2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术中心, 农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站, 长沙 410125
2. Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Hunan Research Center of Livestock & Poultry Sciences, and South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, the Chinese Academy of Sciences, Changsha, Hunan 410125, China
大气中二氧化碳(CO2)约含98.9%12C和1.1%13C同位素，光合作用过程中植物是排斥13C的，而动物在利用饲粮氨基酸(AA)合成体蛋白质时并不排斥由13C来提供碳架。植物通过还原戊糖磷酸(C3)途径、四碳双羧酸(C4)途径和景天酸代谢(CAM)途径固定CO2，根据植物固定CO2的不同方式，可将其分为C3(牧草、大豆粕和小麦等)、C4(玉米、甘蔗和高粱等)和CAM植物(仙人掌、凤梨和长寿花等)。在植物生理学上，13C丰度通常用δ13C(‰)表示，不同种类植物的δ13C值有很大差异，C3和C4植物的δ13C值分别在(-34‰)～(-22‰)和(-19‰)～(-9‰)之间。
基于C3和C4植物间通过光合作用固定CO2途径等诸多方面存在的差异，在植物育种、植物生态、植物考古、地质、农业生产、环境监测、荒漠化防治以及动物和人类学等多个领域广泛开展了研究[1]。其中在动物学和人类学方面，研究的内容包括考古[2, 3]、食物溯源[4, 5]和生物演化[6, 7]等。然而，在动物营养方面的研究仅见于化学成分含量、干物质消化率、肉品质、饲喂草食昆虫的个别报道，至于饲喂C3和C4植物对反刍家畜瘤胃发酵特性的影响尚未见报道。若C3和C4植物的营养价值有显著差异，动物营养乃至人类膳食结构都将出现一个新的领域。本试验采用C3和C4植物制成不同精粗比底物，用瘤胃体外发酵方法研究对体外产气参数、发酵特性参数、营养物质降解率的影响，为优化反刍动物瘤胃内环境、温室气体减排和促进规模化草食家畜产业健康可持续发展提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 发酵底物发酵底物精料参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制。粗料分别选用不同来源的C3和C4植物，其中C3植物来源粗料选用水稻秸秆和苜蓿；C4植物来源粗料选用玉米秸秆和宽叶雀稗。C3和C4植物各配制3种不同精粗比(40:60、45:55和50:50)的发酵底物，发酵底物经65 ℃烘干24 h，经1 mm孔径筛粉碎后备用。发酵底物精料和粗料营养水平见表1。
 | 表1 发酵底物精料和粗料营养水平(干物质基础) Table 1 Nutrient levels of the concentrate and roughages of fermentation substrates (DM basis) |
选择3头安装有永久性瘤胃瘘管，平均体重为(20.0±2.5) kg的健康湘东黑山羊作为瘤胃液供给动物。分别于07:00和19:00按自由采食量的95%等量饲喂，自由饮水。
1.2.2 动物饲粮和饲养管理瘤胃液供给湘东黑山羊饲粮参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制。以1.4倍维持需要设计饲粮，满足100 g日增重的需要。饲粮组成及营养水平见表2。
| 表2 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
C3和C4植物来源发酵底物分别设置3种精粗比(40:60、45:55和50:50)，采用完全随机区组试验设计，在39 ℃恒温培养箱中培养48 h。每个精粗比设置12、24、48 h 3个采样时间点，每个采样时间点再设置3个重复样品。
1.3.1 体外发酵培养液的配制及预处理按照Menke等[9]的方法于体外发酵前1天配制瘤胃体外发酵厌氧缓冲液。在晨饲前通过瘘管采集山羊瘤胃液，用4层纱布过滤后与厌氧缓冲液以1:9的比例充分混合成发酵培养液。混合好的培养液在发酵前迅速通入CO2 2~3 min后，置于39 ℃的水浴摇床上等待培养[10]。
1.3.2 发酵准备及培养于体外发酵前1天预先称取(0.500 0±0.000 3) g底物，放入厌氧发酵瓶中，在39 ℃恒温培养箱中放置过夜。次日向发酵瓶中持续通入CO2 2 min，随即先后加入已配制好的50 mL体外发酵培养液，并再次持续通入CO2 3 min，加上瓶塞盖子后迅速使用针头放气将气压调节成0，此即0 h点的气压值。随后立即放置于39 ℃恒温培养箱中开始发酵48 h。
1.3.3 数据计算及样品采集分析 1.3.3.1 总产气量分别于体外发酵0、1、2、4、6、12、24、48 h使用压力传感器(CYG130-12,昆山双桥传感器测控技术有限公司)测定发酵瓶内的气压，并将气压换算成为室温标准气压下的气体体积，换算公式为：
y=1.506x。
式中：1.506为实测压强与体积之间的换算系数(mL/kPa)；x为压强(kPa)；y为产气量(mL)。
将各时间点测得产气量运用LE体外发酵产气模型进行拟合，计算动态发酵产气参数。模型公式如下：
y=Vf×[1-exp(d-t×k)]/[1+exp(b-k×t)][11]。
式中：y为t时间点底物的产气量(mL)；Vf为理论最大产气量(mL)；k为产气速率(h-1)；b和d为曲线的形状指标，b>0表示曲线为S形，b<0则表示曲线非S形；d>0表示曲线有负截距，d<0表示曲线有正截距。
另有计算公式
FRD0=k/[1+exp(b)]；
t0.5={ln[2+exp(b)]}/k[12]。式中：FRD0为初期(发酵0~12 h)产气速率(h-1)；t0.5为达1/2理论最大产气量时间(h)。
1.3.3.2 甲烷(CH4)产量分别于体外发酵12、24、48 h取出发酵瓶，每瓶取10 μL气体测定CH4含量，测定仪器为Agilent 7890A型气相色谱仪，计算CH4产量。
1.3.3.3 发酵液pH分别于体外发酵12、24、48 h取出发酵瓶，每瓶取出2 mL发酵液立即用pH计(REX PHS-3C,上海仪器设备厂)测定pH。
1.3.3.4 发酵液氨态氮(NH3-N)浓度分别于体外发酵12、24、48 h取出发酵瓶，每瓶取出2 mL发酵液用于NH3-N浓度的测定。按照冯宗慈等[13]改进的比色法，使用UV2450紫外可见分光光度计(Shimadzu，日本)进行测定。
1.3.3.5 发酵液挥发性脂肪酸(VFA)浓度分别于体外发酵12、24、48 h取出发酵瓶，每瓶取2 mL发酵液测VFA浓度。运用内标法，使用Agilent 7890A型液体进样气相色谱仪测定发酵液样品中VFA浓度。
1.3.3.6 体外干物质降解率(IVDMD)分别于体外发酵12、24、48 h取出发酵瓶，发酵液过400目尼龙布后将残渣全部转移至石英坩埚中用热蒸馏水反复冲洗，随后置于105 ℃烘箱中烘干8 h以测定干物质含量，残渣回收用样品袋密封保存，以备体外中性洗涤纤维降解率(IVNDFD)的测定。IVDMD计算公式如下：
IVDMD(%)=[1-(m/M)]×100。
式中：m为发酵后底物干物质质量(g)；M为发酵前底物干物质质量(g)。
1.3.3.7 IVNDFD中性洗涤纤维(NDF)含量的测定方法依照Hall等[14]的方法并进行调整，使用Fibretherm FT12全自动纤维仪(Gerhardt Analytical Systems,德国)进行测定。
IVNDFD(%)=[1-(m2/m1)]×100。
式中：m1为发酵前底物NDF质量(g)；m2为发酵后底物中剩余的NDF质量(g)。
1.4 试验数据统计及分析试验数据采用SAS 8.2的Mixed过程统计，不同C3和C4植物粗料之间的差异、不同精粗比之间的差异均采用Contrast程序进行比较。统计差异显著性定义为P<0.05，极显著性定义为P<0.01。
2 结果与分析 2.1 产气参数和CH4产量由表3可知，C3和C4植物粗料对理论最大产气量、产气速率、初期产气速率、达1/2理论最大产气量时间和CH4产量均有极显著影响(P＜0.01)，底物精粗比仅对产气速率有显著影响(P＜0.05)，二者交互作用极显著影响了理论最大产气量、初期产气速率和CH4产量(P＜0.01)，显著影响了达1/2理论最大产气量时间(P＜0.05)。
不同C3和C4植物粗料间比较，苜蓿理论最大产气量最高，分别是水稻秸秆、玉米秸秆和宽叶雀稗的1.09、1.16和1.11倍，差异极显著(P＜0.01)，后三者没有显著差异(P＞0.05)；水稻秸秆CH4产量极显著低于苜蓿、玉米秸秆和宽叶雀稗(P＜0.01)，且玉米秸秆CH4产量亦极显著苜蓿和 宽叶雀稗(P＜0.01)。
不同精粗比间比较，精粗比为40:60时水稻秸秆理论最大产气量和达1/2理论最大产气量时间显著高于精粗比为45:55(P＜0.05)；精粗比为40:60时苜蓿初期产气速率最高，分别是精粗比45:55和50:50的2.07和2.38倍，差异显著(P＜0.05)；精粗比为50:50时宽叶雀稗理论最大产气量均显著低于精粗比40:60和45:55(P＜0.05)，分别比它们降低26.71%和25.93%；精粗比为50:50时宽叶雀稗初期产气速率最高(P＜0.05)，分别是精粗比45:55和50:50的1.65和1.87倍；精粗比为40:60和50:50时水稻秸秆CH4产量均显著高于精粗比45:55(P＜0.05)，分别高出29.50%和33.22%；精粗比为50:50时苜蓿CH4产量均显著高于精粗比40:60和45:55(P＜0.05)，分别高出14.88%和8.85%。
| 表3 C3和C4植物粗料及底物精粗比对体外发酵产气参数和CH4产量的影响 Table 3 Effects of C3 and C4 plants of roughage and C:R of substrate on gas production parameters and CH4 production of in vitro fermentation |
由4可知，C3和C4植物粗料对发酵液pH和NH3-N浓度均有极显著影响(P＜0.01)，底物精粗比对这2个指标无显著影响(P>0.05)，二者交互作用显著影响发酵液pH(P＜0.05)。
| 表4 C3和C4植物粗料及底物精粗比对体外发酵液pH和NH3-N浓度的影响
Table 4 Effects of C3 and C4 plants of roughage and C:R of substrate on pH and NH3-N concentration of in vitro fermentation fluid
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不同C3和C4植物粗料间比较，水稻秸秆和苜蓿(C3植物)发酵液pH均极显著高于玉米秸秆和宽叶雀稗(C4植物)(P＜0.01)，但C3植物之间或C4植物之间并没有显著差异(P＞0.05)；发酵液NH3-N浓度以苜蓿最高，分别为水稻秸秆、玉米秸秆和宽叶雀稗的1.54、2.08和3.31倍，差异极显著(P＜0.01)。
2.2.2 发酵液VFA浓度由表5可知，C3和C4植物粗料对发酵液乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度及乙酸/丙酸均有极显著影响(P＜0.01)，底物精粗比仅对发酵液丁酸浓度有显著影响(P＜0.05)，二者交互作用极显著影响了发酵液乙酸/丙酸(P＜0.01)，显著影响了发酵液丁酸和戊酸浓度(P＜0.05)。
不同C3和C4植物粗料间比较，水稻秸秆发酵液乙酸、丙酸和TVFA浓度均极显著高于玉米秸秆和宽叶雀稗(P＜0.01)；玉米秸秆发酵液乙酸和TVFA浓度均极显著低于宽叶雀稗(P＜0.01)，但玉米秸秆和宽叶雀稗发酵液丙酸浓度没有显著差异(P＞0.05)；玉米秸秆发酵液乙酸/丙酸显著低于水稻秸秆、苜蓿和宽叶雀稗(P＜0.05)，而后三者间无显著差异(P＞0.05)。
不同精粗比间比较，精粗比为50:50时水稻秸秆和玉米秸秆发酵液乙酸/丙酸均显著高于精粗比为40:60(P＜0.05)，而与精粗比为45:55时没有显著差异(P＞0.05)；精粗比为50:50时宽叶雀稗发酵液乙酸/丙酸均极显著低于精粗比为40:60和45:55(P＜0.01)，而后两者之间没有显著差异(P＞0.05)。
4种粗料发酵液乙酸/丙酸和TVFA浓度均以玉米秸秆最低，分别比水稻秸秆、苜蓿和宽叶雀稗低6.48%、7.10%、9.88%和111.55%、72.95%、43.80%。
| 表5 C3和C4植物粗料及底物精粗比对体外发酵液VFA浓度的影响 Table 5 Effects of C3 and C4 plants of roughage and C:R of substrate on VFA concentrations of in vitro fermentation fluid |
由表6可知，C3和C4植物粗料对有IVDMD极显著影响(P＜0.01)，对IVNDFD有显著影响(P＜0.05)，底物精粗比对IVDMD有极显著影响(P＜0.01)，二者对IVDMD和IVNDFD不存在显著的交互作用(P>0.05)。
不同C3和C4植物粗料间比较，苜蓿IVDMD极显著高于其他粗料(P＜0.01)，水稻秸秆极显著高于玉米秸秆和宽叶雀稗(P＜0.01)，但这2者之间没有显著差异(P＞0.05)；水稻秸秆IVNDFD显著低于玉米秸秆(P＜0.05)，而与苜蓿和宽叶雀稗没有显著差异(P＞0.05)；且玉米秸秆和宽叶雀稗亦没有显著差异(P＞0.05)。
不同精粗比间比较，精粗比为40:60时宽叶雀稗IVDMD显著低于精粗比为50:50(P＜0.05)。
底物IVDMD和IVNDFD均以水稻秸秆最低，分别比苜蓿、玉米秸秆和宽叶雀稗低18.84%、4.37%、3.84%和9.52%、17.08%、14.17%。 | 表6 C3和C4植物粗料及底物精粗比对IVDMD和IVNDFD的影响 Table 6 Effects of C3 and C4 plants of roughage and C:R of substrate on IVDMD and IVNDFD |
体外发酵产气量是评定反刍动物瘤胃发酵的重要依据，一定程度上可以反映发酵底物为瘤胃微生物所利用的程度[15]。本试验结果显示，不同精粗比水平下苜蓿体外发酵理论最大产气量极显著高于水稻秸秆、玉米秸秆和宽叶雀稗，这与苜蓿IVDMD极显著高于其余3种底物(表6)有关。Menke等[10]研究指出，产气量与有机物消化率正相关。很多研究结果显示，随着发酵底物精粗比的增加，体外产气量呈增加趋势[16, 17, 18]，这可能是因为随着培养底物中有利于产甲烷菌生长的营养物质的增加，真菌数量逐渐降低直到消失，细菌数量逐渐上升，因此产气量也随之增加。娜仁花等[19]研究发现，发酵底物精粗比为40:60时各时间点累积产气量均高于精粗比为60:40的发酵底物，这与本试验水稻秸秆和宽叶雀稗的结果相吻合。在本试验条件下，水稻秸秆和宽叶雀稗为底物粗料时，体外发酵累积产气量并未随精粗比的增加呈增加趋势，这可能与不同粗料类型、粗料中碳水化合物结构以及精料与不同粗料组合效应相关性等之间的差异有关。
初期产气速率表示体外发酵0~12 h的产气速率，本试验中，不同精粗比条件下，C3植物初期产气速率显著低于C4植物，这可能是由于C3植物在通过光合作用固定CO2的过程中，快速发酵碳水化合物含量低于C4植物，从而导致发酵初期其发酵速率低于C4植物。随着精粗比的增加，苜蓿初期产气速率显著降低，这可能是由于随着发酵时间的延长，作为主要发酵产气来源物质的碳水化合物及蛋白质被大量消耗，发酵速率开始下降。精粗比为50:50时，宽叶雀稗初期产气速率显著高于精粗比40:60，表明发酵底物精粗比的增加，宽叶雀稗组发酵初期产气速率显著增加。水稻秸秆达1/2理论最大产气量时间极显著高于苜蓿、玉米秸秆和宽叶雀稗，这可能与水稻秸秆初期产气速率极显著低于其余3组底物有关。随着精粗比的增加，水稻秸秆达1/2理论最大产气量时间呈显著降低趋势，表明提高发酵底物精粗比，能加快水稻秸秆发酵前期的降解速率，增加产气量。
CH4是饲粮中碳水化合物在反刍动物瘤胃内厌氧发酵不可避免的产物，其自然产生过程有特定的生物学调控机制，饲粮类型是影响其排放量的关键因子[20]。郑文思等[21]研究发现，体外发酵CH4产量与饲粮非结构性碳水化合物/中性洗涤纤维存在极显著的正相关关系。刘树军[20]研究发现，玉米秸秆体外发酵CH4产量显著高于苜蓿。张元庆等[22]研究结果表明，来源于玉米秸秆的细胞壁体外发酵CH4显著高于来源于苜蓿的细胞壁。本试验结果显示，不同精粗比条件下，C3和C4植物发酵底物粗料为秸秆类(水稻秸秆或玉米秸秆)时，CH4产量均极显著低于粗料为牧草类(苜蓿或宽叶雀稗)时，这可能是由于本试验条件下选用的是不同精粗比发酵底物，而并非单一饲草(秸秆类或牧草类)或植物细胞壁。此外，韩继福等[23]研究结果表明，肉牛单位代谢体重CH4产量随饲粮精粗比提高而降低。Chandramoni等[24]研究发现，绵羊CH4产量随饲粮精粗比提高亦下降。本试验条件下，发酵底物为苜蓿和玉米秸秆时，CH4产量随发酵底物精粗比增加呈显著增加趋势，而水稻秸秆和宽叶雀稗并未体现这一趋势，这可能是各发酵底物之间粗蛋白质、中性洗涤纤维、有机物等营养成分之间的差异所造成的；此外，体内体外试验条件下，饲粮或发酵底物各组份在瘤胃或发酵系统内发酵时间的差异也可能导致体内体外试验CH4产量结果产生差异。
3.2 C3和C4植物粗料及底物精粗比对瘤胃体外发酵特性的影响瘤胃液pH系评价瘤胃发酵状况的基本指标，决定着瘤胃微生物对底物的发酵利用效率[25]。维持正常的瘤胃液pH是保证瘤胃正常发酵的必要前提，通常认为正常的瘤胃液pH变化范围是5.5~7.5，当pH低于6.0时，瘤胃中纤维降解菌和原虫的生长受到抑制[26]。本试验结果显示，C3植物来源发酵底物(水稻秸秆和苜蓿)瘤胃液pH极显著高于C4植物来源发酵底物(玉米秸秆和宽叶雀稗)，这可能与C3和C4植物光合作用途径的差异导致其碳水化合物含量、结构及其组成产生差异，进而导致碳水化合物发酵产物存在组合差异有关。此外，本试验发酵液pH(6.53~6.71)均在瘤胃正常pH范围之内，且没有显著差异，表明C3和C4植物来源发酵底物对于调控瘤胃稳衡均具有积极意义。
NH3-N是瘤胃内饲料肽、氨基酸、蛋白质、尿素、氨化物及其他非蛋白氮化合物分解的终产物，同时也是瘤胃微生物合成蛋白质的主要氮源，瘤胃中约50%的细菌以NH3-N作唯一氮源就可生长，26%的细菌对NH3-N是绝对必需的[27]，保持瘤胃内合适NH3-N浓度是保证微生物蛋白质合成的首要条件。瘤胃液NH3-N浓度在一定程度上反映出特定饲粮条件下蛋白质降解与合成间的平衡状态[28]。瘤胃液最佳NH3-N浓度范围是0.35~29 mg/dL[29]。本试验条件下，苜蓿(C3植物)NH3-N浓度最高，宽叶雀稗(C4植物)最低，这可能主要是由C3和C4植物来源各发酵底物之间粗蛋白质含量及其组份的差异，进而影响发酵终产物和瘤胃微生物蛋白质合成量之间的差异所导致的。同时，本试验结果还显示，C3植物(玉米秸秆和宽叶雀稗)瘤胃液NH3-N浓度均极显著高于C4植物(水稻秸秆和苜蓿)，表明C4植物来源发酵底物(玉米秸秆和宽叶雀稗)有利于改善瘤胃内环境，进而促进瘤胃微生物生长繁殖及其对NH3-N的利用效率，使瘤胃NH3-N向微生物氮转化。此外，本试验发现，C3和C4植物发酵底物所产生的NH3-N浓度并未受发酵底物精粗比的影响，这与张爱忠等[30]研究结果一致。
瘤胃微生物能够将粗纤维、淀粉和可溶性糖等碳水化合物首先转化成丙酮酸，然后丙酮酸通过不同的代谢途径生成不同的VFA，发挥给动物机体提供能量的作用。研究表明，瘤胃产生的VFA能提供至少50%的总消化能[31]，也有研究者证实VFA能提供反刍动物总能量需要的70%~80%[32]。本试验发现，除异丁酸外，C3植物来源发酵底物其余各单个VFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸)、TVFA浓度、乙酸/丙酸均高于C4植物来源发酵底物，这可能是C3和C4植物来源发酵底物纤维物质含量及其组成、淀粉含量等碳水化合物之间的差异，进而通过影响微生物活动或微生物酶活性改变发酵模式所导致的。王吉峰等[33]研究发现，随着饲粮中精粗比的增加，奶牛瘤胃乙酸/丙酸下降。李亚学等[34]研究结果显示，随着发酵底物中精粗比的增加，湖羊瘤胃体外发酵乙酸/丙酸显著下降。本试验结果显示，发酵底物粗料为牧草类(苜蓿或宽叶雀稗)时，随着发酵底物精粗比的增加，瘤胃体外发酵乙酸/丙酸下降，这与上述研究结果一致。但是，当发酵底物粗料为秸秆类(水稻秸秆或玉米秸秆)时，瘤胃发酵乙酸/丙酸随发酵底物精粗比增加而提高，这可能与牧草类和秸秆类粗料品质上的差异导致瘤胃发酵模式发生改变有关。
3.3 C3和C4植物粗料及底物精粗比对体外营养物质降解率的影响IVDMD体现了发酵底物在发酵体系中被微生物降解的程度。本试验不同精粗比条件下，以C3植物来源发酵底物中粗料为苜蓿时最高，且极显著高于水稻秸秆和C4植物来源发酵底物(玉米秸秆和宽叶雀稗)，这可能主要是由于各发酵底物中苜蓿蛋白质及其组分中的瘤胃可降解蛋白质(RDP)含量最高，这与Griswold等[35]研究结果一致。
随着精粗比的增加，反刍动物IVDMD随之提高。王加启等[36]研究结果证实，饲粮中精粗比降低时，饲粮内非结构性碳水化合物含量减少，结构性碳水化合物比例增加，饲粮在瘤胃内降解速率减慢，导致降解率下降。本试验结果显示，随着发酵底物中精粗比的增加，IVDMD降解率呈上升趋势，这与上述研究结果一致。
4 结 论① 以苜蓿为粗料、精粗比50:50时，底物体外降解率最高，且有利于维持瘤胃内环境相对稳定；但CH4产量也最高。
② 选用水稻秸秆为粗料、精粗比为45:55时，底物降解率最低，但CH4产量也最低，有利于减少反刍动物甲烷排放，促进草食家畜产业健康可持续发展。
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