收，使得肌肉钙离子浓度升高，从而在屠宰后成熟阶段，提高μ-calpain酶活性，达到嫩化肉质的目的^[10，28]。在此基础上，我国学者殷泽洋^[29]研究表明，宰前短期补饲维生素D₃确实可以提高calpain活性。维生素D₃调控牛肉嫩度的机制如图1。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 维生素D3调控牛肉嫩度的机理 Fig. 1 The mechanism of vitamin D3 regulating beef tenderness

综合以上研究结果发现，尽管各种补饲维生素D₃试验的效果不尽相同，但毫无疑问，维生素D₃有提高血浆及肌肉钙水平的潜力，这就使得宰后成熟阶段，有足够的钙离子能提高calpains的活性，从而促进关键肌原纤维蛋白的降解，改善牛肉嫩度。在此原理的基础上，大部分研究也表明，补饲维生素D₃确实可以改善牛肉嫩度或是有改善牛肉嫩度的趋势。而且，使用维生素D₃调控牛肉嫩度有调控时间短、可控性强等优点。因此，宰前短期补饲维生素D₃是一种潜在的改善牛肉嫩度的营养调控手段。但目前仍存在一些问题，首先，补饲维生素D₃后，在牛肉组织中可能会有残留，而人体摄入过量维生素D₃会对人体产生不利影响。针对该问题，Carnagey等^[44]研究发现，饲粮中直接补饲25-OH-VitD₃，可能会避免维生素D₃组织残留这一问题；其次，补饲维生素D₃可能会影响牛采食量，但一般而言，针对调控嫩度而进行的维生素D₃补饲只在宰前几天内进行，即使对采食量有影响，也是短期的，因此未必会对整体屠宰性能造成不利影响。此外，目前最主要的问题还是确定维生素D₃的补饲量，针对不同地域、不同品种的牛，确定出能有效调控嫩度但不影响牛正常生长的的补饲量是该调控手段应用于生产的关键，还需做进一步研究。