热应激是指奶牛应对环境高温所产生的非特异性应答反应的总和。热应激条件下，奶牛干物质采食量(DMI)下降，进而引起奶牛产奶量下降、乳成分及生理生化指标等发生改变，其中，以奶牛DMI减少，营养物质消化率下降变化最明显^{[1, 2, 3, 4]}。我国南方夏季主要表现为高温高湿，且持续时间长^{[5, 6, 7]}，严重影响奶牛的生产和健康，给奶牛养殖业造成重大经济损失^[8]。因此，在热应激下需要采取饲养措施增加营养物质的摄入，提高奶牛的产奶量，其中，调整饲粮能量水平是饲养措施之一^[9]。Wang等^[10]研究表明，在热应激奶牛饲粮中补充饱和脂肪酸，与对照组相比产奶量增加，同时乳成分也得到改善。杨游等^[11]研究指出，在热应激奶牛饲粮中添加脂肪酸钙和烟酸，与对照组相比产奶量和乳脂率都显著提高，同时血液指标也发生相应的变化。然而在热应激条件下，有关饲粮能量水平对奶牛营养物质表观消化率和血液生化指标的影响未见有人报道。因此，本试验给热应激状态下的泌乳中期中国荷斯坦奶牛分别饲喂不同能量水平的饲粮，研究其对奶牛产奶量、营养物质表观消化率及血液生化指标的影响，以期对奶牛的实际生产提供理论指导，为饲粮配制提供数据支持。

本试验于2013年7月中旬至9月中旬在四川省洪雅县聚源奶牛专业合作社进行。根据胎次(2~3胎)、泌乳天数[(169±27) d]、产奶量[(25.0±3.1) kg/d]相近且健康无疾病的原则，选择25头泌乳中期中国荷斯坦奶牛，随机分为5组，每组5头牛。采用单因素完全随机区组试验设计，各组试验牛饲喂粗蛋白质(CP)水平一致而泌乳净能(NE_L)水平分别为6.15(组1)、6.36(组2)、6.64(组3)、6.95(组4)和7.36 MJ/kg(组5)的试验饲粮。饲粮采用全混合日粮(TMR)形式饲喂。试验期共45 d，预试期15 d，正试期30 d，正试期第1天和最后1天采集血样(晨饲前颈静脉采血)，并于正试期的第24天起对所有试验牛进行为期7 d的消化代谢试验(粪袋全收粪法)。

每组试验牛放在一个单独的饲养圈(4 m×5 m)里面，单槽舍式饲喂，每日于06:00、18:00共饲喂2次，自由饮水。每天根据前1天料槽内剩余料重调整饲喂量，确保料槽每天有10%左右的剩料。每天采用利拉伐挤奶器挤奶2次(05:30、17:30)。牛舍每天定时清扫，每2周消毒1次。

5组试验饲粮为由精料和粗料组成的等氮(CP=16.1%)饲粮，精粗比50:50，NE_L分别为6.15、6.36、6.64、6.95和7.36 MJ/kg。其中NE_L为6.36 MJ/kg的饲粮配方是按照NRC(2001)推荐标准满足体重为550 kg、产奶量25 kg/d(乳脂率3.1%)的奶牛在正常生产状态下的营养需要。整个试验期5种试验饲粮组成不变，试验饲粮的组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) % 项目 Items 组别 Groups 1 2 3 4 5 原料 Ingredients 精料 Concentrate1) 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 青贮玉米 Corn silage 19.63 16.40 12.67 8.30 5.56 苜蓿颗粒 Alfalfa particles 5.82 10.53 15.26 17.30 20.68 牛鞭草 Hemarthria altissima2) 10.60 12.50 13.57 18.64 20.50 苕藤 Sweet potato vine2) 13.95 10.57 8.50 5.75 3.26 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 泌乳净能 NEL/(MJ/kg) 6.15 6.36 6.64 6.95 7.36 粗蛋白质 CP 16.18 16.15 16.14 16.13 16.08 中性洗涤纤维 NDF 36.46 35.05 33.28 32.33 31.93 酸性洗涤纤维 ADF 22.96 21.85 21.68 20.53 20.13 钙 Ca 1.06 1.04 1.05 1.07 1.09 磷 P 0.56 0.55 0.56 0.54 0.54 精粗比 Concentrate to roughage ratio 50∶50 50∶50 50∶50 50∶50 50∶50 1)精料组成Concentrate composition：玉米corn，麦麸wheat bran，豆粕soybean meal，菜籽粕rapeseed meal，脂肪酸钙(IFFCO公司，马拉西亚)calcium fatty acids (IFFCO，Malaysia)，石粉limestone，磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2，食盐NaCl，预混料premix；精料营养水平Nutrient levels of the concentrate：粗蛋白质CP≥18.7%，粗纤维CF≤9.0%，粗灰分ash≤10.3%，钙 Ca 0.9%~1.37%，总磷 TP≥0.7%，食盐NaCl 0.6%，水分moisture≤12.5%。每千克预混料含有 One kg of premix contained the following：VA 500 000 IU，VD 150 000 IU，VE 3 000 IU，Fe 4.0 g，Cu 1.3 g，Mn 3.0 g，Zn 6.0 g，I 80 mg，Se 50 mg，Co 80 mg。 2)牛鞭草和苕藤为现割现喂。Hemarthria altissima and sweet potato vine were fresh mowed before feeding. 3) 泌乳净能根据NRC(2001)计算，其余营养水平为实测值。NEL was calculated according to NRC (2001),while the other nutrient levels were measured values.

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)

整个试验期间每天记录舍内的干球温度(T_db)和湿球温度(T_wb)，并由下列公式计算每天07:00、14:00、22:00和全天的温湿度指数(THI)平均值。

THI=(T_db+T_wb)×0.72+40.6。

每天07:00、14:00、22:00测量奶牛的直肠温度，每周的周一、周三、周五记录奶牛的呼吸频率(07:00、14:00、22:00)。在预试期第1天，以及正试期的第1天和最后1天采用四分法采集有代表性的饲粮样。试验结束后每组的样品混合在一起待测干物质(DM)、有机物(OM)、CP、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)和磷(P)含量及总能(GE)，测定参照张丽英^[12]的方法。记录每天的投料量，允许有10%的剩余，在饲喂前收集上一次的剩料称重并记录，以便计算奶牛每天的采食量。在正试期每天都记录奶牛的产奶量。

从正试期第24天起连续7 d全收粪样称重并记录，鲜粪样混匀后按10%比例取样。一式两份：一份按5%的比例加入10%的稀硫酸固氮，-20 ℃保存，用于测定常规营养成分含量；另一份按3%的比例加入10%的甲醛溶液杀死微生物，-20 ℃保存备测GE。

正试期第1天和最后1天分别对每头试验奶牛颈静脉采血(晨饲前)，分离血清，-20 ℃保存。采用全自动生化仪测定血清中皮质醇(COR)、内毒素(LPS)、葡萄糖(GLU)含量，肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的活性。

试验数据先用Excel 2003进行初步整理，然后用SAS 9.0统计软件进行方差分析，差异显著的用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。

由图1可知，整个试验期间平均每天的THI变化范围为74.5~82.6，奶牛处在热应激状态(THI>72)。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 试验期间牛舍THI变化曲线 Fig. 1 Changing curves of THI in dairy cows’ house during the whole experimental period

由表2可知，奶牛每天平均直肠温度都在39.1 ℃以上，呼吸频率平均超过62次/min，这些都是奶牛处于热应激状态时所表现出来的特征。不同饲粮处理对奶牛直肠温度无显著影响(P>0.05)，但是对呼吸频率却有显著影响。随着饲粮能量水平逐渐提高，呼吸频率在组4达到最低值，极显著低于组1和2(P<0.01)，并且与最高组(组1)相比下降了7.0%。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验期间奶牛直肠温度与呼吸频率 Table 2 Rectal temperature and respiratory rate of dairy cows during the whole experimental period 项目 Items 组别 Groups 1 2 3 4 5 直肠温度 RT/℃ 39.23±0.32 39.22±0.20 39.23±0.36 39.16±0.26 39.36±0.37 呼吸频率 Rr/(次/min) 67.14±4.78a 66.11±4.21a 64.11±4.34bc 62.78±5.16c 63.56±5.07c 同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，相间小写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row,values with adjacent small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with alternate small letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 试验期间奶牛直肠温度与呼吸频率 Table 2 Rectal temperature and respiratory rate of dairy cows during the whole experimental period

由表3可知，试验牛的DMI随饲粮能量水平的升高而降低，呈显著的负相关关系(R²=0.983 3，P=0.017)，并且组5显著或极显著低于 组1、2、3和4(P<0.05或P<0.01)，其中DMI最 低组(组5)与最高组(组1)相比减少了8.96%。随着饲粮能量水平提高，产奶量在组4达到最大值，显著高于组2(P<0.05)，极显著高于组1(P<0.01)，其中产奶量最高组(组4)与最低组(组1)相比提高了9.0%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲粮能量水平对热应激奶牛DMI和产奶量的影响 Table 3 Effects of dietary energy level on DMI and milk yield of dairy cows under heat stress kg/d 项目 Items 组别 Groups 1 2 3 4 5 干物质采食量 DMI 21.16±0.37a 20.89±0.36ab 20.75±0.41b 20.41±0.42b 19.42±0.48c 产奶量 Milk yield 26.46±2.41c 26.89±1.83bc 28.49±2.07a 28.83±2.66a 27.05±2.19ab

表3 饲粮能量水平对热应激奶牛DMI和产奶量的影响 Table 3 Effects of dietary energy level on DMI and milk yield of dairy cows under heat stress

由表4可知，饲粮能量水平对DM、OM、CP、NDF、ADF、Ca、P和GE的表观消化率均产生了显著或极显著影响(P<0.05或P<0.01)。其中，组1饲粮能量水平最低，面对热应激和泌乳的需要，使得该组的奶牛处于能量负平衡状态，此组各营养成分(除Ca、P和GE)的表观消化率整体上高于其他组。结合表2和表3的结果可知，组5的饲粮能量水平过高，进而影响了奶牛的代谢，该组各营养成分的表观消化率整体上低于其他组。对于其余组，DM、OM表观消化率均表现为组4>组2>组3，且组4显著大于组3(P<0.05)；CP、NDF表观消化率均表现为组4显著大于组2(P<0.05)，组2与组3之间差异不显著(P>0.05)。整体而言，ADF、Ca、P表观消化率均表现为组1、2、3、4间差异不显著(P>0.05)。GE的表观消化率表现为组4>组3>组1>组2>组5，且组4显著高于组2(P<0.05)，极显著高于组5(P<0.01)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮能量水平对热应激奶牛营养物质表观消化率的影响 Table 4 Effects of dietary energy level on nutrient apparent digestibility of dairy cows under heat stress % 项目 Items 组别 Groups 1 2 3 4 5 干物质 DM 66.25±1.61a 63.24±2.08ab 62.33±1.49b 65.89±1.87a 60.56±1.67c 有机物 OM 68.14±2.31a 67.64±2.04ab 65.26±1.05b 68.87±1.36a 63.78±2.14c 粗蛋白质 CP 70.52±2.03a 67.71±2.11b 65.68±2.04bc 62.11±1.89c 61.00±2.46c 中性洗涤纤维 NDF 63.46±0.89a 61.30±1.22b 61.03±1.68b 57.83±2.13c 50.22±1.28d 酸性洗涤纤维 ADF 59.55±2.61a 58.18±3.12a 57.76±2.07a 57.74±1.93a 48.95±2.19b 钙 Ca 59.58±2.03ab 61.60±1.72a 62.39±2.34a 64.01±2.17a 57.42±2.04b 磷 P 48.85±3.01a 47.65±2.12ab 49.39±1.80a 50.79±2.00a 45.71±2.07b 总能 GE 65.98±1.06ab 64.22±1.25bc 66.37±0.92ab 68.43±1.00a 62.21±1.36c

表4 饲粮能量水平对热应激奶牛营养物质表观消化率的影响 Table 4 Effects of dietary energy level on nutrient apparent digestibility of dairy cows under heat stress

由表5可知，血清COR和LPS浓度均表现为在组1达到最高，组4最低，其中，COR浓度组4显著低于组5(P<0.05)，极显著低于组1和组2(P<0.01)，LPS浓度组4显著低于组3(P<0.05)，极显著低于组1、2和5(P<0.01)。血清GLU浓度组4显著高于组1和5(P<0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。组1和4血清CK活性显著或极显著大于组2、3和5(P<0.05或P<0.01)，其中，组4与组2和3相比分别提高了32.87%和25.40%。血清GPT和GOT活性均表现为组1>组2>组4>组3>组5，且组1和2 GPT活性显著大于组3(P<0.05)，极显著大于组5(P<0.01)，而GOT活性组2、3和4之间差异不显著(P>0.05)，组5和3之间差异不显著(P>0.05)，其他各组间差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲粮能量水平对热应激奶牛血液生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary energy level on blood biochemical indices of dairy cows under heat stress 项目 Items 组别 Groups 1 2 3 4 5 皮质醇 COR/(ng/dL) 71.24±3.24a 58.59±2.80b 41.51±3.10cd 39.83±2.67d 43.76±3.32c 内毒素 LPS/(EU/mL) 0.82±0.03a 0.77±0.06b 0.54±0.07d 0.45±0.01e 0.61±0.05c 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 3.70±0.07b 3.76±0.03ab 3.87±0.05ab 4.04±0.16a 3.65±0.11b 肌酸激酶 CK/(U/L) 211.90±9.07a 136.73±8.64c 144.87±8.42c 181.67±10.20b 138.70±7.39c 谷丙转氨酶 GPT/(U/L) 30.23±1.26a 29.33±1.07a 26.43±1.36b 27.57±1.08ab 23.23±1.29c 谷草转氨酶 GOT/(U/T) 81.90±3.28a 76.47±2.03b 73.33±3.01bc 76.10±1.85b 70.53±2.91c

表5 饲粮能量水平对热应激奶牛血液生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary energy level on blood biochemical indices of dairy cows under heat stress

国际上公认的，当THI>72时奶牛则处在热应激状态^[13]。当THI介于72～79之间时，表现为轻度热应激；当THI介于79～88之间时，奶牛表现出中度热应激；当THI介于89～99之间时，奶牛表现出严重的热应激。近几年的研究表明，当THI>69时产奶量开始显著下降^{[14, 15]}；Zimbelman等^[16]对发生热应激时的THI阈值重新评估，发现高产奶牛(产奶量>35 kg/d)当THI≥68时即发生热应激反应。本试验中奶牛处于轻度而接近中度的热应激状态。

呼吸频率和直肠温度是评判奶牛是否发生热应激的2个最重要的生理指标^{[17, 18]}。在适宜的环境状态下奶牛正常的直肠温度为38.5 ℃，呼吸频率为20~40次/min，且这个值比较稳定；在轻度热应激状态下呼吸频率为50~60次/min。当热应激发生时，呼吸频率和直肠温度与非热应激状态相比将显著增加^{[1, 19]}。并且本试验还观察到饲粮能量水平对奶牛直肠温度无显著影响，但是平均每天的呼吸频率在高能组(组3、4、5)却显著或极显著低于低能组(组1、2)，表明饲粮高能量水平对热应激奶牛具有一定缓解作用。刘艳琴等^[20]报道炎热夏季奶牛随饲粮能量水平的提高，可使奶牛的呼吸频率降低及呼吸深度减弱，添加200 g脂肪酸钙组比对照组减少了4.92次/min；添加400 g脂肪酸钙组比对照组减少了7.68次/min。杨游等^[11]也指出，在热应激时奶牛随饲粮能量水平的提高，呼吸频率和脉搏次数都降低，饲粮能量水平对直肠温度影响较小，这与本试验的研究结果相一致。

随着饲粮能量水平的增加，DMI下降。Maekawa等^[21]报道指出奶牛在热性中枢条件下，当饲粮能量水平由7.03 MJ/kg增加到7.20 MJ/kg时，DMI平均减少了0.60 kg/d。Drackley等^[22]研究指出在热应激状态下，奶牛饲粮能量水平由6.38 MJ/kg增加到6.76 MJ/kg时，其DMI平均减少了0.97 kg/d。在本试验中，当饲粮能量水平由6.15 MJ/kg增加到6.95 MJ/kg时，DMI平均减少了0.64 kg/d。综合分析试验结果，我们发现组4饲粮能量水平最有利于奶牛的生产。

DMI与奶牛的产奶量有积极的相关关系，在炎热的夏季对于泌乳奶牛最限制的营养素是能量，DMI的下降和高泌乳量的需求，此时增加饲粮中的能量浓度显得非常必要^{[23, 24]}。大量的研究表明在热应激时，增加饲粮能量浓度能提高奶牛的产奶量^{[9, 11, 25]}。Drackley等^[22]指出在炎热的夏季通过添加脂肪或提高精料的比例来提高饲粮能量水平，与对照组相比奶牛的产奶量分别提高了1.9和1.6 kg/d。张健等^[25]研究表明，在热应激条件下高能饲粮组(添加烘烤大豆或油菜籽)与对照组相比，奶牛产奶量分别提高了2.28%和7.31%。本试验的研究结果与上述研究者的结果相一致，并且本试验还发现饲粮能量水平与产奶量呈现正相关关系(R²= 0.914 7，P=0.085 3)。

高温高湿环境会导致奶牛消化率下降^{[4, 26]}。温雅俐^[27]研究指出在热应激条件下泌乳奶牛DM消化率从65%下降到50%，CP消化率从85%下降到75%，NDF消化率从58%下降到48%，ADF消化率从42%下降到34%。然而上述研究都是热应激与非热应激条件下的比较，本研究是在热应激条件下研究饲粮不同能量水平对热应激奶牛营养物质表观消化率的影响，从结果中可以看出，饲粮不同能量水平对营养物质的表观消化率有一定的影响。组1中各营养物质(除Ca、P和GE)的消化率都高于其他组。这可能是由于奶牛为了维持正常的生理需要，以及泌乳的需要致使各种营养成分的表观消化率都较高，特别是当某种营养素浓度较低，或低于需要量时，奶牛消化与吸收会相应的提高。

奶牛在消化代谢时产生大量的代谢热，Coppock^[28]指出体重600 kg、日产奶量40 kg、乳脂率4%的奶牛产生的畜体产热占GE的31.1%。随着产奶量的增加机体的代谢热也增加，Purwanto等^[29]研究发现，高产奶牛(31.6 kg/d)、中产奶牛(18.5 kg/d)与干奶牛相比畜体产热分别高出48.5%和27.3%。组5中各营养物质的消化率低于其他组，这可能是由于过高的能量水平改变了奶牛的基础代谢，再加上较高的产奶量，增加了奶牛的代谢产热，加重了奶牛的热应激状态，养分不能被吸收直接排出体外。汪水平等^[30]研究表明，随着饲粮精粗比的增加，DM和OM表观消化率逐渐增加，NDF和ADF表观消化率先增加后降低。纪鹏等^[31]研究指出饲喂膨化大豆组与对照组相比奶牛的营养物质及GE的表观消化率都有不同程度的提高。王丽华等^[32]研究指出随着饲粮能量水平的提高，添加2%脂肪酸钙组与对照组相比DM表观消化率有所增加，但CP、NDF和ADF表观消化率都下降，添加4%脂肪酸钙组与对照组相比各营养物质表观消化率都显著下降。本试验结果印证了上述研究。另外，综合全文的结果发现奶牛在组4中的养分表观消化率要优于组2、3和5，说明了在一定范围内，随着饲粮能量水平的增加，奶牛的热应激状况得到缓解，产奶量以及DM、OM、Ca、P和GE的表观消化率都相对提高^[33]。

COR和LPS是评判奶牛热应激内分泌的主要指标^[34]，与非热应激相比，热应激奶牛血液COR和LPS的浓度显著增加^{[18, 35]}，且随着热应激程度及泌乳阶段的不同，COR和LPS的浓度也发生变化^[36]。而CK是反映动物处在热应激状态的一个敏感指标，其在骨骼肌中浓度最高，是能量代谢的关键酶之一^[34]。当奶牛处于热应激时，由于肌肉能量供应不足，细胞膜通透性升高等，造成血液CK浓度增加，活性升高^[37]。本研究结果表明，高能组(组3、4、5)能缓解奶牛的热应激状况，血清COR和LPS的浓度低于组1和2，且COR和LPS的浓度在组4中达到最低。血清CK的活性也表现出相似的规律，在组1达到最大值，组4次之，这主要是因为组4中奶牛较高的产奶量，需要较多的能量引起的。杨游等^[11]在热应激奶牛上的研究指出，饲粮添加250 g/d脂肪酸钙组与对照组相比血清中CK活性显著降低,与本试验的结果一致。

GPT和GOT在蛋白质、脂肪和糖三者的转换过程中及在氨基酸代谢方面占有极其重要的地位，是机体代谢过程中的关键酶，其活性升高或降低可反映营养物质在体内代谢的变化。本研究中组1和2的GPT活性高于其余组，组1中的GOT活性高于其他组，说明在低能组(组1和2)，奶牛处于能量负平衡状态，进而促进了氨基酸的代谢，促进了蛋白质、脂肪和糖三者的转换。杨游等^[11]研究指出饲粮添加250 g/d脂肪酸钙组与对照组相比血清中GPT和GOT的活性分别降低了2.06%和34.83%，这进一步验证了本文的结果。

① 在热应激条件下，一定范围内提高饲粮的能量水平能缓解奶牛的热应激，降低血清COR和LPS的浓度，减弱CK、GPT和GOT的活性，提高奶牛的产奶量。

② 饲粮能量水平对热应激奶牛营养物质表观消化率有一定的影响，当能量水平低于营养需要量时营养物质表观消化率相对都提高，适当的能量水平缓解了奶牛的热应激，各营养物质表观消化率略有提高，能量水平过高时加重了奶牛的热应激状态，此时营养物质表观消化率相对都降低。

③ 本试验以饲粮泌乳净能水平为6.95 MJ/kg时热应激奶牛的生产性能最佳。